酶工程实验报告三( 纤维素酶最适反应pH值的测定)

1、 实验目的
实验方式 小组合作
小组成员 XX XX XX XX
掌握酶最适 pH 值的测定方法及原理。
2、 实验仪器、试剂和溶液：
A 2 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅(4台)、试管架（1个）、1ml移液管（1 根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、 1000ml容量瓶（1个)、洗耳球（1个）、标签（若干）等。
本科学生实验报告
学号 104120440 姓 名
孙永升
学院 生命科学学院 专业、班级 10 生物技术
实验课程名称
酶 工 程 <实验>
教师及职称
李俊俊 <讲师>
开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期
填报时间 2013 年 月 24 日
云南师范大学教务处编印
1
实验名称 实验三 纤维素酶最适反应 pH 值的测定
5 实验处理
A 5 葡萄糖标准曲线如 图 1：
OD540nm值
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
y = 0.7023x - 0.0747
葡萄糖标准曲线
R2 = 0.9992
系列1 线性 (系列1)
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
葡萄糖浓度(mg/ml)
图 1 标准曲线 葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程 y=kx-0.0747，k=0.7023， R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。式中 Y 表示表示测定的吸光度（OD）值，X 表示还原糖的浓度, 0.0747 表示补偿参数。
pH 与酶活性关系的测定是在其它条件（如底物浓度、酶浓度、反应温度等）恒定的 最适情况下，选用一系列变化的 pH 环境中进行初速度测定，其图形一般为钟形曲线。
B 3 实验流程: 酶液的稀释（不同 pH 所用酶液用对应 pH 缓冲液稀释）
↓
不同 pH 下（55℃）水浴 30min
↓
沸水浴 10min
↓
终的酶活力测定值。
5
C 5 实验数据与结果处理：如表二：
pH（温度 55℃）
酶液稀释倍数
OD540 值
3.0
500
2.423
3.5
500
2.504
4.0
2×103
1.203
4.5
104
0.550
5.0
104
0.431
5.5
104
0.411
6.0
104
0.400
6.5
104
0.313
7.0
5×103
6、实验小结
①掌握了纤维酶活最适 pH 的测定方法，了解纤维素酶一般的最适反应 pH 范围。 ②测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH 等。量取液体时精确，如
缓冲液、酶液、DNS 试剂等。 ③对反应后的实验结果认真仔细观察做好记录。养成科学分析问题的习惯。
改进：为精确结果应在可能情况下：各个 pH 测定应由同一个人完成，减少差异。
B 5 纤维素酶酶活力（U/g）=(K×平均 OD+b)×N/(0.5×0.5)式中： K——标准曲线的斜率;b——标准曲线的截距; N——试样的总稀释倍数;0.5— —反应酶液的体积，mL;0.5——反应时间，h。
酶活力的计算值保留 3 位有效数字 注意：同一试样两个平行测定值的相对偏差在±8%以内，二者的平均值为最
0.017
7.5
2×103
0.115
8.0
500
0.667
8.5
500
0.299
9.0
500
0.243
9.5
500
0.223
10.0
500
0.024
（注：本实验酶反应设定温度 55℃） 表二
D 5 SPSS 统计分析作图： 图二
纤维素酶酶活力（U/g） 3552.746 3666.518 7356.535 18438.600 15095.652 14533.812 14224.800 11780.796 1732.782 1243.716 1086.268 569.375 490.718 462.626 183.110
黄燕华等（2004）1 纤维素酶的酶活测定最适为 pH 4.8, 最适温度为 50℃ , 最适 反应时间为 60min,同时需要设置以有底物无酶或有酶无底物的空白作为对照。谭占 仙（2009）2 在研究 pH 值、温度对纤维素酶活力的影响时测定结果为：酸性纤维素 酶最适宜的 pH 值为 4.85，温度为 60℃或 65℃碱性纤维素酶最适宜的 pH 值为 6.0， 温度为 60℃或 65℃；张永凤等（2007）3 用 DNS 法测定酸性纤维素酶活力。分析了 酶促反应时间、pH、酶液稀释度、温度对酶活力测定结果的影响。研究表明, 该纤 维素酶酶促反应的最适条件为: 酶促反应时间为 30 min, 最适 pH 为 5.0, 酶液稀释至 130 倍, 最适温度 50℃。最适条件下的酶活力为 1685 IU/g，如图三。其测定结果和 本实验相似，设置 pH 范围 2.0~7.0 间。由于酶促反应影响因素的复杂与综合性，因 此测定结果存在一定偏差。就总体而言纤维素酶最适 pH 应该在 4.5~5.0（酸性环境 下）这个范围。只能得出大概范围值，而非一个准确的值。实验中各个测定结果受 个人操作因素影响，使得结果存在误差，为精确结果应在可能情况下：各个 pH 测定 应由同一个人完成，减少差异。
B 4、操作步骤: （1）取3支25mL刻度具塞试管（1支做空白管，2支做样品管）。 （2）分别向3支管中准确加入不同pH值的CMC-Na溶液2.00mL 注意：加入CMC-Na溶液时应缓慢，不可粘在试管壁上。 （3）分别准确加入稀释好的待测酶液0.5mL于2支样品管中（空白管不加） 用涡旋混合器混匀。（ 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可顺 着试管壁加入） （4）将3支试管同时置于酶反应最适温度水浴中，准确计时，反应30min， 取出。 （5）迅速准确地向3支管中加入3mLDNA试剂（加液顺序和加酶液顺序相同以保证 反应时间相同），振荡摇匀，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL， 摇匀。将3支管同时放入沸水浴中，准确计时，煮沸10min取出，迅速冷却至 室温，用水定容至25mL。 （6）以空白管调零，在分光光度计540nm波长下，用1cm比色皿，分别测量2支样 品管中样液的吸光度OD值，分别记为ODE1、ODE2 ，取二者平均值。带入 标准曲线方程计算酶活力。
8
7 实验思考题：
纤维素酶的 pH 耐受性如何测定？ 答：①首先在温度选定下测定（如本实验设定为 55℃）出纤维素酶的最适反应 pH， 本实验已做； ②将待测样品液（纤维素酶液和底物混合液）5.5 ml 分别放置在 pH：3.0、3.5、4.0、 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 下保温 30min。再将待测 样品放置在最适反应 pH 下，按照本次试验方法测不同 pH 环境下反应的后的 纤维素酶活力。绘制 pH 相对活力曲线图。
[3] 张 永 凤 , 卢 红 梅 , 黄 永 光 等 . 酸 性 纤 维 素 酶 酶 活 力 的 测 定 [J]. 酿 酒 科 技 , 2007 ,12 :99~101.
指导老师评语及得分：
签名：
2013 年 05 月 日
9
D 4 实验注意事项
4
① 反应温度准确，酶液准确稀释。不同 pH 所用酶液用对应 pH 缓冲液稀释 ②试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； ③移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。 ④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理； ⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
8 参考文献：
[1] 黄燕华, 冯定远.DNS 法测定纤维素酶活性的适宜反应温度 pH 值和反应时间的研究 [Z]. 中国畜牧兽医学会动物营养学分会—第九届学术研讨会论文集，中国重庆, 2004-08 .
[2] 谭占仙. 研究 pH 值、温度对纤维素酶活力的影响[J]. 黑龙江科技信息，2009，6： 10.
3、实验原理及实验流程或装置示意图：
A 3原理: pH 值对酶反应速度有显著影响。每一种酶都有一个特定的最适反应 pH 值，在
2
此 pH 值下酶反应速度最快，而在此 pH 值两侧酶反应速度都会受到影响而放缓。因为酶 蛋白是两性电解质，具有许多可解离基团，在不同的酸碱环境中这些基团的解离状态不 同，所带电荷不同，而他们的解离状态对保持酶的结构，底物与酶的结合能力以及催化 能力都有重要作用。表现酶最大活性的 pH 值即为该酶的最适 pH 值。不同的酶其最适 pH 值不同。
B 2 试剂和溶液 ① DNS试剂(CMCA-DNS )：称取 3,5 一二硝基水杨酸(10士0.1) g，置于约600mL水中， 逐渐加入氢氧化钠log，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲 钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室 温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使 用。 ② 乙酸-乙酸钠缓冲液，0.01mol/L ③ CMC-Na溶液（底物溶液） ④ 纤维素酶液(pH4 .8 和 pH6 .0)。
酸钠缓冲液准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差落在0.2—0.5范围内，不在此 范围内，酶液要进行重新稀释），待测。
本实验在室温下 55℃下选择不同的 pH 值来测定酶活力，以找出在此条件下的最适 pH 值。
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
pH 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 表一