血浆-血清-体液蛋白质组学(完整版 柳满然)
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肝脏疾病常用检查PPT课件
（七）肝功能实验检查项目的选择与应用
检验肝功能的目的在于探测肝脏有无损害、查明原因、 判断预后以及鉴别黄疸等。因此，肝功能试验的临床 应用对于诊断、治疗、预后等方面具有重要价值。肝 功能试验种类繁多，不下数百种，但是一种试验只能 探查肝脏的某一种功能，没有一种试验能全面反映肝 脏的一切功能。因此，为了得到比较正确的结论，应 做若干种试验，必要时要反复复查。同时对肝功能试 验的评价，必须结合临床表现全面考虑，避免片面性 及主观性。此外，也要注意节约人为物力及财力，有 的放矢地选择性做必要的肝功能试验是重要的。
尿中胆素原
增多
不定或升高
减少或消失
粪中胆素原
增多
减少
减少或消失
血清 蛋白
电泳谱 脂蛋白X
正常 阴性
Alb减少，γ-球蛋白
升高 一般阴性
球蛋白明显升高 明显增高
血
谷丙转氨酶
正常，稍高
清 酶
碱性磷酸酶
正常
类
γ-谷氨酰转肽酶
正常
肝炎急性期增高 正常或轻度增高 可增高
正常或增高 明显增高 明显增高
其
凝血酶原时间
参考值：
成人
40-110u/L（金-阿氏法）。
儿童
<250u/L
（五）血清酶及同工酶检查
临床意义： A）ALP分布 肝、骨、肠等，主要在肝 B）ALP分布在肝细胞血窦侧和毛细胆管侧的微 绒毛上，经胆汁排入小肠，当胆汁排出不畅， 毛细胆管压力增加时，可诱发产生大量ALP， 故胆汁淤滞时，ALP升高。 C）骨骼疾病时，骨瘤、骨折恢复期ALP也可升高
肝病预后。 （2）活化部分凝血活酶时间测定（APTT） 延长见于严重肝病、维生素K缺乏。
4、血氨测定
重庆医科大学刘先俊《生物化学》第15章.血液的生物化学
4.在人体缺氧时有重要意义。
当人从海平面上到4500 米高原后两天内， 2,3 BPG的浓度有原来的5mM 增加到8mM，结果对组织 的供氧量又恢复到接近 正常水平（0.38）。
如果BPG仍维持5mM水 平，对组织的供氧量将 减少四分之一，为0.30。
本章总结 血浆蛋白的电泳分类；非蛋白氮的 概念及主要种类。
｛ CO2的运输 （6％） 碳酸氢盐形式
｛ 化合结合
（约2/3 ）
（94％） 氨基甲酸血红蛋白
（约1/4 ）
1. 碳酸氢盐形式的运输
2.氨基甲酸血红蛋白的形式运输
HbNH2+CO2
在组织中
（氨基甲酸血红蛋白）
HbNHCOOH
肺
HbNHCOO－ ＋ H＋
HbH＋
+ HbO2
O2
Bohr效应的总结
CO2＋H2O ＝ H＋＋HCO3－
结果使得细胞内的pH降低。低pH使Hb对氧的亲和 力降低。
波耳效应提高了氧转运系统的效率。在肺部，CO2 水平低，氧很容易被血红蛋白占有，同时释放出质子；
而在代谢的组织中，CO2水平相对来说比较高，pH较低，
O2容易从氧合血红蛋白中卸载。
（三）运输二氧化碳
Байду номын сангаас
物理溶解
运输O2、CO2、H+ （一）运输O2
与Hb结合占98.5％ 氧的运输
物理溶解占1.5％
Hb与O2呈可逆结合
O2分压高（肺）
Hb＋O2
HbO2
O2分压低（组织）
（还原、紫蓝色）
（氧化、红色）
Hb氧饱和曲线呈S型，两端斜率小，中间大； Mb氧饱和曲线呈双曲线型
生理意义：
（二）波尔效应（Bohr effect）
当人从海平面上到4500 米高原后两天内， 2,3 BPG的浓度有原来的5mM 增加到8mM，结果对组织 的供氧量又恢复到接近 正常水平（0.38）。
如果BPG仍维持5mM水 平，对组织的供氧量将 减少四分之一，为0.30。
本章总结 血浆蛋白的电泳分类；非蛋白氮的 概念及主要种类。
｛ CO2的运输 （6％） 碳酸氢盐形式
｛ 化合结合
（约2/3 ）
（94％） 氨基甲酸血红蛋白
（约1/4 ）
1. 碳酸氢盐形式的运输
2.氨基甲酸血红蛋白的形式运输
HbNH2+CO2
在组织中
（氨基甲酸血红蛋白）
HbNHCOOH
肺
HbNHCOO－ ＋ H＋
HbH＋
+ HbO2
O2
Bohr效应的总结
CO2＋H2O ＝ H＋＋HCO3－
结果使得细胞内的pH降低。低pH使Hb对氧的亲和 力降低。
波耳效应提高了氧转运系统的效率。在肺部，CO2 水平低，氧很容易被血红蛋白占有，同时释放出质子；
而在代谢的组织中，CO2水平相对来说比较高，pH较低，
O2容易从氧合血红蛋白中卸载。
（三）运输二氧化碳
Байду номын сангаас
物理溶解
运输O2、CO2、H+ （一）运输O2
与Hb结合占98.5％ 氧的运输
物理溶解占1.5％
Hb与O2呈可逆结合
O2分压高（肺）
Hb＋O2
HbO2
O2分压低（组织）
（还原、紫蓝色）
（氧化、红色）
Hb氧饱和曲线呈S型，两端斜率小，中间大； Mb氧饱和曲线呈双曲线型
生理意义：
（二）波尔效应（Bohr effect）
血浆蛋白质组学的研究进展
蛋白质组学自它被定义的那天起， 就引起了学者的高度 关注， 与蛋白质组学方法研究和应用研究相关的文献报道每 年呈数量级递增， 然而， 如前所述， 血浆蛋白的复杂性、 高度 异原性和高丰度蛋白的存在使血浆蛋白质组学研究受到限 制， 为了打破技术上的瓶颈， 研究者们主要在依赖于分离技 术的蛋白质样品预处理、 不依赖于分离的亚蛋白质组及质谱 鉴定三个方面做了探索。 １ ． １ 依赖于分离技术的蛋白质样品预处理 无论建立血浆蛋白质数据库， 还是将血浆蛋白质组学方 法应用到阐述疾病发病机制、 疾病诊断、 药物疗效和不良反 应监测或药物作用靶标的分析， 都需要尽可能全面地检测出 血浆中表达的所有蛋白。目前， 蛋白质组学分离技术以双向 电泳（ ，２ ） 和多维色谱为主， ｔ ｗ ｏｄ ｉ ｍ ｅ ｎ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ Ｄ Ｅ 在以 ２ 分子量为 ４ ， Ｄ Ｅ为基础的血浆蛋白质图谱中， ５ ～ ８ ０ｋ ｕ ［ ］ ３ 等电点为 ４ 的蛋白点堆积严重 ， 高丰度蛋白也掩盖 ． ５ ～６ 了许多低含量蛋白， 其他依赖于分离的蛋白质组学方法都会 面临这一问题， 为解决这一问题， 人们首先想到在样品的预 处理环节做些尝试。 １ ． １ ． １ 超滤离心 ］ ４ 尽管 Ｇ 发现用超滤离心去除白蛋白等高丰 ｅ ｏ ｒ ｇ ｉ ｏ ｕ等［
白图谱发生了戏剧性的变化， 至少有 ３ 个额外的低丰度蛋白 ５ ０ ］ ］ ３ ７ 在胶上显现出来［ 。Ｐ 等［ 用免疫亲合层析法去除了血 ｉ ｅ ｐ ｅ ｒ 清中的高丰度蛋白后， 又用阴离子交换和排阻色谱法将血清 分为 ７ 个组分后分别行 ２ ， 经考马斯亮蓝染色清楚地显示 ４ Ｄ Ｅ 个蛋白点， 由于在这些点中许多点是蛋白质翻译后修 出３ ７ ０ ０ 饰的变异体， 经质谱鉴定这些点为 ３ 个蛋白； 尽管检测方法 ２ ５ － １ · 的蛋白质， 如白 相对不敏感， 仍然检测到了血清中 ＜ １ ０ ｇ Ｌ μ 介素 、 组织蛋白酶和肽类激素。免疫亲和层析特异性好， 在 ６ 去除干扰蛋白时蛋白丢失比超滤离心少。 １ ． １ ． ３ 等电聚焦预分离 除了利用分子量和抗原抗体反应清除血浆中高丰度蛋 白外， 还可根据蛋白质等电点的不同， 用微量溶液等电聚焦 进行初步分馏， 将血浆蛋白分为一系列连续 ｐ Ｈ值的部分再 ］ ８ 行２ ， 这样做使 ２ 倍［ ， 对 Ｄ Ｅ Ｄ Ｅ的上样量至少提高了 ６ ～３ ０ 于分辨低丰度蛋白极为有利。 １ ． １ ． ４ 多维分离质谱鉴定 ］ ９ 等［ 用蛋白 Ａ 将余下的 Ａ ｄ ｋ ｉ ｎ ｓ ／ Ｇ去除血清免疫球蛋白， 蛋白酶切， 获得的肽段用强阳离子交换柱分成不同组分， 再 用反相毛细管液相色谱和离子阱质谱在线鉴定了 ４ ９ ０个蛋 倍， 并且检测 白质， 该方法检测到的蛋白比以往增加了 ３ ～５
白图谱发生了戏剧性的变化， 至少有 ３ 个额外的低丰度蛋白 ５ ０ ］ ］ ３ ７ 在胶上显现出来［ 。Ｐ 等［ 用免疫亲合层析法去除了血 ｉ ｅ ｐ ｅ ｒ 清中的高丰度蛋白后， 又用阴离子交换和排阻色谱法将血清 分为 ７ 个组分后分别行 ２ ， 经考马斯亮蓝染色清楚地显示 ４ Ｄ Ｅ 个蛋白点， 由于在这些点中许多点是蛋白质翻译后修 出３ ７ ０ ０ 饰的变异体， 经质谱鉴定这些点为 ３ 个蛋白； 尽管检测方法 ２ ５ － １ · 的蛋白质， 如白 相对不敏感， 仍然检测到了血清中 ＜ １ ０ ｇ Ｌ μ 介素 、 组织蛋白酶和肽类激素。免疫亲和层析特异性好， 在 ６ 去除干扰蛋白时蛋白丢失比超滤离心少。 １ ． １ ． ３ 等电聚焦预分离 除了利用分子量和抗原抗体反应清除血浆中高丰度蛋 白外， 还可根据蛋白质等电点的不同， 用微量溶液等电聚焦 进行初步分馏， 将血浆蛋白分为一系列连续 ｐ Ｈ值的部分再 ］ ８ 行２ ， 这样做使 ２ 倍［ ， 对 Ｄ Ｅ Ｄ Ｅ的上样量至少提高了 ６ ～３ ０ 于分辨低丰度蛋白极为有利。 １ ． １ ． ４ 多维分离质谱鉴定 ］ ９ 等［ 用蛋白 Ａ 将余下的 Ａ ｄ ｋ ｉ ｎ ｓ ／ Ｇ去除血清免疫球蛋白， 蛋白酶切， 获得的肽段用强阳离子交换柱分成不同组分， 再 用反相毛细管液相色谱和离子阱质谱在线鉴定了 ４ ９ ０个蛋 倍， 并且检测 白质， 该方法检测到的蛋白比以往增加了 ３ ～５
应用分泌_释放蛋白质组学鉴定HBV相关的肝细胞癌血浆标志物_杨磊
① ② ① ① ③ ① ② ② ④
④ 中国医学科学院&北京协和医学院, 肿瘤医院&肿瘤研究所检验科, 北京 100021; ⑤ 首都医科大学佑安医院检验科, 北京 * 联系人, E-mail: dr_wujianxiong@; yngao@; chengshj@ 收稿日期: 2013-04-25; 接受日期: 2013-05-02 国家自然科学基金 (批准号 : 81172035, 30973388)、全国优秀博士论文专项资金 (批准号 : 2007B68)、国家高技术研究发展计划 (批准号 : 2012AA020206)和中国医学科学院&北京协和医学院肿瘤医院基本科研项目(批准号 : JK2009B08, LC2009B45)资助
引用格式: 杨磊, 荣维淇, 肖汀, 等. 应用分泌/释放蛋白质组学鉴定 HBV 相关的肝细胞癌血浆标志物. 中国科学: 生命科学, 2013, 43: 663–671 英文版见: Yang L, Rong W Q, Xiao T, et al. Secretory/releasing proteome-based identification of plasma biomarkers in HBV-associated hepatocellular carcinoma. Sci China Life Sci, 2013, 56: 638–646, doi: 10.1007/s11427-013-4497-x
中国科学: 生命科学
2013 年
第 43 卷
第8期
以 7 L/min 的速度自动进样 3 min. 所用溶剂 A 为 0.1%溶于水的甲酸, B 为 0.1%溶于乙腈的甲酸, 流动 相 A 线性梯度为 97%~60%, 流动相 B 的线性梯度为 3%~40%. 分离 90 min 以上, 速度为 200 nL/min, 随 后, 10%流动相 A 和 90%流动相 B, 10 min. 以 lock mass 模式, Glu-fibrinopeptide B 浓度为 100 fmol/L, 恒 速 300 nL/min 传 递 到 nano-ACQUITY 系 统 . SYNAPT 高分辨率质谱分析胰酶消化后的肽段 [14], 质谱在 V 模式下进行, 全宽度半最大值最小为 10000. TOF 质谱分析仪串联质谱校准 Glufibrinopeptide B 离 子片段 m/z(质荷比)设为 50~1600, 喷雾器采样频率为 30 s. 高精度 LC-MS 在 MSE 模式下数据采集(低碰撞 能量为 4 eV, 高碰撞能量从 15 eV 升至 45 eV, 开关 间 隔 1 s, 扫 描 间 隔 0.02 s), 质 量 范 围 (m/z) 为 300~1990.
④ 中国医学科学院&北京协和医学院, 肿瘤医院&肿瘤研究所检验科, 北京 100021; ⑤ 首都医科大学佑安医院检验科, 北京 * 联系人, E-mail: dr_wujianxiong@; yngao@; chengshj@ 收稿日期: 2013-04-25; 接受日期: 2013-05-02 国家自然科学基金 (批准号 : 81172035, 30973388)、全国优秀博士论文专项资金 (批准号 : 2007B68)、国家高技术研究发展计划 (批准号 : 2012AA020206)和中国医学科学院&北京协和医学院肿瘤医院基本科研项目(批准号 : JK2009B08, LC2009B45)资助
引用格式: 杨磊, 荣维淇, 肖汀, 等. 应用分泌/释放蛋白质组学鉴定 HBV 相关的肝细胞癌血浆标志物. 中国科学: 生命科学, 2013, 43: 663–671 英文版见: Yang L, Rong W Q, Xiao T, et al. Secretory/releasing proteome-based identification of plasma biomarkers in HBV-associated hepatocellular carcinoma. Sci China Life Sci, 2013, 56: 638–646, doi: 10.1007/s11427-013-4497-x
中国科学: 生命科学
2013 年
第 43 卷
第8期
以 7 L/min 的速度自动进样 3 min. 所用溶剂 A 为 0.1%溶于水的甲酸, B 为 0.1%溶于乙腈的甲酸, 流动 相 A 线性梯度为 97%~60%, 流动相 B 的线性梯度为 3%~40%. 分离 90 min 以上, 速度为 200 nL/min, 随 后, 10%流动相 A 和 90%流动相 B, 10 min. 以 lock mass 模式, Glu-fibrinopeptide B 浓度为 100 fmol/L, 恒 速 300 nL/min 传 递 到 nano-ACQUITY 系 统 . SYNAPT 高分辨率质谱分析胰酶消化后的肽段 [14], 质谱在 V 模式下进行, 全宽度半最大值最小为 10000. TOF 质谱分析仪串联质谱校准 Glufibrinopeptide B 离 子片段 m/z(质荷比)设为 50~1600, 喷雾器采样频率为 30 s. 高精度 LC-MS 在 MSE 模式下数据采集(低碰撞 能量为 4 eV, 高碰撞能量从 15 eV 升至 45 eV, 开关 间 隔 1 s, 扫 描 间 隔 0.02 s), 质 量 范 围 (m/z) 为 300~1990.
食管癌患者血浆外泌体蛋白标志物TMT定量蛋白质组学筛选及分析
206
解剖学研究 2021 年第 43 卷第 3 期 Anat Res, 2021. Vol. 43. No.3
.论著•
食管癌患者血浆外泌体蛋白标志物TMT定量蛋白质 组学筛选及分析
卢喜，年亮'，谭遥，王海峰，俞婷婷' (新疆医科大学附属肿瘤医院胸腹放疗科，新疆乌鲁木齐830011)
【摘要】目的探讨食管癌患者血浆外泌体蛋白的表达变化，筛选并分析食管癌诊断的生物标志物。方法 采用定量蛋白质组学串联质量标签(TMT)标记技术对3例食管鳞状细胞癌患者及3例健康体检者的血浆外泌体 蛋白进行检测及定量分析，筛选食管癌患者血清外泌体中发生显著性变化的差异蛋白。采用Proteome Discoverer. STRING等数据库对差异蛋白进行生物信息学分析。结果共鉴定出17种显著差异表达蛋白，其中显著上调蛋白 6个，显著下调蛋白11个。GO功能注释、COG注释、KEGG通路注释和结构域注释显示差异蛋白主要包括蛋白酶 抑制剂的竣肽酶、细胞外基质1、分泌磷蛋白24.ERV/ALR硫代氧化酶、血小板反应蛋白/软骨寡聚基质蛋白的卷曲 螺旋结构域、胎球蛋白B半胱氨酸蛋白酶抑制结构域。结论定量蛋白质组学TMT法能有效筛选食管癌患者血 浆外泌体中的差异蛋白，筛选出的差异蛋白有望成为食管癌诊断的标志物。
207
上，取1.0 ml于离心管中，4七下、3 000 g离心10 min,去除细胞碎片，取上清转移至离心管中；再次 离心收集的上清液，4七、10 000 g离心20 min,去 除颗粒，取上清于试管内；加入1.0 ml预冷的lx PBS稀释，混匀，再加入500 pL外泌体提取试剂 (ECS试剂)，混匀,2七~8七静置过夜，代、10 000 g 离心60 min,收集沉淀，用400 pL lxPBS均匀吹打 离心沉淀物，均匀悬浮后，转移至1.5 ml离心管 中，再于4V、12 000 g离心2 min ,分离得富含外泌 体的上清液。将收获的外泌体粗品置于外泌体纯 化柱(EPF柱)，4七、3 000 g离心10 min,收集纯化 后的外泌体,-80T保存备用。采用Western blot对 外泌体进行鉴定。 1.2.2外泌体蛋白提取及定量外泌体重悬液中 加入适量的裂解液、超声，4七、12 000xg离心 10 min,收集上清液，加入丙酮(1:4),-20^过夜； 4七、12 000 g离心10 min,分离得沉淀，加入适量 的裂解液、超声.4t、12 000g离心10 min,取上清 液。蛋白质团块中加入200 |jlL RB,反复吹打直至 蛋白质充分分散，超声后于冰上冷却，重复1次， 4七、12 000 g离心10 min, ±清液转移至EP管 中。分别取 5、10、15、20、25、30 和、35 憾的 BSA 制作标准曲线。每管加入1 ml Bradford染色，涡旋 振荡20 s,测定吸光值。计算得到各样品的浓度 后，调节样品浓度，再进行定量。SDS-PAGE凝胶 电泳。 1.2.3蛋白酶切及TMT试剂标记 蛋白液充分混 匀，加 0.05 mol/L TCEP 溶液,60X：孵育 1 h, 70% 乙 醇润洗10KD超滤管,12 000 g离心20 min,再用纯 水润洗，12 000 g离心20 min;超滤管中加入蛋白 液，12 000 g离心20 min,弃掉滤液；加入100 p.1 UA( 8 p.mol/L urea, 0.1 |xmol/L Tris/HCL, pH &5)溶 液,12 000 g离心20 min，离心2次；加入100 p.1 0.25 |jimol/L TEAB, 12 000 g 离心 20 min,重复 3 次。加入 jjlI 0.5 jimol/L TEAB,加入胰酶(1 p,g/ □乙酸溶液，与蛋白质量比为1：50),37七孵育12 h后，补加胰酶(与蛋白质量比为1 ： 100), 37七孵 育4 h,离心收集滤液，加入50 |11 0.5 pmol/L TEAB,离心，与之前滤液合并，低温真空抽干。
解剖学研究 2021 年第 43 卷第 3 期 Anat Res, 2021. Vol. 43. No.3
.论著•
食管癌患者血浆外泌体蛋白标志物TMT定量蛋白质 组学筛选及分析
卢喜，年亮'，谭遥，王海峰，俞婷婷' (新疆医科大学附属肿瘤医院胸腹放疗科，新疆乌鲁木齐830011)
【摘要】目的探讨食管癌患者血浆外泌体蛋白的表达变化，筛选并分析食管癌诊断的生物标志物。方法 采用定量蛋白质组学串联质量标签(TMT)标记技术对3例食管鳞状细胞癌患者及3例健康体检者的血浆外泌体 蛋白进行检测及定量分析，筛选食管癌患者血清外泌体中发生显著性变化的差异蛋白。采用Proteome Discoverer. STRING等数据库对差异蛋白进行生物信息学分析。结果共鉴定出17种显著差异表达蛋白，其中显著上调蛋白 6个，显著下调蛋白11个。GO功能注释、COG注释、KEGG通路注释和结构域注释显示差异蛋白主要包括蛋白酶 抑制剂的竣肽酶、细胞外基质1、分泌磷蛋白24.ERV/ALR硫代氧化酶、血小板反应蛋白/软骨寡聚基质蛋白的卷曲 螺旋结构域、胎球蛋白B半胱氨酸蛋白酶抑制结构域。结论定量蛋白质组学TMT法能有效筛选食管癌患者血 浆外泌体中的差异蛋白，筛选出的差异蛋白有望成为食管癌诊断的标志物。
207
上，取1.0 ml于离心管中，4七下、3 000 g离心10 min,去除细胞碎片，取上清转移至离心管中；再次 离心收集的上清液，4七、10 000 g离心20 min,去 除颗粒，取上清于试管内；加入1.0 ml预冷的lx PBS稀释，混匀，再加入500 pL外泌体提取试剂 (ECS试剂)，混匀,2七~8七静置过夜，代、10 000 g 离心60 min,收集沉淀，用400 pL lxPBS均匀吹打 离心沉淀物，均匀悬浮后，转移至1.5 ml离心管 中，再于4V、12 000 g离心2 min ,分离得富含外泌 体的上清液。将收获的外泌体粗品置于外泌体纯 化柱(EPF柱)，4七、3 000 g离心10 min,收集纯化 后的外泌体,-80T保存备用。采用Western blot对 外泌体进行鉴定。 1.2.2外泌体蛋白提取及定量外泌体重悬液中 加入适量的裂解液、超声，4七、12 000xg离心 10 min,收集上清液，加入丙酮(1:4),-20^过夜； 4七、12 000 g离心10 min,分离得沉淀，加入适量 的裂解液、超声.4t、12 000g离心10 min,取上清 液。蛋白质团块中加入200 |jlL RB,反复吹打直至 蛋白质充分分散，超声后于冰上冷却，重复1次， 4七、12 000 g离心10 min, ±清液转移至EP管 中。分别取 5、10、15、20、25、30 和、35 憾的 BSA 制作标准曲线。每管加入1 ml Bradford染色，涡旋 振荡20 s,测定吸光值。计算得到各样品的浓度 后，调节样品浓度，再进行定量。SDS-PAGE凝胶 电泳。 1.2.3蛋白酶切及TMT试剂标记 蛋白液充分混 匀，加 0.05 mol/L TCEP 溶液,60X：孵育 1 h, 70% 乙 醇润洗10KD超滤管,12 000 g离心20 min,再用纯 水润洗，12 000 g离心20 min;超滤管中加入蛋白 液，12 000 g离心20 min,弃掉滤液；加入100 p.1 UA( 8 p.mol/L urea, 0.1 |xmol/L Tris/HCL, pH &5)溶 液,12 000 g离心20 min，离心2次；加入100 p.1 0.25 |jimol/L TEAB, 12 000 g 离心 20 min,重复 3 次。加入 jjlI 0.5 jimol/L TEAB,加入胰酶(1 p,g/ □乙酸溶液，与蛋白质量比为1：50),37七孵育12 h后，补加胰酶(与蛋白质量比为1 ： 100), 37七孵 育4 h,离心收集滤液，加入50 |11 0.5 pmol/L TEAB,离心，与之前滤液合并，低温真空抽干。
患者入院时血浆Lp-PLA2、LP（b）、NIHSS_评分及MoCA_评分对急性缺血性脑卒中预后不良
患者入院时血浆Lp-PLA2、LP（b）、NIHSS评分及MoCA 评分对急性缺血性脑卒中预后不良的预测效能王秀杰，郑富霞，熊鑫，李敏，范海燕，赵晓晶华北理工大学附属医院神经内科，河北唐山063000摘要：目的 分析患者入院时血浆脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）、脂蛋白b［LP（b）］、NIHSS评分及MoCA评分对急性缺血性脑卒中（AIS）预后不良的预测效能。
方法 AIS患者231例，根据患者出院3个月时mRS量表评分划分为预后良好组125例与预后不良组106例。
收集两组患者的性别、年龄、高血压病史、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史及入院时的实验室检测结果、NIHSS评分、MoCA评分等资料，实验室检测指标包括血浆Lp-PLA2、血尿酸（UA）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、脂蛋白a［LP（a）］、脂蛋白b［LP（b）］、同型半胱氨酸（Hcy）、空腹血糖（FBG）、C反应蛋白（CRP）等。
将AIS患者是否预后不良作为因变量，以患者血浆Lp-PLA2、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C、LP（a）、LP（b）、Hcy、FBG、CRP水平、入院NIHSS评分、MoCA评分为自变量，采用多因素二元logistic回归分析法分析AIS患者预后不良的独立影响因素。
采用受试者工作特征曲线（ROC）分析独立影响因素及联合预测因子L对AIS患者预后不良的预测效能。
结果 预后不良组血浆Lp-PLA2、TC、LDL-C、LP（b）、CRP水平及NIHSS评分均显著高于预后良好组（P均<0.05），MoCA评分显著低于预后良好组（P<0.05）。
血浆Lp-PLA2水平、血浆LP（b）水平、NIHSS评分、MoCA评分是AIS患者预后不良的独立影响因素（P 均<0.05）。
血浆Lp-PLA2水平预测AIS患者预后不良的AUC为0.885，取截断值为158 ng/mL时，血浆Lp-PLA2水平预测AIS患者预后不良的灵敏度为80.19%、特异度为86.40%。
单一人份纤维蛋白胶的制备,能及止血效果观察性
ｃ ｐ ｏｃ ａ ｉ ） 离 心 分 离 后 加 无 水 乙 醇 脱 水 ２次 ， ａ ｒｉ ｃ ， ｄ
６ ℃干 燥 ５ 干 燥 器 内恒 重 后 称 重 。 ０ ｈ， １ ５ Ｆ ｘ［ ． ｎ活性 的 测 定 采 用 纤 维 蛋 白凝 块 溶 解 法 测 定 ： 按 一 系 列 稀 释 度 稀 释 好 的 标 准 血 浆 和 待 测 取
用 多联 采血 袋 的封 闭 系统 中操 作 可保 证 制 品 满 足 血 液 成分 的质 量 标 准要 求 。 由 于所 制 备的 纤 维 蛋 白原 新 鲜 程 度 高 且 未 经 冻 干 ， 溶 解性 明 显 优 于 冻干 制 重 剂 ， 临 床 实 际 使 用 过 程 中 颇 受 医 护 人员 的 欢迎 。 在 但 由于 献 血 者 个 体 差 异 和 操 作 人员 和 方 法 的 差 异 ． 国 外 制 备 出来 的冷 沉 淀 的 量 以 及 其 中的 纤 维 蛋 白原 的 含量 往 往 彼 此 差 异 很 大 “ ， 文通 过 对 自 己制 备 的 ：本 冷 沉 淀 中 纤 维 蛋 白原 、 凝 血 Ｆ ｘ 人 Ⅲ等关 键 活 性 成 分含量 （ 活性 ） 测 定 和 所 制 得 的 纤 维 蛋 白胶 的 有 关 的 特 性 指 标 的考 察 ， 以及 止血 效 果 的观 察 ． 结 制 备 和 总
只 ５ 注 射 器 内 ， 以 上 两 只 注 射 器 通 过 一 个 Ｙ 型 ｍｌ 将
塑 料 装 置 混 合 即 形 成 所 需 的 纤 维 蛋 白胶 ， 接 喷 入 直 （ 入 、 入 口患 部 后 ， 涂 塞 伤 即可 达到 止血 或 粘 结 等 目
的 。 节 悬 浮 冷 沉 淀 的 生 理 盐 水 的 量 ， 可 改 变 胶 的 调 即
及 展 望 ． 国 输 血 协 会 第 一 次 大 会专 题 学 术 报 告 汇 编 ，９ ７ ２ 中 １ ８ ；５
无偏质谱蛋白质组学-概述说明以及解释
无偏质谱蛋白质组学-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：无偏质谱蛋白质组学是一种基于质谱技术的蛋白质组学方法，其核心思想是通过无偏的蛋白质分析方法，全面地揭示生物体内蛋白质的组成、结构和功能。
随着质谱技术的不断发展和完善，无偏质谱蛋白质组学在生物医学研究领域得到越来越广泛的应用。
无偏质谱蛋白质组学的方法包括离子传输质谱、亲和质谱、双重标记定量质谱等多种技术手段，能够对样本中的蛋白质进行高效、灵敏和准确的分析。
相比传统的蛋白质组学方法，无偏质谱蛋白质组学具有更高的分辨率、更广的蛋白质检测范围和更快的分析速度，能够为生物体内蛋白质的研究提供更加全面和深入的信息。
通过无偏质谱蛋白质组学的应用，我们可以深入了解生物体内蛋白质的种类、表达水平、修饰状态等重要信息，为疾病的诊断、治疗和药物研发提供重要参考。
因此，无偏质谱蛋白质组学具有广阔的应用前景，将成为生物医学研究领域的重要工具和技术手段。
1.2文章结构"1.2 文章结构"本文将首先介绍无偏质谱蛋白质组学的概念，阐述其在生物学和医学领域中的重要性。
随后，将详细探讨无偏质谱蛋白质组学在生物医学研究中的应用，包括对疾病机制的解析、药物研发和临床诊断的改进等方面。
最后，将分析无偏质谱蛋白质组学相较于传统方法的优势和局限性，并探讨未来在该领域的发展方向和挑战。
通过本文的综合讨论，希望读者能对无偏质谱蛋白质组学有一个全面的了解，以及对其在生命科学研究中的潜在价值有所启发。
1.3 目的本文旨在探讨无偏质谱蛋白质组学在生物学研究中的重要性和应用。
通过对该技术的概念、应用和优势进行深入分析，可以帮助读者更好地理解无偏质谱蛋白质组学在蛋白质组学研究中的作用，为未来的研究和应用提供指导和参考。
同时，通过本文的撰写，还可以推动无偏质谱蛋白质组学技术的进一步发展和应用，为生命科学领域的发展做出贡献。
2.正文2.1 无偏质谱蛋白质组学的概念无偏质谱蛋白质组学是一种新兴的蛋白质组学技术，其核心理念在于尽可能地减少实验过程中的偏差和误差，以获取更加真实和可靠的蛋白质数据。
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IEF:利用等电点差异分离Pr 条件A:样品 SDS-PAGE:利用分子量差异分离Pr 图像分析 差异蛋白质 质谱分析 条件B:样品 确定差异点 数据搜寻蛋 白质鉴定
MAIDI-TOF
数据处理 与生物信 息学分析
ESI-MS/MS
13
2DE:Advantages & Disadvantages
• Provides a hard-copy record of separation • Allows facile quantitation • Separation of up to 3000 different proteins • Highly reproducible • Gives info on Mw, pI and post-trans modifications • Inexpensive • Limited pI range (4-8) • Proteins >150 kD not seen in 2D gels • Difficult to see membrane proteins (>30% of all proteins) • Only detects high abundance proteins (top 30% typically) • Time consuming • 30% of spots with multiple proteins from pI 4-7
基本缩略词
IEF: isoelectric focusing (等电聚焦) 2-DE：Two-dimensional gel electrophoresis
第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离； 第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开
DIGE：2-D difference Gel Electrophoresis HPLC：High-performance liquid chromatography
17
Shotgun:Advantages & Disadvantages
Advantages
• Alleviate some limitations of the 2-DE/MS method • Generally high throughput • Protein identification and quantification is straightforward • process is simple • Can be used to ID posttrans. modifications
10
PMF常用软件 Mascot: Profound: PepIdent: www.expasy.ch/tools ProteinProspector: PepSea: 195.41.108.38
11
常用串联质谱检索工具
SEQUEST: /sequest
Mascot: PepFrag: ProteinProspector:
12
基于2DE的差异蛋白质组分析技术流程
16
Shotgun Protein Identification
SCX column fractionation
Reverse column separation
Protein mixture
Protein digests
Auto MS/MS detection
Results BioWorks data base search Tandem MS spectra
Co-separate by 2D PAGE
Excitation wavelength 1
Disadvantages
• Requires more handling for sample isotopic labeling • Low reproducibility • Requires high level expertise • Showed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteins
优点：与传统两性电解质等电聚焦相比，具有分辨率更高、上样量更大。 分辨率可达0.001pH, 是目前分辨率最高的电泳方法 可用于等电点及其附近的蛋白质和多肽的分析、制备
20
pH 梯度范围的选择
使用宽pH范围的胶条（pH 3-10）可以在同一块凝胶上 看到样品中绝大多数的蛋白质。 将有重叠区域的窄pH梯度的胶条联合使用，也同样可 以得到整个pH 3-10范围的结果。
MS是单级质谱，适用于样品不是特别复杂的样品分析。 对于复杂样品，单级质谱会出现很多干扰峰，影响测定。
质谱仪分为进样系统、离子源、质量分析器和检测器四部分。 离子源又分为： 电子轰击源 (Electron Ionization，EI) 化学电离源 (Chemical Ionization，CI) 场致电离源 (FI) 电喷雾电离源 (Electro Spray Ionization，ESI) 等 MS/MS是串联四级杆质谱，通过两个质量分析器间的碰撞室进行 一定能量的碰撞，选择性的扫描碰撞后得到的子离子碎片，不符合 一定质量数的离子被抛弃，这就降低了背景噪音、大大提高了检测的 灵敏度和准确度。 8
14
传统的基于2DE的差异蛋白质组学分析技术
优点：
①技术路线成熟 ②重现性和直观性好 ③费用较低 ④展示差异蛋白质的PI和Mw
缺点：
①蛋白质共迁移(comigration)问题，不适合于很复杂的样品
②线性动态范围较窄 ③强疏水性，强硷性，分子量过大(150kD）的 蛋白质受到限制
15
基于Shotgun差异蛋白质组分析技术流程
1 mM EDTA, 1 mM EGTA
22
2-D Difference Gel Electrophoresis (DIGE)
Protein extract 1 Label with fluor 1 Mix labeled extracts Protein extract 2 Label with fluor 2
基本缩略词
ESI-MS：Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy，
电喷雾质谱
MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/
Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱， 是一种新型的软电离生物质谱
ห้องสมุดไป่ตู้
MALDI-TOF-TOF：基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱
MALDI-Q-TOF：基质辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱
LC-ESI-MS/MS: 高效液相色谱-电喷雾串联质谱
9
基本缩略词
PMF： Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹谱)，
是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的
蛋白酶抑制剂 PMSF（很常用，使用 浓度为1mM） 多肽水解蛋白抑制剂， 如： 1. 亮肽素leupeptin 2. 抑肽素pepstatin 3. 抑肽酶aprotinin 4. 苯丁抑制剂bestain 有效抑制的酶 不可逆抑制剂，抑制： 1. 丝氨酸水解酶 2. 一些般胱氨酸水解酶 1. 亮肽素抑制多种丝氨 酸和半胱氨酸蛋白酶 2. 抑肽素抑制天冬氨酸 蛋白酶 3. 抑肽酶抑制许多丝氨 酸蛋白酶 4. 苯丁抑制剂抑制氨基 酸多肽酶 抑制金属蛋白酶 缺点 在含水溶液中很快失活 毒性大 价格昂贵 为小分子多肽，在双向 电泳结果中出现 抑肽素pepstatin在pH 为9 时不能起抑制作用
血浆、血清、体液蛋白质组学 研究及其应用
E-mail: mliu-hncq@ Tel: 6848-5184
1
柳满然 Ph.D
蛋白组学基本知识 血浆、血清蛋白组学
唾液蛋白组学 尿液蛋白组学 脑、脊液蛋白组学
2
一、蛋白组学基本知识
3
蛋白质组(proteome = protein + genome): 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的 全套蛋白质 蛋白质组学（proteomics) 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化 规律的科学
or high-pressure liquid chromatography (高压液相色谱法)
iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素标记相对和绝对定量 7
基本缩略词
MS：Mass Spectroscopy (质谱)
因为绝大多数蛋白聚焦在pH 3-10的中间区域，所以研 究人员有时选用非线性梯度的胶条，这种胶条将两端 的pH梯度压得很窄，却可以使中间区域的蛋白质得到 较好的分离。
将窄 pH 梯度的线性 IPG 胶条重叠使用，效果要比用非 线性胶条好得多，它可以检测出样品中更多的蛋白质 斑点。
21
常用蛋白酶抑制剂
19
IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相pH梯度等电聚焦)
建立于20世纪80年代，一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸 或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定，在滴定终点形成pH梯度并参与 丙烯酰胺的共价聚合。
特点：形成固定的、不随环境电场等条件变化的pH梯度
18
Sensitivity and dynamic range of protein analysis methods
Sensitivity Bio-Safe coomassie G-250 stain Coomassie Blue R-250 stain Silver stain kit 5-10ng 10-25ng 0.5-1ng
MAIDI-TOF
数据处理 与生物信 息学分析
ESI-MS/MS
13
2DE:Advantages & Disadvantages
• Provides a hard-copy record of separation • Allows facile quantitation • Separation of up to 3000 different proteins • Highly reproducible • Gives info on Mw, pI and post-trans modifications • Inexpensive • Limited pI range (4-8) • Proteins >150 kD not seen in 2D gels • Difficult to see membrane proteins (>30% of all proteins) • Only detects high abundance proteins (top 30% typically) • Time consuming • 30% of spots with multiple proteins from pI 4-7
基本缩略词
IEF: isoelectric focusing (等电聚焦) 2-DE：Two-dimensional gel electrophoresis
第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离； 第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开
DIGE：2-D difference Gel Electrophoresis HPLC：High-performance liquid chromatography
17
Shotgun:Advantages & Disadvantages
Advantages
• Alleviate some limitations of the 2-DE/MS method • Generally high throughput • Protein identification and quantification is straightforward • process is simple • Can be used to ID posttrans. modifications
10
PMF常用软件 Mascot: Profound: PepIdent: www.expasy.ch/tools ProteinProspector: PepSea: 195.41.108.38
11
常用串联质谱检索工具
SEQUEST: /sequest
Mascot: PepFrag: ProteinProspector:
12
基于2DE的差异蛋白质组分析技术流程
16
Shotgun Protein Identification
SCX column fractionation
Reverse column separation
Protein mixture
Protein digests
Auto MS/MS detection
Results BioWorks data base search Tandem MS spectra
Co-separate by 2D PAGE
Excitation wavelength 1
Disadvantages
• Requires more handling for sample isotopic labeling • Low reproducibility • Requires high level expertise • Showed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteins
优点：与传统两性电解质等电聚焦相比，具有分辨率更高、上样量更大。 分辨率可达0.001pH, 是目前分辨率最高的电泳方法 可用于等电点及其附近的蛋白质和多肽的分析、制备
20
pH 梯度范围的选择
使用宽pH范围的胶条（pH 3-10）可以在同一块凝胶上 看到样品中绝大多数的蛋白质。 将有重叠区域的窄pH梯度的胶条联合使用，也同样可 以得到整个pH 3-10范围的结果。
MS是单级质谱，适用于样品不是特别复杂的样品分析。 对于复杂样品，单级质谱会出现很多干扰峰，影响测定。
质谱仪分为进样系统、离子源、质量分析器和检测器四部分。 离子源又分为： 电子轰击源 (Electron Ionization，EI) 化学电离源 (Chemical Ionization，CI) 场致电离源 (FI) 电喷雾电离源 (Electro Spray Ionization，ESI) 等 MS/MS是串联四级杆质谱，通过两个质量分析器间的碰撞室进行 一定能量的碰撞，选择性的扫描碰撞后得到的子离子碎片，不符合 一定质量数的离子被抛弃，这就降低了背景噪音、大大提高了检测的 灵敏度和准确度。 8
14
传统的基于2DE的差异蛋白质组学分析技术
优点：
①技术路线成熟 ②重现性和直观性好 ③费用较低 ④展示差异蛋白质的PI和Mw
缺点：
①蛋白质共迁移(comigration)问题，不适合于很复杂的样品
②线性动态范围较窄 ③强疏水性，强硷性，分子量过大(150kD）的 蛋白质受到限制
15
基于Shotgun差异蛋白质组分析技术流程
1 mM EDTA, 1 mM EGTA
22
2-D Difference Gel Electrophoresis (DIGE)
Protein extract 1 Label with fluor 1 Mix labeled extracts Protein extract 2 Label with fluor 2
基本缩略词
ESI-MS：Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy，
电喷雾质谱
MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/
Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱， 是一种新型的软电离生物质谱
ห้องสมุดไป่ตู้
MALDI-TOF-TOF：基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱
MALDI-Q-TOF：基质辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱
LC-ESI-MS/MS: 高效液相色谱-电喷雾串联质谱
9
基本缩略词
PMF： Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹谱)，
是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的
蛋白酶抑制剂 PMSF（很常用，使用 浓度为1mM） 多肽水解蛋白抑制剂， 如： 1. 亮肽素leupeptin 2. 抑肽素pepstatin 3. 抑肽酶aprotinin 4. 苯丁抑制剂bestain 有效抑制的酶 不可逆抑制剂，抑制： 1. 丝氨酸水解酶 2. 一些般胱氨酸水解酶 1. 亮肽素抑制多种丝氨 酸和半胱氨酸蛋白酶 2. 抑肽素抑制天冬氨酸 蛋白酶 3. 抑肽酶抑制许多丝氨 酸蛋白酶 4. 苯丁抑制剂抑制氨基 酸多肽酶 抑制金属蛋白酶 缺点 在含水溶液中很快失活 毒性大 价格昂贵 为小分子多肽，在双向 电泳结果中出现 抑肽素pepstatin在pH 为9 时不能起抑制作用
血浆、血清、体液蛋白质组学 研究及其应用
E-mail: mliu-hncq@ Tel: 6848-5184
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柳满然 Ph.D
蛋白组学基本知识 血浆、血清蛋白组学
唾液蛋白组学 尿液蛋白组学 脑、脊液蛋白组学
2
一、蛋白组学基本知识
3
蛋白质组(proteome = protein + genome): 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的 全套蛋白质 蛋白质组学（proteomics) 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化 规律的科学
or high-pressure liquid chromatography (高压液相色谱法)
iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素标记相对和绝对定量 7
基本缩略词
MS：Mass Spectroscopy (质谱)
因为绝大多数蛋白聚焦在pH 3-10的中间区域，所以研 究人员有时选用非线性梯度的胶条，这种胶条将两端 的pH梯度压得很窄，却可以使中间区域的蛋白质得到 较好的分离。
将窄 pH 梯度的线性 IPG 胶条重叠使用，效果要比用非 线性胶条好得多，它可以检测出样品中更多的蛋白质 斑点。
21
常用蛋白酶抑制剂
19
IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相pH梯度等电聚焦)
建立于20世纪80年代，一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸 或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定，在滴定终点形成pH梯度并参与 丙烯酰胺的共价聚合。
特点：形成固定的、不随环境电场等条件变化的pH梯度
18
Sensitivity and dynamic range of protein analysis methods
Sensitivity Bio-Safe coomassie G-250 stain Coomassie Blue R-250 stain Silver stain kit 5-10ng 10-25ng 0.5-1ng