农药登记毒理学细菌回复突变
致突变试验综合分析及评价(毒理学教研室20150507)
第六部分： 19. 以上四种实验方法注意事项有哪些？ 20. 结合以上四个实验结果，对 96%二氯吡啶酸原药的致突变性进行综合评 价。 21. 如仅小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阳性，其余试验结果均为阴性 时，应进一步如何设计试验方案？
讨论方式：①各实验室分成六小组（各实验室组长安排分组） ，每小组同学针对 下述 6 个问题进行讨论，并负责制作其中一个部分的 PPT（独立完成，不重复） 。 ②课堂上从各实验室抽签确定相应组别进行相关内容的 PPT 汇报， 其他同学针对 汇报内容进行提问、 补充和讨论。③课后请学习委员收齐所有小组同学 PPT 交教 研室。 上课时间：5 月 12 日，下周三，4602 教室
表 3 96%二氯吡啶酸原药在 CHL 细胞染色体畸变分析结果 组别 阴性对照 溶剂对照 （DMSO） S9 对照 95%二氯吡 啶酸原药 S9 剂量 （µg/ml） 0 0 0 1250 2500 5000 + + + + + 观 察 细 染色体异 胞 数 常细胞数 （个） （个） 200 11 200 200 200 200 200 200 200 200 200 16 10 17 16 18 15 19 14 16 畸变类型 g 6 8 0 10 6 10 5 9 5 5 b 11 13 10 16 15 15 5 19 11 16 t 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 r 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 m 0 3 0 1 2 3 10 0 3 0 畸变细 其 胞 率 它 （%） 0 5.5 1 0 0 0 0 0 0 0 0 8 5 8.5 8 9 7.5 9.5 7 8
致突变试验综合分析及评价
某单位欲对农药—— 96% 二氯吡啶酸原药，进行致突变试验综合分析及评 价，见相关资料。 现请根据所学知识，查阅资料和文献，思考并讨论以下问题。
卫生毒理复习题
一、单项选择题：（每题1分，共20分）1. 以下对“毒理学发展趋势”的描述，错误的是（A ）。
A. 从高度分化到高度综合B. 从SAR到QSARC. 从现代毒理学到系统毒理学D. 从毒性定量描述到毒理作用机制探讨2. 危险度评定的核心部分是（B ）。
A. 危害识别B. 剂量反应关系评定C. 暴露评定D. 危险度特征分析3. 动物实验中的“3R”原则指（C ）。
A. 替代、减少、节约B. 减少、利用、优化C. 替代、减少、优化D. 减少、利用、节约4. 被誉为职业医学创始人的是（A ）。
A. ParacelsusB. PamazziniC. OrfilaD. Bernard5. LD50的概念是（D ）。
A. 引起半数动物死亡的最大剂量B. 引起半数动物死亡的最小剂量C. 出现半数剂量动物死亡的该试验组剂量D. 能引起一群动物50%死亡的剂量（统计值）6. 阳性对照组经呼吸道给予大鼠CCl4后，大鼠GPT升高，CCl4所引起的GPT改变为（A）。
A. 量反应B. 质反应C. 剂量-效应关系D. 个体反应7.毒性上限参数包括（C ）。
A. 绝对致死剂量、阈剂量、最小致死剂量、半数致死剂量B. 绝对致死剂量、观察到最小有害作用剂量、最大耐受量、半数致死剂量C. 绝对致死剂量、最小致死剂量、最大耐受量、半数致死剂量D. 阈剂量、观察到最小有害作用剂量、最小致死剂量、半数致死剂量8. 能阻止水、电解度及某些水溶性物质通过的皮肤屏障是（B ）。
A. 表皮角质层B. 连接角质层C. 基膜D. 真皮层9. 外源性化合物生物转化酶存在的主要亚细胞结构是（B ）。
A. 线粒体B. 内质网C. 溶酶体D. 细胞膜10. 对乙酰氨基酚在肝脏代谢后绝大部分与（A ）相结合形成复合物，排出体外。
A. 葡萄糖醛酸B. 氨基酸C. 谷胱甘肽D. 硫酸11. 下列卤代烷烃类化合物，毒性最大的是（A ）。
A．CCl4 B. CHCl3 C. CH2Cl2 D.CH3Cl。
农药登记的各类毒性试验要求(下)
化 学品或环境 因素造成遗传 毒性 的机 制主要有 ：
Ｄ Ｎ Ａ损伤 、Ｄ Ｎ Ａ修 复与 突变 、整 倍体 和非 整倍体 的形 Ｒ ｅ ｐ ａ ｉ ｒ ／ Ｕ ｎ ｓ ｃ ｈ ｅ ｄ ｕ ｌ ｅ ｄ Ｄ Ｎ Ａ Ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｓ ｉ ｎ Ｍ ａ ｍ ｍ ａ ｌ Ｊ ａ ｎ
，
遗传信息改变
基 因 突 变 方 向
错义突变 无义突变 正 向 突 变 回 复 突 变
从而 出现染色体 结构异 常，成 为染色 体改变 。整数倍体改变可 以有二倍体 、三倍体或 体畸变或染色体 结构畸变 。 四倍体 。
０ Ｉ 衷化市埸Ｉ ｏ＠０农 化 行 业 资 深 媒 体 １ ８ ／ ７ ２ ６
ｌ 埸 Ｉ 农 化
木本刊特 稿 木
农药登记 的各 类毒性 试验要求 （ 下）
３ ．遗传毒性试验 （ ｇ ｅ ｎ ｏ ｔ ｏ ｘ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ｔ ｅ ｓ ｔ ）
般 采 用组 合 材料 方 式，如 利用 病 毒、细 菌 、真菌 、
培 养 的哺 乳 动物 细胞 、植物 、 昆虫和 哺 乳动 物等 。
成等 。 Ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ） ， 小 鼠斑 点试 验 （ Ｍ ｏ ｕ ｓ ｅ Ｓ ｐ ｏ ｔ
遗传 毒性造成 的后果有 多种 。体细胞 突变的后果 Ｔ ｅ ｓ ｔ ）， 小 鼠可 遗 传 易 位 试 验 （ Ｍ ｏ ｕ ｓ ｅ Ｈ ｅ ｒ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ
农药 的遗传 毒性 目的就是 阐明农 药对人及生物体遗传 乳动物 细 胞姐 妹染 色 单体 互换 体外 试 验 （ Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ 物质潜在 的危 害作用 ， 建立预警机制 ， 采取干预措施 ，
确保人类健康 和生物 安全及生态平衡 。
巴西农药登记中的等同性原药登记
巴西农药登记中的等同性原药登记1989年，巴西开始实施“农用毒物法”(1989年7月11日，第7802号法案)；2002年1月4日，巴西政府又通过4074号法案对该法律进行了修订。
该法律对巴西的农药登记设定了规范，从农药的药效和农药对环境和公共卫生的潜在影响等方面对农药进行完整评估。
2006年12月6日，巴西政府又通过5981号法案，对4074号法案进行了进一步的补充。
巴西农药登记中的管理与评估体系，通过三个不同的政府部门进行管理：巴西农业与农资供应部(MAPA)，巴西国家卫生监控署 (ANVISA, 该署为巴西卫生部附属机构)和巴西环境与国土资源研究院(IBAMA, 该研究院为巴西环境部附属机构)。
在巴西，可以通过以下两种途径对农药原药进行登记：A．完整数据提交：申请人需要根据84/1996号法令所提出的要求，提交完整的物理化学资料、环境毒理学资料、毒理学资料以及致突变试验资料；（目前84/1996号法令已于2012年5月17日通过6/2012号法令更新）B．等同性认定：申请人可通过简化的提交程序，根据4074号法案，以及于2002年8月20日颁布的相关管理细则，通过“等同性原药”进行提交。
该类提交程序由三个阶段构成：第一阶段：对原药的化学性状进行分析评估第二阶段：对原药的急性毒理学和致畸变性进行分析评估第三阶段：对重复曝露剂量下的毒理学表现，以及环境毒理学数据进行分析评估“等同性原药”登记第一阶段下，需要首先提交以下数据报告：五批次全分析是整个原药等同性认定中的核心资料，因为该项资料反映了拟登记产品完整的化学组成，以及与已登记的参照原药的等同性情况。
如果在第一阶段，拟登记原药在化学组成和物理化学性质方面，都显示与已登记的参照原药的等同性；那么将直接获得产品登记。
如果在第一阶段，没有证明与已登记的参照原药的等同性；则需要根据杂质的组成与定量情况，以及相关实验数据的特异性，补充毒理学试验数据资料。
细菌回复突变试验.doc
附件9细菌回复突变试验Bacterial Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2 定义2.1 回复突变 reverse mutation细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
2.2 基因突变 gene mutation在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。
2.3 碱基置换突变 base substitution mutation引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。
颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。
2.4 移码突变 frameshift mutation引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。
2.5 细菌回复突变试验bacterial reverse mutation assay利用一组组氨酸或者色氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型→原养型回复突变的试验方法。
2.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g下离心10min后的肝匀浆上清液。
3 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。
4 仪器和设备培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱（－80℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿、生物安全柜等。
oecd化学品测试准则,第4部分,细菌回复突变试验”
oecd化学品测试准则,第4部分,细菌回复突变试验”1. 引言1.1 概述在化学品安全评估领域，确保人类和环境的健康至关重要。
为了评估化学品对生物体的影响，国际上采用了一系列的标准测试方法来确定其毒性和潜在风险。
其中，OECD（经济合作与发展组织）化学品测试准则是行业内广泛认可的标准之一。
1.2 目的本文的目的是详细介绍OECD化学品测试准则中第4部分的内容，即"细菌回复突变试验"。
通过这个试验方法，我们可以评估化学品对细菌群体的遗传突变能力，从而判断潜在的基因毒性。
1.3 重要性基因突变是化学物质对生物体产生毒性作用的主要机制之一，也是判断其潜在危害程度的关键指标。
通过该试验可以获得有关某种特定化学物质与细菌反应后引起遗传突变的信息，进而为该化学物质是否具有潜在致癌性等基因毒性提供判断依据。
此外，在法律法规和标准制定方面，这一试验方法也被广泛应用，以确保化学品的合规性及人类和环境的安全。
综上所述，本文将深入探讨OECD化学品测试准则第4部分中的"细菌回复突变试验"，包括其原理、实施方式与条件、评价标准以及应用范围与限制。
希望通过该文的阐述，读者能够更全面地了解和认识这一重要试验方法，并对化学品的基因毒性评估有更深入的认识和理解。
2. oecd化学品测试准则概述2.1 什么是oecd化学品测试准则oecd化学品测试准则是指由经济合作与发展组织（OECD）制定的规定化学品评估和测试方法的指导原则和标准。
这些准则旨在提供全球范围内评估化学品在环境和人体健康方面的潜在风险所需的科学数据，并确保这些数据具有可比性和可靠性。
2.2 oecd的背景与目标经济合作与发展组织（OECD）是一个由36个成员国组成的国际组织，致力于推动经济增长、就业、社会发展和环境可持续性。
oecd的目标之一是促进在成员国之间协调安全、健康和环境方面相关政策的制定。
对于化学品风险评估和测试方法，oecd通过制定统一的准则来实现这一目标。
471472细菌回复突变试验
471 472 细菌回复突变试验（Bacterial Reverse Mutation Test）1受试物必备受试物的化学鉴定纯度（杂质）溶解特性pH（必要时）稳定性（包括受试物在赋形剂中的稳定性）熔点／沸点2 试验目的2.1目的和意义细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌需要某种氨基酸的菌株来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换，插入或缺失。
此试验的原理是检测试验菌株已存在突变的回复，细菌恢复合成必需氨基酸的能力。
通过在缺乏受试菌株所需氨基酸的培养基上的生长来检测回复突变的细菌。
点突变是很多人类遗传病的原因，有很多证据表明在人类和试验动物肿瘤形成涉及体细胞癌基因和肿瘤抑制基因的点突变。
细菌回复突变试验是快速的、费用较低和较易进行的试验。
试验菌株具有一些使其对检测突变更为敏感的特征，如回复突变部位的反应性DNA 序列，增强细菌对大分子的通透性，DNA修复系统缺失或DNA易误修复过程增强。
试验菌株的特异性可为诱发突变的种类提供某些有用的信息。
2.2定义回复突变试验（reverse mutation test）：利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌检测需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变。
碱基置换型致突变物（base pair substitution mutagens）：引起DNA中碱基改变的因子。
在回复突变试验此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。
移码型致突变物（frameshift mutagens）：引起DNA中一个或多个碱基对增加或缺失，故改变RNA的读码框。
3测试原理细菌回复突变试验是利用原核生物（细菌）作指示生物的体外遗传毒理学试验，遗传学终点为基因突变。
（1）在有或无外源性代谢活化系统条件下，细菌悬浮液暴露于受试物。
在平板掺入法，细菌悬浮液与顶层琼脂混合，再立即铺至最低培养基上。
在预保温法，处理混合物经预保温后，与顶层琼脂混合，再立即铺至最低培养基上。
毒理学,名词解释,简答题
1、化学致癌三个阶段特点：引发阶段：不可逆；所引发的“干细胞”在形态学上无法识别；需要通过细胞分裂“固定突变”；剂量-反应关系良好，但很难测定的阈值，无可测定的最大反应；存在自发启动的引发作用(内源性)；对外源性化学物质和其他化学因素敏感；引发剂的强度以经一定的促长阶段后发生的癌前病变来定量。
促长阶段：可逆(基因表达、细胞水平)；促长剂的有效性仅出现在引发作用之后；促长细胞群的存在取决于促长剂的持续存在；内源性促长剂可起“自发”促长作用；剂量-反应显示有可测定的阈值，有可测定的最大效应；对饮食和激素等因素敏感；以能否有效的扩大引发细胞群来确定促长剂的相对强度。
进展阶段：不可逆；核型不稳性性导致细胞基因组结构的形态学改变；有可测定的和/或形态学可描述的细胞基因组的改变；进展的早期阶段，已改变的细胞对环境因素敏感；可见良性和/或恶性肿瘤；促进展剂可使已促长的细胞进入该阶段；可以发生自发的进展作用。
2、影响外源化学物质活性化学物因素：化学结构取代基的影响：取代基的影响、异构体和立体构型、同系物的碳原子数和结构的影响、分子饱和度化合物的联合作用（joint action ）：两种或两种以上毒物同时或先后作用于机体时产生的交互毒性作用。
非交互作用：相加作用、独立作用；交互作用：协同作用、加强作用、拮抗作用3、影响外源化学物毒性因素：化学物因素：化学结构，理化性质，不纯物和外源化学物的稳定性机体因素：物种个体遗传学差异，宿主其它因素对于毒作用敏感影响环境因素：气象条件，季节和昼夜节律动物笼养方式，外源化合物的接触特征和赋形剂化合物联合作用：4、影响外源化学物生物转化的因素化学因素：化学结构影响:取代基不同毒性不同，异构体和立体构型的影响，同系物的碳原子数和结构的影响，理化性质：脂水分配系数，分子量大小，挥发性，气态物质血气非配系数比重，电离度和荷电性、不纯物和外源化学物的稳定性二是机体因素5、安全性评价的四个阶段的试验项目：第一阶段：包括急性毒性试验和局部毒性试验。
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农药登记毒理学细菌回复突变1 范围GB/T 15670的本部分规定了细菌回复突变试验的基本原则、方法和要求。
本部分适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1回复突变试验reverse mutation test利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变，即是由营养缺陷型回变到野生型。
2.2碱基置换型致突变物base pair substitution mutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质。
在回复突变试验，此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。
2.3移码型致突变物frameshift mutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。
3 试验目的检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。
4 试验概述细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插入或缺失。
原理是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况，检测试验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力，评价受试物诱发突变的能力。
5 培养基和试剂注：培养基成分或试剂至少应是化学纯，无诱变性。
避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过6个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。
5.1 营养肉汤培养基牛肉浸膏 5 g氯化钠 5 g胰胨10 g磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.6 g加蒸馏水至1000 mL加热溶解，调节pH至7.4，分装后0.103 Mpa，20 min灭菌，保存期不超过6个月。
5.2 营养肉汤琼脂培养基琼脂粉 1.5 g加营养肉汤培养基至100 mL加热溶解，调节pH至7.4，0.103 Mpa，20 min灭菌。
5.3 底层培养基（即最低营养培养基）5.3.1 Vogel-Bonner（V-B）培养基柠檬酸（C6H8O7·H2O） 2.0 g磷酸氢二钾（K2HPO4）10.0 g磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O） 3.5 g硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2 g加蒸馏水至200 mL逐个将化学物在少量蒸馏水中单独溶解后，硫酸镁水溶液在最后缓慢加入，加蒸馏水至200 mL。
0.103 MPa，20 min灭菌，4℃保存备用。
5.3.2 20%葡萄糖溶液葡萄糖20.0 g加蒸馏水至100 mL，0.055 MPa，20 min灭菌。
5.3.3 1.5%底层琼脂培养基琼脂粉15 g加蒸馏水至700 mLV-B培养基200 mL20%葡萄糖溶液100 mL配制：首先将前两种成分于0.103 MPa下高压灭菌20 min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。
按每皿25 mL（相对于90 mm平皿）制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24 h，备用。
5.4 顶层培养基5.4.1 顶层琼脂琼脂粉 3.0 g氯化钠 2.5 g加蒸馏水至500 mL0.103 MPa，20 min高压灭菌。
5.4.2 0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液D-生物素（分子量244）12.2 mgL-组氨酸（分子量155）7.8 mg[或L-盐酸组氨酸（分子量192）9.6 mg]加蒸馏水至100 mL，贮于4℃冰箱中。
5.4.3 顶层培养基制备加热融化顶层琼脂，临用时每100 mL顶层琼脂中加10 mL 0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液（大肠杆菌则需配制0.5 mmol/L色氨酸-组氨酸-生物素溶液），分装在三角烧瓶中，0.103 MPa，20 min灭菌。
用时融化分装小试管，每管2 mL，在45℃水浴中保温。
5.5 S9辅助因子（混合液试剂）的配制5.5.1 盐溶液[1.65 mol/L氯化钾（KCl）+0.4 mol/L氯化镁（MgCl2）]氯化钾（KCl） 6.15 g氯化镁（MgCl2·6H2O） 4.07 g蒸馏水50 mL0.103 MPa，20 min高压灭菌或滤菌。
5.5.2 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）磷酸氢二钠（Na2HPO4）（14.2 g/500 mL）440 mL磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）（13.8 g/500 mL）60 mL0.103 MPa，20 min高压灭菌或滤菌。
5.5.3 辅酶-II（氧化型）溶液准确称取辅酶-II，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025 mol/L溶液，低温保存（-20℃以下）。
5.5.4 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成0.05 mol/L，低温保存（-20℃以下）。
5.6 10% S9混合液配制每10 mL由以下成分组成，临用时配制。
磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH7.4） 6.0 mLMgCl2-KCl盐溶液0.2 mL葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液（0.05 mol/L）1.0 mL辅酶-II溶液（0.025 mol/L） 1.6 mL肝S9 1.0 mL无菌蒸馏水0.2 mL混匀，置冰浴中待用。
5.7 活化系统（大鼠肝S9）的诱导和制备选健康雄性成年SD大鼠或Wistar大鼠，体重200 g左右。
将多氯联苯（Aroclor1254或国产PCB-五氯）溶于玉米油中，按500 mg/kg体重一次腹腔注射，5 d后处死动物，处死前12 h禁食，但可自由饮水。
苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂，健康雄性大鼠体重200 g左右，经口或腹腔注射80 mg/kg体重苯巴比妥钠和80 mg/kg体重β-萘黄酮，连续3 d。
处死前16 h停止饮食，但可自由饮水。
由于化学物质经腹腔注射，容易引起肝脏形成外膜，不易剥离，推荐使用经口灌胃的方式。
处死动物后取出肝脏称重，用新鲜冰浴的0.15 mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以去除抑制微粒体酶活性的血红蛋白。
每克肝（湿重）加0.15 mol/L氯化钾溶液3 mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4000 r/min，往复1 min～2 min）或组织匀浆器（20000 r/min，1 min）中制成肝匀浆。
以上操作需注意无菌和局部冷环境。
将制成的肝匀浆在低温（0℃～4℃）高速离心机上，以9000 g离心10 min，吸出上清液为S9组分，分装于无菌冷冻管或安瓿中，每安瓿2 mL左右，最好用液氮或干冰速冻后置-80℃低温保存。
上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。
制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。
S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。
S9制成后，经无菌检查，蛋白含量测定（Lowry法），每毫升蛋白含量应不超过40 mg，因过量蛋白将会抑制回复突变率，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
5.8 特殊试剂和培养基的配制5.8.1 氨苄青霉素溶液（8 mg/mL）：称取三羟氨苄青霉素80 mg，加入0.02 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，无菌配制，保存于4℃冰箱。
5.8.2 0.1%结晶紫溶液：称取结晶紫10 mg，加10 mL无菌水。
5.8.3 四环素溶液（8 mg/mL）：称取四环素40 mg，加入0.02 mol/L盐酸溶液5 mL，保存于4℃冰箱，用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板。
5.8.4 L-组氨酸溶液和0.5 mmol/L D-生物素溶液：称取L-组氨酸404.3 mg和D-生物素12.2 mg，分别溶于100 mL蒸馏水，0.103 Mpa，20 min灭菌，保存于4℃冰箱。
5.8.5 氨苄青霉素平板（用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板）和氨苄青霉素-四环素平板（用作TA102菌株的主平板），每1000 mL由以下成分组成：底层培养基980 mL组氨酸水溶液10 mL0.5 mmol/L生物素 6 mL0.8%氨苄青霉素溶液 3.15 mL0.8%四环素溶液0.25 mL四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加入。
以上成分均已分别灭菌或无菌制备。
5.8.6 组氨酸-生物素平板（组氨酸试验用），每1000 mL由以下成分组成：底层培养基984 mL组氨酸水溶液10 mL0.5 mmol/L生物素 6 mL以上成分均已分别灭菌。
5.8.7 二甲基亚砜（DMSO）：0.103 Mpa，20 min灭菌。
6 菌株及其鉴定与保存6.1 试验菌株6.1.1 推荐使用鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102作为四株标准测试菌株。
TA97和TA98可以检测各种移码型致突变物；TA100可检测碱基置换型致突变物；TA102能检测出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂，如甲醛、各种过氧化氢化合物和丝裂霉素C等交联剂。
一般用来测试受试物诱变性时，应通过上述四个菌株的检测。
必要时可增加TA1535、TA1537、TA97a、大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA（PKM101）任一菌株。
试验菌株的基因型和检测类型见附录A.1。
6.1.2 也可采用下列的菌株组合：鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，其中TA97可用TA97a或TA1537替换，TA102可用大肠杆菌WP2uvrA（PKM101）或WP2uvrA替换。
6.2 菌株的鉴定6.2.1 应进行菌株鉴定的情况菌株特性应符合细菌回复突变试验的要求，见附录A.2。
突变型菌株的某些特性易丢失或变异，遇到下列情况应鉴定菌株的基因型：a)在收到培养菌株后；b)当制备一套新的冷冻保存株或冷冻干燥菌株时；c)当每皿自发回变数不在正常范围时；d)当对标准诱变剂丧失敏感性时；e)初次投入使用前。
6.2.2 增菌培养在营养肉汤培养基中接种贮存菌株培养物，于37℃振荡（100次/min）培养10 h或静置培养16 h备用。
6.2.3 组氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型的鉴定6.2.3.1 加热融化底层培养基两瓶（一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸），不加组氨酸者每100 mL培养基中加0.5 mmol/L D-生物素0.6 mL；加组氨酸者每100 mL培养基中加入L-组氨酸（每100 mL中含404.3 mg）1 mL和0.5 mmol/L D-生物素0.6 mL，冷却至50℃左右，各倒两个平皿。
6.2.3.2 接种：取有组氨酸和无组氨酸培养基各一皿，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线（直线），接种在培养基表面，37℃培养48 h。
6.2.3.3 结果：所有菌株（TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537）在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。