大肠杆菌生产制备重组人胰岛素实用工艺
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编 码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型 重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式 存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰 岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常 能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效 表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序 减轻了负担。
确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工艺路线生 产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。
为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第 二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
tac Met
Apr ori
人胰岛素的生产方法
化学转型法制人胰岛素
猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素 与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人 的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种 选择。
上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催 化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B 链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙 酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60% 但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链同时表达法
tac Met
转化
b-Gal
胰岛素如何生产工艺
胰岛素如何生产工艺胰岛素是一种由胰岛细胞分泌的激素，它在体内起着调节血糖水平的重要作用。
胰岛素的生产工艺主要包括以下几个步骤：基因克隆，表达与纯化，结构鉴定，制剂，灭活与包装。
首先，胰岛素的生产过程需要进行基因克隆。
科学家们通过分离人胰岛素基因，将其放入表达载体中。
这样，利用重组DNA技术，可以将人的胰岛素基因导入到大肠杆菌的DNA中，使其具有胰岛素基因的表达能力。
此过程中，需要进行取样，DNA提取，PCR，酶切等分子生物学技术。
接下来，表达与纯化是胰岛素生产过程中的关键步骤。
将经过改造的大肠杆菌进行培养，使其表达出胰岛素。
随后，采用细胞破碎技术，将大肠杆菌破碎，释放出表达的胰岛素。
然后，利用柱层析技术，例如亲和层析、离子交换层析等，对其进行纯化，去除其他的蛋白质等杂质，获得纯净的胰岛素。
结构鉴定是胰岛素生产工艺中的另一个重要步骤。
对纯净的胰岛素样品进行质谱测定、核磁共振等分析技术分析，以确认其结构的完整性和准确性。
制剂阶段是将胰岛素样品进行整理处理，使之具有成品的形态。
这一步骤通常需要利用充填、灌装等技术，将胰岛素制备成注射液、胰岛素笔等形式。
最后，胰岛素的稳定性是需要考虑的因素。
一旦胰岛素被注射或者口服，它很容易受到消化酶的降解而失去活性。
因此，在胰岛素生产工艺中，通常会进行灭活处理和包装。
这些处理可以延长胰岛素的有效期，并保持其高效性。
总而言之，胰岛素的生产工艺包括基因克隆，表达与纯化，结构鉴定，制剂，灭活与包装等多个步骤。
每个步骤都需要利用不同的技术手段进行操作，以确保胰岛素的高效性、纯净性和稳定性。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
《基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究》一、引言基因工程技术的发展为生物医药领域带来了革命性的变革，其中重组DNA 技术作为一种能够改变生物体基因组的技术，为生产重组蛋白素（包括重组人胰岛素）提供了可行性。
本文将从深度和广度两个方面来探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究。
二、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的原理在基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究中，首先需要获取重组人胰岛素的基因序列，然后以质粒或病毒为载体将其转染至大肠杆菌的体内，经过培养和发酵，大肠杆菌体内合成重组人胰岛素，并通过纯化后得到最终的产品。
三、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展1. 基因克隆技术的应用基因克隆技术的应用是基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的关键技术之一。
利用限制酶切剪切 DNA，然后重组连接，将重组的DNA 导入质粒内，再将质粒导入大肠杆菌细胞内，实现外源基因的表达。
2. 基因工程大肠杆菌的选择为了高效地生产重组人胰岛素，研究者需要筛选高产重组蛋白素的大肠杆菌菌株，并进行相关的改造以提高其产量。
3. 发酵工艺的优化发酵工艺的优化对于提高重组人胰岛素的产量至关重要。
包括对培养基成分、厌氧发酵条件、发酵时间等因素的优化。
四、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的意义基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素具有重要的生物医药意义。
大肠杆菌是一种广泛存在于自然界中的细菌，其发酵生产成本低、抗污染能力强，适用于大规模工业化生产。
另重组人胰岛素与天然胰岛素具有相同的生物活性，可以作为治疗糖尿病的药物，在临床上有着重要的应用前景。
五、个人观点和理解基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是基因工程技术的一个重要应用方向，其有着较高的生产效率和较低的成本，为生物医药领域带来了巨大的潜力和机遇。
但是，需要注意的是，基因工程技术在应用过程中也存在一些伦理和社会问题，例如生物安全性、环境影响等方面，需要引起足够的重视。
胰岛素的工艺流程
胰岛素的工艺流程胰岛素是一种重要的蛋白质激素，它在调节血糖水平和促进葡萄糖的利用方面发挥着关键作用。
胰岛素的生产工艺流程需要经过一系列的步骤，包括基因工程、发酵、提取纯化等过程。
本文将详细介绍胰岛素的生产工艺流程及相关的关键技术。
1. 基因工程胰岛素的生产通常采用大肠杆菌或酵母等微生物作为生产宿主。
首先需要构建含有胰岛素基因的重组表达载体，这一步通常通过限制性内切酶切割和连接技术来完成。
将人类胰岛素基因插入到表达载体中，形成重组表达载体。
2. 发酵接下来，将重组表达载体导入到宿主微生物中，利用培养基和适宜的条件进行发酵。
在发酵过程中，微生物会表达出胰岛素蛋白，并将其分泌到培养基中。
发酵过程需要严格控制温度、pH值、氧气供应等因素，以保证胰岛素的高效表达和稳定产量。
3. 提取纯化发酵结束后，需要对培养基进行提取和纯化，以获得纯度较高的胰岛素。
提取过程通常包括细胞破碎、离心、过滤和纯化柱层析等步骤。
通过这些步骤，可以将胰岛素从培养基中分离出来，并去除杂质，得到纯度较高的胰岛素制剂。
4. 结晶和制剂最后，将纯化的胰岛素溶液进行结晶和干燥处理，得到胰岛素晶体粉末。
随后，胰岛素晶体粉末将进行制剂，通常是配制成注射剂或口服制剂，以满足临床使用的需要。
除了上述基本工艺流程外，胰岛素的生产还需要严格的质量控制和检测。
在每个生产步骤中，都需要进行严格的质量控制，以确保胰岛素的纯度、活性和稳定性。
同时，需要进行一系列的检测，包括蛋白质含量、内毒素检测、生物活性测定等，以确保胰岛素符合药品的质量标准。
总之，胰岛素的生产工艺流程涉及基因工程、发酵、提取纯化和制剂等多个环节，需要严格控制和操作。
通过不断的技术创新和工艺优化，胰岛素的生产工艺不断得到改进，为临床治疗糖尿病等疾病提供了可靠的胰岛素制剂。
用大肠杆菌生产人胰岛素的工艺流程
用大肠杆菌生产人胰岛素的工艺流程英文回答：The process of producing human insulin using E. coli involves several key steps in the bioprocessing industry.Firstly, the gene encoding human insulin is inserted into the E. coli bacterial genome. This is typically achieved using recombinant DNA technology, where the gene is cloned into a plasmid vector and then introduced into the bacterial cells.Next, the transformed E. coli cells are cultured in a bioreactor under controlled conditions. This includes providing the necessary nutrients for cell growth and maintaining optimal temperature, pH, and oxygen levels.As the E. coli cells grow and divide, they express the human insulin gene and produce the insulin protein. The protein is then harvested from the cells using variousextraction and purification techniques.Finally, the purified human insulin is formulated into the final product, which can be in the form of injectable solutions or insulin pens for diabetes treatment.This process allows for the large-scale production of human insulin using E. coli as a host organism.中文回答：利用大肠杆菌生产人胰岛素的工艺流程涉及生物加工行业的几个关键步骤。
重组人胰岛素制备工艺
重组人胰岛素制备工艺引言胰岛素是一种由胰腺β细胞分泌的激素，它参与调节葡萄糖代谢，维持血糖水平稳定。
然而，对于许多糖尿病患者，体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗使得血糖控制成为难题。
为了解决这一问题，重组人胰岛素制备工艺应运而生。
本文将详细介绍重组人胰岛素的制备工艺，以及如何通过优化制备工艺提高其产量和质量。
关键词介绍1、重组人胰岛素：是指利用基因工程技术，通过细胞培养或微生物发酵生产的胰岛素。
它具有与天然人胰岛素相同的结构和功能，因此在临床上有广泛的应用。
2、制备：是指通过一系列工艺步骤，从原料中提取或制造出所需物质的过程。
在重组人胰岛素制备中，主要包括基因工程操作、细胞培养、发酵、分离和精制等步骤。
3、工艺：是指实现制备过程的一系列具体方法和操作规程。
工艺的选择和优化直接影响到产品的产量和质量。
重组人胰岛素制备工艺1、酵母菌的筛选：选用适合生产重组人胰岛素的酵母菌种，对其进行筛选和改良，以提高发酵过程中的产量。
2、基因工程操作：将人胰岛素基因插入到酵母菌的染色体或质粒中，确保基因正确表达。
3、发酵：在适宜的营养条件下，利用筛选得到的酵母菌进行发酵生产。
4、分离和精制：通过一系列物理、化学和生物学方法，将重组人胰岛素从发酵液中分离出来，并进行精制和纯化，以得到高纯度的产品。
制备工艺优化1、通过现代实验设计方法和技术，如响应面法和均匀设计法，筛选最佳工艺条件，以提高重组人胰岛素的产量和质量。
2、通过基因工程技术改良酵母菌，增强其生产重组人胰岛素的能力，提高产量。
3、采用先进的分离和精制技术，如高效液相色谱和超滤膜过滤等，进一步提纯产品，提高产品质量。
4、结合计算机模拟技术和实验验证，模拟工艺过程，指导实际生产，优化制备工艺。
重组人胰岛素制备工艺在糖尿病治疗中具有重要意义，本文详细介绍了其制备过程及优化方法。
通过合理选择工艺条件和基因工程改良，可以有效提高重组人胰岛素的产量和质量。
随着科学技术的发展，相信未来制备工艺将进一步优化，为糖尿病患者提供更好的治疗选择。
重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化
重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化一、本文概述本文旨在探讨重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达及其后续的分离纯化过程。
胰岛素作为一种关键的激素，在调节血糖水平中发挥着至关重要的作用。
然而，天然胰岛素的来源有限，且提取成本高昂，因此，通过基因工程技术在大肠杆菌中生产重组人胰岛素成为了一种可行且经济的替代方案。
本文首先介绍了重组人胰岛素的基因克隆和在大肠杆菌中的表达策略，然后详细阐述了胰岛素的分离纯化过程，包括细胞的破碎、蛋白质的提取、层析分离以及胰岛素的纯化等步骤。
本文还讨论了影响胰岛素表达及纯化的关键因素，并提出了优化表达及纯化条件的策略，以期提高重组人胰岛素的产量和纯度，为糖尿病治疗提供更为可靠和经济的药物来源。
二、重组人胰岛素的基因克隆与表达重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达首先依赖于对胰岛素基因的克隆。
基因克隆是生物技术中一项重要的技术，它涉及到从基因组DNA或cDNA中分离出特定的基因，然后将其插入到适当的载体中，以便在大肠杆菌等宿主细胞中进行复制和表达。
目的基因的获取：需要从人源的cDNA文库或基因组DNA中扩增出胰岛素的编码序列。
这通常通过PCR技术实现，需要设计一对特定的引物，它们能够与人胰岛素基因的两端互补结合。
载体的选择：为了在大肠杆菌中表达人胰岛素，需要选择一个合适的表达载体。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
这些载体通常含有启动子、终止子、复制原点和选择标记等元件，以确保目的基因在宿主细胞中的高效表达。
基因的克隆：将目的基因与载体连接后，通过转化技术将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中。
在适当的选择压力下，例如抗生素抗性，只有成功导入重组质粒的细胞才能生长，从而实现了对胰岛素基因的克隆。
表达条件的优化：在大肠杆菌中表达人胰岛素时，需要优化表达条件以获得最高的表达量。
这包括选择合适的培养基、调整培养温度、pH值以及诱导剂的浓度等。
表达产物的分析：通过SDS-PAGE、Western Blot等技术，可以对表达产物进行定性和定量分析，以确认胰岛素基因在大肠杆菌中的成功表达。
人胰岛素的制备
人胰岛素的制备一、获得目的基因从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。
即得到了目的基因。
反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1, 细胞总RNA的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。
2 ，从总RNA中分离mRNA：取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。
70℃水浴（裂解RNA的二级结构），20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。
将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。
（二）mRNA转录合成cDNA第一链cone 第一链的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP （加入放射性同位素利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。
取出置于冰上。
电泳分析，同位素活性测定。
（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链。
PCR法的操作步骤：预变性引物退火引物延伸循环25-35次最后延伸前端引物：✧5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt caccac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’✧后端引物：✧5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’二、组建重组质粒采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。
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1.提取目的基因:
既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离.
2.提取质粒:
使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.
3.基因重组:
取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.
4.将质粒送回大肠杆菌:
再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.
5.胰岛素的产生:
再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!
〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并
初步巩固。
一、基础知识
【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。
2．（记忆）DNA的溶解性特点：
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。
【思考1】据图5－1分析：
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L时溶解度最小；
要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解；
要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L可使DNA析出。
【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。
3．（记忆）DNA的耐受性特点：
蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。
洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。
4．（记忆）DNA的鉴定原理
当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。
在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。
二、实验设计
【活动2】阅读教材P55“实验设计”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）实验材料的选取：选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。
2．（记忆）破碎细胞，获取含DNA的滤液：
鸡血：向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌，用纱布过滤后，收集滤液。
洋葱：向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，用纱布过滤后，收集滤液。
【思考4】在以上实验中，蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA物质。
3．（学会）去除滤液中的杂质：
方案一：30mL滤液→加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液→加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA－NaCl溶解液方案二：30mL滤液→加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10分钟→得DNA滤液方案三：30mL滤液→60～67℃处理→过滤得DNA滤液
【思考5】以上三个方案的原理分别是什么？
方案一原理：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；
方案二原理：蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；
方案三原理：DNA耐高温而蛋白质不耐高温。
【思考6】方案一中：“加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液”的目的是除去不溶（可溶、不溶）于NaCl溶液中的细胞杂质；“加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物”的目的是除去可溶（可溶、不溶）于NaCl溶液中的细胞杂质。
4．（记忆）DNA的析出：
DNA滤液与等体积冷却酒精混合，静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。
5．（记忆）DNA的鉴定：
取2支洁净的试管，编号甲、乙，各加入等量的2mol/L NaCl溶液。
甲中放入少量白色丝状物，使之溶解。
在甲、乙试管中各加4mL二苯胺，混合均匀。
沸水浴5min，观察颜色变化，甲试管呈现蓝色。
三、操作提示
【活动3】（记忆）阅读教材P56“操作提示”和P57“课题延伸”，关注下列注意事项：
1．在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心后除去血浆，以提高细胞悬液浓度。
2．实验中使用塑料烧杯和尼龙布，以免DNA被吸附。
3．玻棒沿同一方向缓慢搅拌（细胞破裂时快速搅拌），玻棒不要碰到烧杯壁。
4．二苯胺试剂要现用现配。
5．为提高DNA纯度，实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等。
【活动4】观看视频：观看“DNA的粗提取与鉴定”视频，体会并学会相关技术方法。
〖课后学习〗
1．尝试从植物组织中提取DNA分子。
2．基础训练册：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。
〖学习要求〗
尝试PCR技术的基本操作，体验PCR技术的分子生物学实验方法；理解PCR技术的原理；讨论PCR技术的应用
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。
一、基础知识
【活动1】阅读教材P58“PCR原理”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似。
【思考1】填写下表：（记忆）细胞内DNA复制条件分析
2．（理解）细胞内DNA的复制
（1）DNA的结构：脱氧核苷酸分子通过3,5－磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化，形成DNA双螺旋结构。
（2）DNA的复制：首先，在解旋酶的作用下，由ATP供能，DNA发生解旋形成两条DNA单链。
其次，在DNA单链的3’端，在RNA聚合酶在作用下，合成RNA 引物。
再次，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’端开始合成DNA子链。
最后，DNA聚合酶将引物切去，并合成空缺处DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来。
3．（记忆）DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。
【思考2】缓冲液相当细胞内的什么成分？核液。
【活动2】阅读教材P59“PCR的反应过程”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）填写PCR反应流程：
2．（理解）PCR反应过程是：在升温至90℃以上时DNA解旋；在降温至50℃左右时引物与DNA单链结合；在升温至72℃左右时合成DNA子链。
二、实验操作
【活动3】阅读教材P62“实验操作”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）在PCR反应体系的配方中，含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。
2．（了解）实验操作步骤：按照PCR反应体系配方配制反应液；将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；将微量离心管放到PCR 仪中；设置PCR仪的工作参数；DNA在PCR仪中大量扩增。
3．（了解）水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃恒温水浴锅中循环处理。
三、操作提示
【活动4】阅读教材P62“操作提示”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）避免外源DNA污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
2．（记忆）将缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。
3．（记忆）每添加一种反应成分，更换一个移液器枪头。
4．（记忆）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
四、结果分析与评价
【活动4】阅读教材P63“结果分析与评价”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）反应液稀释：取2?LPCR反应液，添加98?L蒸馏水。
2．（记忆）分光光度计调零：将100?L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计读数调节为零。
3．（记忆）将100?L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。
4．（记忆）DNA含量计算：DNA含量（?g）＝50×光吸收值×稀释倍数。
【活动4】观看视频：观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段”视频，学会相关技术方法。
〖课后学习〗
1．尝试从植物组织中提取DNA分子。
2．基础训练册：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。