疏水作用色谱中流动相组成对溶质保留行为的影响

疏水层析填料

2008-6 Volume 8 疏水层析填料 疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，Cellfine TM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。 三种疏水层析填料的疏水性差异（左图） 色谱柱：8.2 x 150 mm 柱体积：8 ml 流动相：2.0 – 0.0M Ammonium Sulfate in 0.01M phosphate, pH 7.0 流速：1.32 ml/min 样品：5 mg/3 ml– 100 μl 2008-6 Volume 8 Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱） Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。 聚合物基材氨基柱与硅胶基材氨 基柱的柱寿命比较 左图为Asahipak NH2P色谱 柱与硅胶基材氨基柱的寿命对 比试验。结果显示：随着使用时 间的延长，硅胶基材氨基柱对单 糖、二糖的保留快速下降，其原 因应是硅胶基材氨基柱的氨基 降解所致。 色谱柱：Asahipak NH2P-50 4E,

亲水作用色谱柱的基本性能评价及应用举例

新型亲水作用色谱柱TSKgel NH 2-100 3μm TSK l NH1003 的基本性能评价及应用举例 东曹达（上海）贸易有限公司技术服务中心 东曹公司生命科学事业部

亲水作用色谱模式的特点 亲水作用色谱(HILIC)的分离原理 利用样品在流动相和固定相中的分配平衡，样品中的极性官能团与固定相表面进行亲水相互作用 特点 1)固定相一般为极性官能团（如氨基、酰胺基、羟基等）修饰硅胶或聚合物 固定相般为极性官能团（如氨基酰胺基羟基等）修饰硅胶或聚合物2)流动相类似反相的流动相，一般使用比固定相极性低的溶液。如：乙腈/水≥7/3等 3)极性化合物保留强，适合多肽、糖、核酸等低分子、高极性化合物的分离极性化合物保留强适合多肽糖核酸等低分子高极性化合物的分离4)疏水性杂质不积累，可以最大程度避免色谱柱损坏。

东曹HILIC色谱柱 １．TSKgel Amide80（5μm，3μm） TSKgel Amide-80 －硅胶基质（酰胺基型）HILIC色谱柱 －极性化合物保留强、分离性能强，但还原糖分离发生峰分裂现象２．TSKgel NH2-60(5μm) －硅胶基质（氨基型）HILIC色谱柱 －适合糖类化合物分离，但化学稳定性不高 适合糖类化合物分离但化学稳定性不高 新型HILIC色谱柱：TSKgel NH2-100 3 μm －氨基型色谱柱耐久性大幅度提高 －与Amide-80具有相同或更高的保留性能和更高的分离性能

TSKgel NH-1003μm TSKgel NH2-100 3μm色谱柱及填料 基质硅胶 平均粒径3μm 孔径10nm 比表面积450m2/g 表面官能团氨基 封端处理TMS 封端 色谱柱 2.0mm I.D. x 15cm 4.6mm I.D. x 15cm 保护柱 2.0mm I.D. x 1.0cm 3.2mm I.D. x 1.5cm

完整版第九节疏水作用色谱

第九节疏水作用色谱 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。 关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC 已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。 由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。 一、疏水作用色谱基本原理 (一) 疏水作用 疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。 根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。而根据热力学公式 △G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。在疏水作用发生时，疏水性溶质分子相互靠近，疏水表面积减少，相当一部分水分子从有序结构回到溶液相中导致熵值增加(△S>0)，引入了负的△G，从而是由因此非极性分子间的疏水作用不同于其他的化学键，而在热力学上有利。．自由能驱动的疏水分子相互聚集以减少其在水相中表面积的特殊作用。 (二) 生物分子的疏水性 对于小分子物质，根据其极性的人小可以分为亲水性分子和疏水性分子，一般来说亲水性的小分子是很难与HIC介质发生作用的。但对于疏水作用色谱的主要对象生物大分子如蛋白质而言，其亲水性或疏水性是相对的，即使是亲水性分子也会有局部疏水的区域，从而可能与HIC介质发生疏水作用，因此能够根据其疏水性的相对强弱不同进行分离。 以蛋白质为例，球状蛋白质在形成高级结构时，总体趋势是将疏水性氨基酸残基包裹在蛋白质分子内部而将亲水性氨基酸残基分布在分子表面。但实际上真正能完全包裹在分子内部的氨基酸侧链仅仅占总氨基酸侧链数的20%左右，其余均部分或完全暴露在分子表面。蛋白质表面的疏水性是由暴露在表面的疏水性氨基酸的数量和种类，以及部分肽链骨架的疏水性所决定的。因而可以认为蛋白质分子表面含有很多分散在亲水区域内的疏水区(疏水补丁)，它们在HIC过程中起着重要的作用。然而研究表明不同的球状蛋白质的疏水表面占分子表面的比例差

疏水作用层析

疏水作用层析 实验概要 通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。 实验原理 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。 溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。 Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。 主要试剂 1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.0 3. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4

4. 蛋白质样品溶于溶液B 主要设备 层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计 实验步骤 1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。 2. 装柱：将层析柱洗净，固定在铁架台上，层析柱下口用螺旋夹夹紧。加入溶液B，打开下口让溶液流出，排出残留气泡，柱中保留高度约2厘米的溶液。将准备好的层析介质轻轻搅匀，用玻璃棒引流，沿层析柱内壁将层析介质缓慢加进柱中。等到层析介质在柱中沉积高度超过1厘米时，打开下口。柱床高度达到6-8厘米时关闭下口，装柱尽可能一次装完，避免出现界面。 3. 柱平衡：用溶液B平衡1-2个床体积。注意始终保持层析介质处于溶液中，不要干柱。 4. 上样：取样品加入平衡好的层析柱，并收集层析柱下口流出组分，调节流速为1ml/min,每管3ml。 5. 洗涤：用溶液B洗涤1个床体积，洗去上样不吸附组分。收集层析柱下口流出成分。 6. 洗脱与收集：梯度混合器左面装入250ml溶液A，右面装入250ml溶液B。按照 100%-0%1.7M (NH4)2SO4梯度洗脱500ml，收集洗脱液。 7. 检测：取各收集管样品，280nm处测定紫外吸收。 8. 疏水层析介质清洗与保存：层析介质先用水清洗，然后用0.5MNaOH洗脱，最后用水洗至中性。处理好的层析介质放在20%乙醇中，4℃保存。 9. 以各个收集管的管号为横坐标，280nm处紫外吸收值为纵坐标作图，得到洗脱曲线。分析实验结果并讨论。

色谱术语

色谱图 chromatogram 色谱峰 chromatographic peak 峰底 peak base 峰高 h，peak height 峰宽 W，peak width 半高峰宽 Wh/2，peak width at half height 峰面积 A，peak area 拖尾峰 tailing area 前伸峰 leading area 假峰 ghost peak 畸峰 distorted peak 反峰 negative peak 拐点 inflection point 原点 origin 斑点 spot 区带 zone 复班 multiple spot 区带脱尾 zone tailing 基线 base line 基线漂移 baseline drift 基线噪声 N，baseline noise 统计矩 moment 一阶原点矩 γ1，first origin moment 二阶中心矩 μ2，second central moment 三阶中心矩 μ3，third central moment 液相色谱法 liquid chromatography，LC 液液色谱法 liquid liquid chromatography，LLC 液固色谱法 liquid solid chromatography，LSC

正相液相色谱法 normal phase liquid chromatography 反相液相色谱法 reversed phase liquid chromatography，RPLC 柱液相色谱法 liquid column chromatography 高效液相色谱法 high performance liquid chromatography，HPLC 尺寸排除色谱法 size exclusion chromatography，SEC 凝胶过滤色谱法 gel filtration chromatography 凝胶渗透色谱法 gel permeation chromatography，GPC 亲和色谱法 affinity chromatography 离子交换色谱法 ion exchange chromatography，IEC 离子色谱法 ion chromatography 离子抑制色谱法 ion suppression chromatography 离子对色谱法 ion pair chromatography 疏水作用色谱法 hydrophobic interaction chromatography 制备液相色谱法 preparative liquid chromatography 平面色谱法 planar chromatography 纸色谱法 paper chromatography 薄层色谱法 thin layer chromatography，TLC 高效薄层色谱法 high performance thin layer chromatography，HPTLC 浸渍薄层色谱法 impregnated thin layer chromatography 凝胶薄层色谱法 gel thin layer chromatography 离子交换薄层色谱法 ion exchange thin layer chromatography 制备薄层色谱法 preparative thin layer chromatography 薄层棒色谱法 thin layer rod chromatography 液相色谱仪 liquid chromatograph 制备液相色谱仪 preparative liquid chromatograph 凝胶渗透色谱仪 gel permeation chromatograph 涂布器 spreader

色谱术语中英对照

1、气相色谱法（GC）—gas chromatography用气体做为流动相的色法。 2、气液色谱法（GLC）—gas liquid chromatography 将固定液涂在载体上作为固定相的气相色谱法。 3、气固色谱法（GSC）—gas solid chromatography 用固体（一般指吸附剂）作固定相的气相色谱法。 4、程序升温气相色谱法—programmed temperature gas chromatography 色谱柱按照预定的程序连续地或分阶段地进升温的气相色谱法。 5、反应气相色谱法—reaction gas chromatography 试样以过色谱前、后的反应区进行化学反应的气相色谱法。 6、裂解气相色谱法—pyrolysis gas chromatography 试样经过高温、激光、电弧等途径，裂解为较小分子后进入色谱柱的气相色谱法。 7、顶空报相色谱法—haed （应为head -编者注）space gas chromatography d在密闭的容器中与液体（或）固体）试样处于势力学平衡（应为热力学平衡 -编者注）状态的气相组分，是间接测定试样中挥发性组分的一种方法。 8、毛细管气相色谱法—capillary gas chromatography 使用具有高分离效能的毛细管柱的气相色谱法。 9、多维气相色谱法—multidimensional gas chromatography 将两个或多个色谱柱组合，通过切换，可进行正吹、反吹或切割等的气相色谱法。 10、制备气相色谱法—preparative gas chromatography 用能处理较大量试样的色谱系统，进行分离、切割和收集组分，以提纯化全物的气相色谱法。 11、色谱柱：chromatographic column内有固定相用以分离混合组分的柱管。 12、填充柱：packed cklumn （应为column-编者注）填充了固定相的色谱柱。 13、微填充柱：micro-packed column填充了微粒固定相的内径一般为0.5-1mm的色谱柱。 14、毛细管柱：capillary column 内径一般为0.1—0.5mm的色谱柱。 15、空心柱：open tubular column 内壁上有固定相的开口毛细管柱。 16、涂壁空心柱（WCOT）：wall –coated open tubular column 内壁上直接涂渍固定液的空心柱。 17、多孔层空心柱（PLOT）：porus –layer open tubular column 内壁上有多层孔的固定相的空心柱。 18、涂载体空心柱（SCOT）：support –coated open tubular column 内壁上沉积载体后涂渍固定液的空心柱。 19、填充毛细管柱：packed capillary column 将载体或吸附剂疏松地装入玻璃管中，然后拉制成内径一般为0.25—0.5mm的毛细管柱。 20、分流器：splitter 按一定比例将气流分成两部分的部件。 21、进样器：sample injector 能定量和瞬间地将度样注入色谱系统的器件。通常指进样阀或注射器。 22、汽化室：vaporizer 使试样瞬间汽化并预热载气的部件。 23、检测器：detector 能检测色谱柱流出组分及其量的变化的器件。 24、浓度敏感型检测器：concnetration sensitive detector 响应值取决于组分浓度的检测器。 25、质量敏感型检测器：mass(flow rate)sensotive detector. 响应值取决于组分质量流量的检测器。 26、积分型检测器：integral detector 响应值取决于组分累积量的检测器。

疏水色谱的原理和应用

疏水色谱的原理和应用 疏水色谱是利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同，用流动相洗脱时，各组分迁移速度不同而达到分离的目的。流动相一般为pH6-8的盐水溶液，具有对蛋白质的回收率高，蛋白质变性可能性小等优势。由于流动相中不使用有机溶剂，也有利于蛋白质保持固有的活性。 疏水作用色谱是在高离子强度的条件下，蛋白质溶解度降低，易吸附在中等疏水性的填料表面。随着离子强度的降低，蛋白质的溶解度增加，逐步从柱子上洗脱下来。该法具有高分辨率及保持蛋白质生物活性的特点。 疏水作用色谱的固定相表面为弱疏水性基团，它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而流动相为高离子浓度的盐溶液。蛋白质分子在这样的固定相和流动相中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先流出。在这样的高盐水溶液中，蛋白质不会失活。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、流动相的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同，因此有可能通过改变固定相的极性和流动相的组成使蛋白质得到分离。 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品。目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。 1

(分析化学)亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用

研究报告DOI :10.3724/SP.J.1096.2014.30310亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用江静1,2　应万涛*2　钱小红*2 1(中国人民解放军总医院,军医进修学院,北京100039)2(蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,解放军医学院,北京102206)摘　要　蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用三由于技术条件的限制,传统的糖蛋白分析方法中,通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构,而忽略了蛋白质与糖链的连接关系三本研究旨在以完整糖肽作为检测对象,对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析三采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化,联合生物质谱中碰撞诱导解离(CID)二高能诱导解离(HCD)二电子转移解离(ETD)等裂解模式,对完整糖肽的糖基化位点二糖链结构二肽段序列等进行全方面的解析三结果表明,亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽,采用30%CID 能量,主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;采用25%HCD 能量,在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子;ETD 保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息三本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式,为完整糖肽的结构解析提供了一种快速二有效的研究方案三关键词　亲水作用色谱;串联质谱;完整糖肽;碰撞诱导解离;高能诱导解离;电子转移解离　2013?06?07收稿;2013?08?05接受本文系国家高技术研究发展计划(No.2012AA020203)二国际科技合作项目(No.2011DFB30370)二北京市科技新星计划(No.Z121107002512014)资助*E?mail:yingwtll@https://www.360docs.net/doc/483039608.html,,qianxh1@https://www.360docs.net/doc/483039608.html, 1　引　言 蛋白质的糖基化修饰是生物体内普遍存在的一种重要翻译后修饰方式[1,2],但其研究面临很多挑战三糖基化修饰具有多样性三糖基化修饰没有任何模板[3],而是由200多种糖基转移酶调控,同一蛋白质的不同位点的修饰水平不一,同一位点所携带的糖链也存在多种结构,这给分析技术和软件工具带来了巨大挑战;目前完整糖肽的分析手段有限,主要以质谱分析为主,但由于糖肽修饰的微不均一性,及在质谱中离子化困难二碎裂情况复杂等特点,严重制约了完整糖肽的富集和质谱分析技术的发展三2012年,Doerr 等[4]总结了糖蛋白质结构解析的经典研究手段,并指出主要的研究方法是先将糖链从蛋白上释放,然后分别对两者进行解析,这导致了蛋白与糖链之间联系的缺失三聚糖结构解析[5],可以解析大量糖链结构,却忽视了糖链的来源;蛋白部分研究[6],可以得到明确的蛋白序列及大规模糖基化位点,却丢失了糖链信息三Nakano 等[7]研究发现,特异位点的糖基化修饰影响生物学功能,这表明位点特异性水平的糖基化修饰研究对进一步阐释糖蛋白质的生理功能及其在病理过程中的变化具有重要意义三因此,开发完整糖肽水平的研究方法,保留蛋白质与聚糖之间的连接,已成为当前的研究热点三 完整糖肽的复杂结构对分析方法的制约,需要从富集和鉴定两方面解决三首先是由不均一性导致的糖肽低化学计量水平,及其在质谱中离子化效率不高而受非糖肽信号抑制的问题三可以通过完整糖肽的富集与分离,去除非糖肽的干扰而提高糖肽的相对丰度三目前应用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]二二氧化钛[9]二酰肼[10]和亲水相互作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)[11]等三其中,HILIC 是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性,而使糖肽与非糖基化肽段得以分离三HILIC 对不同类型的糖肽没有偏性,且能保持糖链结构的完整性,适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术三其次,完整糖肽包含肽段和糖链两部分,其结构和连接方式的差异导致两者在串联质谱第42卷 2014年2月 分析化学(FENXI HUAXUE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第2期159~165

疏水层析填料

2008-6V o l u m e8 疏水层析填料 疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图： 填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，Cellfine TM Octyl 对疏水性蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。Cellfine TM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。 三种疏水层析填料的疏水性差异（左图） 色谱柱： x 150 mm 柱体积：8 ml 流动相：– 0.0M

Ammonium Sulfate in 0.01M phosphate, pH 流速： ml/min 样品：5 mg/3 ml–100 μl 2008-6 Volume 8 Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱） Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。 聚合物基材氨基 柱与硅胶 基材氨基 柱的柱寿 命比较 左图为 Asahipak NH2P 色谱柱与硅胶

亲水作用色谱理论简介

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μM。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的PH值。但需要注意的是，C18和C8使用的PH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的PH值会使硅胶溶解，太低的PH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在PH 1.5~10范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法反相色谱法 固定相极性高～中中～低 流动相极性低～中中～高 组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的PH值和离子强度影响。PH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。

亲水作用色谱

亲水作用色谱（HILIC）在体内药物分析中 的研究进展 姓名: 李沙沙学号： 201212282939 专业：药剂导师赵永星

亲水作用色谱（HILIC）在体内药物分析中的研究进展 摘要近年来亲水作用色谱（HILIC）成为色谱领域研究的热点之一。亲水作 用色谱是一种结合亲水固定相与极性有机溶剂-水体系流动相的色谱分离技术，对反相作用色谱中难以保留的极性化合物能够实现有效分离。本文简要介绍了HILIC的分离机制，固定相，联用技术，并综述了其在体内药物分析中的研究进展。 关键词亲水作用色谱；体内药物分析；分离机制；固定相 Hydrophilic interation charomatography and its Research Development in Biopharmaceutical Analysis Abstract Hydrophilic interaction chromatography(HILIC) is popular in the analy- sis of hydrophilic solute in recent years. Hydrophilic interaction chromatography(HI LIC) separation system consists of polar stationary phase and mobile phase with high polar organic solvent content and small portion of water phase. It has been shown to be a powerful tool for separating polar analytes which have poor retention on traditi- onal reversed-phase liquid chromatography.This article briefly reviews concept, me- chanism and stationary phase of HILIC, and its recent Research Development in Biopharmaceutical Analysis. Key words HILIC ; Biopharmaceutical Analysis ; stationary phase ; mechanism 体内药物分析是对体液或组织中药物及其代谢物、生物标记物等进行的定性或定量分析。生物样品成分复杂，因此分析物检测手段的选择成为需要密切关注的问题。反相液相色谱（RPLC）是当前分离分析和分离制备中应用最为广泛的色谱模式，其依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用实现弱极性和中等极性化合物的高效分离。生物基质中含有其他多种亲水性组分，包括内源性物质以及外源性物质，当目标化合物在反相色谱保留较弱时，可能会与这些成分发生共洗脱。对强极性化合物的保留很弱，甚至不保留，因此强极性化合物在上不能得到很好的分离。目前，用来分离强极性化合物的液相色谱方法主要有离子交换色谱法（IEC）、正相色谱法（NPLC）和亲水作用色谱法（HILC）。 亲水作用色谱（HILIC）的概念是由Alpert[1]首次提出，它是指采用极性固定相(如硅胶或衍生硅胶) 和含高浓度极性有机溶剂（如乙腈）和低浓度水溶液流动相的色谱模式，具有和反相色谱正交的选择性所使用的流动相与传统反相色谱相似，弱洗脱剂为有机相，强洗脱剂为水相，可达到与反相色谱相媲美的柱效和

流体动力色谱法和障碍色谱法及其应用概要

流体动力色谱法和障碍色谱法及其应用 [ 11-04-23 15:04:00 ] 作者：李建军刘鹏耿信 笃编辑：studa20 【摘要】介绍了流体动力色谱（HDC）和障碍色谱（SC）及其在生物、化工分离中的研究进展，着重于它们的分离原理、理论发展及二者之间的联系 与转化，引用52篇文献。 【关键词】动力学液相色谱, 流体动力色谱, 障碍色谱，DNA分离，评述 Abstract Hydrodynamic chromatography(HDC) and slalom chromatography(SC) called as dynamic liquid chromatography(DLC) were introduced and reviewed, mainly for the recent development of separation principle, theoretical model, and applications. Fifty two references were cited. Keywords Dynamic liquid chromatography, hydrodynamic chromatography, slalom chromatography, deoxyribonucleic acid separation, review 1 引言 随着生命科学研究的不断深入，液相色谱法(LC)在分离纯化多肽及蛋白质方面的应用也得到了迅速地发展，尽可能提高其分离度已成为LC研究中最重要的课题之一[1,2]。多年来，研究溶质组分的色谱保留行为基本上依据热力学因素，即根据各组分在固定相和流动相中的分配系数的差异实现对组分的分 离，并且假定组分在该二相间的分配或吸附平衡是瞬时完成的。然而，早在 1956年，荷兰学者Van Deemter便提出了色谱过程的动力学理论——速率理论[3]。他将色谱过程视为一个动态的非平衡过程，研究分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响。此后，Giddings等[4]在Van Deemter方程的基础上，提出 了LC的速率方程，即Giddings方程，他们认为溶质在流动相和固定相转移的 过程并不是瞬间达到平衡，实际上组分传质速度是有限的，说明分离中总是存 在着动力学的非平衡过程。液相色谱的分类是依据溶质与固定相之间的作用特征，如电荷作用的离子交换色谱，疏水相互作用的疏水相互作用色谱和反相色谱，亲合作用的亲合色谱及分子大小的尺寸排阻色谱等。本文介绍的流体动力 色谱（hydrodynamic chromatography, HDC）和障碍色谱（slalom chromatography, SC），其溶质均与固定相之间的作用特征无关，或关系甚 小，而主要与流动相的流动特征有关，或是基于动力学因素发展起来的两种新 的色谱方法，二者通称为动力学液相色谱法。目前, 它们已经在测定和分离聚 合物、多肽、DNA和生物大分子方面广泛应用。文献[5]从与SEC 比较的角度简要地介绍了HDC和SC的分离原理及二者之间的不同点。本文详细并系统地说明了HDC和SC的分离原理、模型、理论发展、仪器设备和最新应用，并探讨了HDC与SC之间的联系及相互转化。 2 流体动力色谱（HDC）