甘肃省沙门氏菌菌型分布及耐药性监测分析
沙门氏菌检验及分析
沙门氏菌检验及分析一、简介沙门氏菌是一种能引起人类和动物肠道感染的细菌，也可以引起食品中毒。
它主要通过食品、饮用水和接触感染物传播。
对于食品中的沙门氏菌进行检验和分析，对保障食品安全至关重要。
二、检验方法1.纳氏肠杆菌培养基法用纳氏肠杆菌培养基法检验食品中的沙门氏菌，是一种常用的方法。
它利用富含养分的培养基，使得沙门氏菌能够在培养基中迅速生长，并形成典型的菌落。
检验人员可以根据菌落的形态、颜色和大小等特征来识别沙门氏菌的存在。
2.血液平板培养法血液平板培养法是另一种常用的检验方法。
将待测样品涂抹在富含养分的血液平板上，再将平板置于恒温培养箱中培养一段时间，观察是否有典型的沙门氏菌菌落的产生。
3. PCR法PCR法是一种较为快速、敏感的检验方法。
通过PCR技术可以快速对样品中的沙门氏菌进行检测，结果准确可靠。
这种方法对实验条件和检验人员的要求较高，但可以提高检测的速度和准确性。
三、分析结果通过上述方法进行检验后，需要进行有关分析。
针对检验结果，进行有关的分析可以有效地判断食品中是否存在沙门氏菌污染，并确定污染的程度。
1. 菌落计数通过检验方法得到的菌落数可以反映食品中的沙门氏菌污染程度。
一般来说，菌落数越多，说明沙门氏菌污染越严重。
2. 菌株鉴定对分离出的菌株进行鉴定，可以确定其是否为沙门氏菌。
根据鉴定结果，可以进一步分析菌株的来源和特性。
3. 毒素检测有些沙门氏菌会产生毒素，对食品中的毒素进行检测，可以确定食品中是否存在具有毒素产生能力的沙门氏菌。
四、实验注意事项在进行沙门氏菌检验及分析时，有一些实验注意事项需要遵守。
1. 实验室操作检验和分析工作要在严格的实验室条件下进行，保证实验室内的环境洁净，避免交叉污染。
2. 操作规范操作人员要求严格遵守相关操作规程，使用消毒剂对实验仪器、培养基和工作台进行处理。
3. 实验安全在进行检验和分析实验时，要注意个人防护，避免因接触致病菌而导致感染。
五、应用领域沙门氏菌检验及分析在食品安全领域具有广泛的应用。
血培养常见病原菌的分布及耐药性分析
血培养常见病原菌的分布及耐药性分析发表时间：2015-10-28T15:37:02.410Z 来源：《医药前沿》2015年第26期供稿作者：陈娅萍安海涛[导读] 甘肃省酒泉市人民医院检验科血流感染是较严重的感染性疾病，分为菌血症、败血症及脓毒败血症。
血培养是确立血流感染诊断的重要依据。
陈娅萍安海涛(甘肃省酒泉市人民医院检验科 735000)【摘要】目的：监测分析本院血培养阳性标本中细菌分布及耐药性。
方法：采用BACTEG9120/9240全自动血培养仪对血培养标本进行检测，结果：544例标本中，分离出致病菌38株，阳性率为7.0%，其中革兰阴性杆菌占68.4%，革兰阳性球菌占31.6%。
致病菌对不同抗菌药物表现出不同程度耐药。
结论：细菌耐药形式严峻，应加强临床科室血培养的送检率，定期进行细菌分布及耐药分析，为临床治疗及疗效提供参考。
【关键词】血培养；细菌；耐药【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）26-0060-02血液感染是极其严重的全身性感染，血培养是血流感染诊断、治疗和病情监测的关键，对临床医生合理使用抗菌药物，控制血流感染具有十分重要的临床意义［1，2］。
为指导临床用药，分析我院2013年1月—12月共计544份血培养标本，同时对阳性标本进行耐药性分析，现将结果报告如下。
1.材料与方法1.1 标本来源我院住院患者标本，全部来源于血液。
标本采集严格按照临床标本采集手册要求进行。
1.2 仪器与试剂 BD公司 BACTEG9120/9240血培养仪和phoenix100全自动微生物分析系统及配套鉴定药敏卡。
质控菌株大肠希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌29213、粪肠球菌ATCC 29212，均由卫生部临床检验中心提供。
1.3方法由临床科室根据患者病情无菌采集静脉血，成年人8～10ml，儿童１～３ml，采集后送检微生物室，置全自动BACTEG9120/9240动血培养仪进行培养。
食品中沙门氏菌测定能力验证和关键控制点分析
食品中沙门氏菌测定能力验证和关键控制点分析摘要：沙门氏菌是一种常见的食源性病原菌，能导致食物中毒，对人类健康构成威胁。
为了确保我国食品的卫生安全，本研究对食品中沙门氏菌的检测能力进行了验证，分析了关键控制点，并提出了有关控制方法。
本研究旨在提高检测机构的检测水平，为食品安全监管提供技术支持关键词：食品；沙门氏菌；检测能力；关键控制点0、引言沙门氏菌在全球范围内拥有较高的食源性疾病发生率，我国食品中沙门氏菌污染状况也较为严重。
为了保障食品安全，食品安全监管部门需要加强对食品中沙门氏菌的检测和监控。
本文通过对食品中沙门氏菌检测材料及方法进行验证，并对关键控制点进行深入分析了解，为我国食品安全监管提供技术支持。
1、沙门氏菌检测材料与方法食品中沙门氏菌检测的材料与方法主要包括样品来源、试剂与仪器、检测方法等环节。
通过这些方法和步骤，可以有效地检测食品中的沙门氏菌，为保障食品安全提供依据。
食品中沙门氏菌检测的材料与方法主要包括以下几个方面：1.1样品来源从不同地区、不同品种的食品中进行随机抽取，以此为试验样品。
常见的食品类别包括肉类、禽类、水产制品、蔬菜水果等。
1.2试剂与仪器（1）试剂：①营养琼脂：用于沙门氏菌的培养和分离纯化；②沙门氏菌显色培养基：用于沙门氏菌的分离和初步鉴别；③生化鉴定试剂盒：用于沙门氏菌的生化实验；④缓冲蛋白胨水：用于食品中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的前增菌培养；⑤四硫酸盐胱氨酸增菌液：用于沙门氏菌选择性增菌培；⑥亚硫酸铋琼脂：用于沙门氏菌特别是伤寒沙门氏菌的选择性分离培养；⑦HE琼脂培养基：用于肠道致病菌特别是沙门氏菌和志贺氏菌的选择性分离培养；⑧木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂：用于沙门氏菌和志贺氏菌的分离培养。
（2）仪器：①生化培养箱：方便沙门氏菌培养和增菌的场所；②高压蒸汽灭菌锅：用于培养基的灭菌；③显微镜：用于观察沙门氏菌的形态；④离心机：用于样品的分离和纯化。
1.3检测方法（1）前增菌：将食品样品接种到含有营养的非选择性培养基中，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。
沙门氏菌耐药性研究进展
沙门氏菌耐药性研究进展张庆贺;张丹俊;李槿年;沈学怀;潘晓成;赵瑞宏【摘要】沙门氏菌是常见的引起肠道疾病的人畜共患病原菌.随着抗菌药物的大量使用,沙门氏菌的耐药性逐渐增强,多重耐药菌株的比例不断上升,严重影响人类和动物的健康.综述了对沙门氏菌的耐药机制和国内部分地区所分离沙门氏菌的耐药性现状等.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2018(046)017【总页数】3页(P27-29)【关键词】沙门氏菌;耐药性;耐药机制;耐药性现状【作者】张庆贺;张丹俊;李槿年;沈学怀;潘晓成;赵瑞宏【作者单位】安徽农业大学,安徽合肥230036;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽农业大学,安徽合肥230036;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031【正文语种】中文【中图分类】S852.6沙门氏菌是革兰氏阴性、兼性、胞内细菌，常引起人类和动物疾病的发生[1]。
自1885年Salmon和Smith分离到猪霍乱沙门氏菌以来，已经发现了超过2 500种血清型，沙门氏菌属被分为邦戈尔沙门氏菌和肠道沙门氏菌2种，其中绝大多数属于肠道沙门氏菌[2-3]。
研究表明，在全世界不同地区的食物中毒事件中，每年因沙门氏菌感染引发的伤寒病例约有1 600万例，胃肠炎约13亿例，其中约300万例因沙门氏菌死亡[4]。
近几十年来，在动物饲料中大量使用抗生素作为生长促进剂和治疗药物，使沙门氏菌的耐药性逐渐增强，增加了沙门氏菌对人类和动物健康的威胁[5]。
研究发现，病原菌的耐药性对食源性传染病的发病率上升起着重要的作用[6]。
细菌耐药性是近年来临床治疗的棘手问题，越来越受到人们的重视。
鉴于此，笔者对沙门氏菌的耐药机制以及国内部分地区的沙门氏菌耐药性现状进行综述。
1 沙门氏菌耐药机制细菌对抗生素产生耐药性可分为固有耐药性和获得耐药性。
沙门氏菌耐药谱分析
2018年第1期扫一扫看全文本文DOI：10.16675/14-1065/f.2018.01.039沙门氏菌耐药谱分析□杨满军张彩峡摘要：沙门氏菌耐药症状已经成为了现今医学界的一大难题，切实的解决这个问题对提高人类、牲畜的生命周期，增强生命质量都有着重要意义。
鉴于此，本文对沙门氏菌耐药性进行分析，阐述沙门氏菌耐药的含义着手，针对耐药基因的分类与检验方法，通过分析不同动物源沙门氏菌对药物的耐药率，旨在为了更好的提升现今解决沙门氏菌耐药能力的质量献力。
关键词：沙门氏菌；耐药性文章编号：1004-7026（2018）01-0068-01中国图书分类号：TS207.4文献标志码：A（西藏职业技术学院动物科技学院西藏拉萨850030）随着我国医学技术的不断进步，解决了很多以前没能够解决的疾病。
近些年来，沙门氏菌的肆虐对人类和牲畜的影响极大，为了解决这一问题，在医学领域中提出了，利用抗生素进行治疗的办法，但是这种办法虽然在一定程度上能够遏制病菌，但是却导致了新的问题。
由于抗生素的使用，病体对药物产生了抗体。
因此，筛查沙门氏菌耐药谱成为现今较热的话题，而疾病如何进行治疗，成为相关学者应深思的问题。
1沙门氏菌耐药的含义沙门氏菌的病原体，是属肠杆菌科的革兰氏阴性肠道杆菌。
这种病菌可以引起人体的发热、腹泻、肠胃炎、败血症等疾病，除了感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鱼、爬行类、鸟、两栖类及昆虫[2]。
沙门氏菌中有的病菌专对人类致病，有的病菌只对动物致病，也有病菌对人和动物都致病。
目前在对这种病菌进行医治的办法就是注射抗生素，但是由于抗生素注射过量，就会使体内的病菌对抗生素产生抵抗力，就是医学上常说的耐药性。
2耐药基因的分类与检验方法耐药基因一共可以分为三类：内酰胺类耐药基、喹诺酮类抗生素耐药基因和氨基糖苷类抗生素耐药基因。
在抗生素的耐药性上，除了基因的突变，甚至出现了更加危险的情况，随着耐药性的不断升高，有抗体的可移动基因元件，可以进行耐药性的传播，造成基因能够转移的现象。
64例沙门氏菌血培养分离株中各型分布及药敏分析
Ｊｕ ａ ｏ ｉｔ ｙＳｒｅｎｉ ｏ ｔ ｅｔ ｈ ａＡ ｇ ｏ ｒ ｌ ｆ ｌａ ｕｇｏ Ｓｕｈ ｓＣ ｉ ｕ ｎ Ｍ ｉｒ ｎ ｗ ｎ
【 关键词】 发热病人 ； 血培养阳性 ； 沙门氏茵感染；甲型副伤寒 ； 药敏分析
【 中图分 类号】 Ｒ５６３ １． 【 文献标识码 】 Ｂ 【 文章编号 】 １７￣１３ ２０ ）４ ００ Ｏ ６２ ９ （０７ ０－ ５ 一 ２ ０
表 ２ ８株 甲型副伤寒药敏分析 （ ５ Ｋ－Ｂ法 ）
６ ４例沙 门氏菌血培养分离株中各型分布及药敏分析
罗成富 杜 ， 燕
（ ．云南公安边防总队医院检验科 ；．昆 明医学院第一 附属 医院检验科 ， １ ２ 云南 昆 明 ６０ ３ ） ５０ ２
析指 导临床 用药。方法
【 摘要 】 目的 通过分析 沙门氏感染病人血培养分 离株 中各型分布及 药敏情况， 出其主要 流行 趋势并结合 药敏分 找 采用 ＶＴ ＫＩ微 生物 自动培养 系统进行 ／ 培养 ； ＩＥ Ｉ ｎ ． 转种 阳性报 警者到血 平板和 麦康凯平板 ３ ， ７
平板 、 药敏纸片、 氏双糖铁管 。试剂耗 材均 由杭州天和生物制 克
品有限公 司提供 。 １３ 方法 ．
表 ３ ６ 甲型副伤寒药敏分析 （ Ｂ法 ） 株 Ｋ—
无菌采集 临床发热病人静脉血 １ ｍ 于 自动 ０ｌ
１３ １ 标本处理 ．．
培养瓶上 ＶＴ ＫＩ ＩＥ Ｉ自动培养 。
（ Ｍ ） 阿莫西林／ Ａ Ｐ、 棒酸（ Ｍ ） 氯霉素（Ｈ ） Ａ Ｃ、 Ｃ Ｌ 的敏感率在９ ％以上。结论 本组沙门氏茵的感染流行主要 以甲型副伤 ５
沙门氏菌的临床分离与耐药性检测的封皮摘要
天津农学院毕业论文中文题目:沙门氏菌的临床分离与耐药性检测英文题目: Isolation of Salmonella and theDetection of Resistance for Salmonella学生姓名系别专业班级指导教师成绩评定2012年６月目录1 前言 (1)1.1 病原与流行病学 (1)1.1.1 病原 (1)1.1.2 流行病学 (2)1.2 研究的目的和意义 (2)2 试验材料与方法 (3)2.1 实验仪器 (3)2.2 实验材料 (3)2.3 实验方法 (4)2.3.1 临床分离 (4)2.3.1.1 样本的采集 (4)2.3.1.2 病原菌的分离纯化 (4)2.3.1.2 生化鉴定 (4)2.3.2 耐药性检测 (5)2.3.2.1 培养基的制备 (5)2.3.2.2 药敏试验 (5)3 结果与分析 (5)3.1 菌落特征 (5)3.2 生化鉴定 (6)3.3 药敏试验 (7)4 讨论 (9)4.1 沙门氏菌的分离鉴定 (9)4.2 耐药性检测的影响因素 (9)5 结论 (10)参考文献 (11)致谢 (12)附录1外文文献原文 (13)附录2外文文献中文译文 (17)摘要沙门氏菌(Salmonella)为肠杆菌科沙门氏菌属成员，是一类条件性细胞内寄生的革兰氏阴性肠杆菌，绝大多数对人和动物有致病性，主要引起发热、胃肠炎、腹泻和败血症等，是世界上引起食物中毒最多的病原菌。
由于疾病治疗及抗菌素类饲料添加剂的不断使用，各个国家的沙门氏菌耐药性传播迅速，成为全球关注的公共卫生问题。
中国是养猪大国，因此猪沙门氏菌病应受到特别的关注。
本研究取患病猪结肠内容物进行细菌的分离鉴定。
通过鉴别培养、染色及细菌的生化鉴定，确定为一株沙门氏菌，并对分离到的沙门氏菌进行耐药性检测，鉴定其对21种临床用抗菌药物的敏感性试验。
其中分离株对氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物高度敏感，对临床指导用药提供了依据。
沙门氏菌的临床分离与耐药性检测
沙门氏菌临床分离与耐药性检测X X（天津农学院动物科学系）1 引言沙门氏菌（Salmonella）这一名称是为了纪念美国兽医师丹尼尔．E．沙门（Daniel E Salmon）而命名的，他于1885年首次分离到猪霍乱沙门氏菌。
沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。
沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生动物不同形式的总称。
感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。
据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。
我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。
沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。
它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。
人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力[1]。
1.1 病原与流行病学1.1.1 病原沙门氏菌属是肠杆菌科中的一个重要成员，是一大属血清学相关的革兰氏阴性杆菌，不产生芽孢，亦无荚膜。
大小为0.7～1.5μm×2.0～5.0μm，间有形成短丝状体。
除鸡白痢沙门氏菌（S. pullorum）（又称雏沙门氏菌）和鸡伤寒沙门氏菌（S．gallinarum）（又称鸡沙门氏菌）无鞭毛不运动外，其余各菌均以周生鞭毛运动，且绝大多数具有Ⅰ型菌毛。
沙门氏菌的培养特性与埃希氏菌属相似。
在普通培养基上生长良好，需氧及兼性厌氧，培养适宜温度为37 ℃，pH7. 4～7.6。
只有鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、羊流产沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌等在肉汤琼脂上生长贫瘠，形成较小的菌落。
在肠道杆菌鉴别或选择性培养基上，大多数菌株因不发酵乳糖而形成无色菌落，本菌属在培养基上有S-R变异[2]。
1.1.2 流行病学沙门氏菌属中的许多类型细菌对人、畜以及其他动物均有致病性。
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甘肃省沙门氏菌菌型分布及耐药性监测分析
目的了解沙门氏菌属腹泻在甘肃省的流行、变迁及耐药状况，提高防治措施的针对性，避免抗生素的滥用。
方法对分离的菌株进行了生化试验、血清学鉴定及抗生素的敏感试验。
结果共分离沙门氏菌21株，其中鼠伤寒沙门氏菌12株占57.14%。
对10种抗生素的敏感试验，头孢噻肟、庆大霉素、头孢噻吩、环丙沙星敏感率分别为100%、95.24%、76.19%、66.67%，对其他6种抗生素的耐药率在14%～95%以上，而且表现为多重耐药，耐药种类达9种。
结论甘肃省鼠伤寒沙门氏菌成为优势菌型，分离菌株为多重耐药，建议我们临床用药以头孢噻肟为最好，其次为庆大霉素。
标签：沙门氏菌；血清分型；抗生素敏感率；监测
沙门氏菌是一种重要的人畜共患病，是引起感染性腹泻和食物中毒的重要致病菌[1]，由于抗生素的广泛滥用，使耐药率逐年增加。
为掌握甘肃省沙门氏菌腹泻发病趋势及耐药谱等，我们于2010年～2013年按照监测方案要求在甘肃省开展了沙门氏菌的监测，现将4年的监测结果分析如下。
1 资料与方法
1.1菌株来源腹泻监测点分离沙门氏菌共21株（兰州市12株、武威市7株、天水市1株、定西市1株）。
1.2标准菌株药敏试验用标准菌株的大肠埃希氏菌ATCC25922，购买于卫生部药品生物制品检定所。
1.3生化试验采用常规法接种微量生化管，由杭州微生物试剂有限公司生产。
1.4药敏试验药敏纸片、M-H培养基，均由杭州微生物试剂有限公司生产。
用ATCC25922作质控菌。
采用WHO推荐的K-B纸片法，参照CLSI/NCCLS抗微生物药物敏感性试验执行标准（2006年版）进行判断。
试验所选抗生素为氨苄西林（AMP）、阿莫西林（AMC）、头孢噻吩（CFT）、头孢噻肟（CTX）、庆大霉素（GEN）、萘啶酸（NAL）、环丙沙星（CIP）、四环素（TET）、利福平（RFA）、复方新诺明（SMZ）。
1.5沙门氏菌诊断血清由宁波天润生物药业有限公司生产，在有效期内使用。
2 结果
2.1生化试验21株沙门氏菌生化结果：甘露醇+、葡萄糖产酸+、麦芽糖+、枸橼酸盐+、H2S+、赖氨酸脱羧酶+、精氨酸双水解酶+、鸟氨酸脱羧酶+、动力
+；靛基质-、尿素-、V-P-、蔗糖-、乳糖-。
2.2血清型分布2010年2月～2013年10月，在腹泻病监测点共检测到沙门氏菌21株。
经血清学分型鉴定，分属于B、C1、C2 、D1 、4个群别4种血清型，除哈达尔沙门氏菌少见外，其余均属于常见的菌株。
其中鼠伤寒沙门氏菌12株占57.14%、其次为肠炎沙门氏菌6株占28.57%、婴儿沙门氏菌2株占9.52%、哈达尔沙门氏菌1株4.76%（本菌在甘肃省首次检出）。
2.3药敏试验结果21株沙门氏菌对10种抗生素的敏感率占前4位的依次为：头孢噻肟100%、、庆大霉素95.24%、头孢噻吩76.19%、环丙沙星66.67%，对其他6种抗生素的耐药率在14%～95%以上，而且表现为多重耐药。
见表1。
3 讨论
本次检测到21株沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌12株占57.14%。
鼠伤寒沙门氏菌是引起食物中毒的主要致病菌型之一，80年代我省某两地区由鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒有两起，两起均吃了病死马肉而引起食物中毒，从剩马肉和患者粪便中分离到鼠伤寒沙门氏菌。
食源性疾病对人类健康危害很大，据统计，全球70%儿童腹泻病例是由各类致病微生物污染了食品和飲水所致[2]。
唐秀春等报道2004年8月14日信阳县某地因食用病死熟猪肉发生一起食物种毒，有75例出现中毒症状。
从剩余熟肉和粪便中分离到鼠伤寒沙门氏菌。
苏民彦等报道2007年6月30日，齐齐哈尔市郊区某饭店发生一起食物种毒，餐后99例发病，79例住院。
经流行病学调查、实验室检测确认因食用系鼠伤寒沙门氏菌污染烧鸡所致。
由于抗生素的广泛应用，导致耐药菌株的不断增多。
4年监测的沙门氏菌对头孢噻肟最敏感100%、庆大霉素95.24%、头孢噻吩76.19%、环丙沙星66.67%耐药较低，其余均对多种抗生素耐药。
这有可能与抗生素的滥用有关。
其耐药机制主要与细菌间存在耐药因子（R因子）不断相互传递有关，R因子具有复制能力，使菌产生或加强破坏抗菌药物的酶系，可在体内外以及细菌种内或种外间进行传递。
本次检测21株沙门氏菌耐药种类达9种。
药敏结果分析，21株菌对头孢类敏感、氨基糖甙类和喹诺酮类较为敏感，与国内其它省市报道的基本一致。
耐药菌株的不断增多，给防治带来困难。
据统计国际住院患者使用抗生素平均约为30%，美国为20%，而我国为67%～80%[3]，存在滥用抗生素情况。
因此，各地应根据当地的药物敏感谱，在临床用药时选用有效抗生素，以减少耐药菌株的产生。
同时提示我们临床用药以头孢噻肟最好。
警惕沙门氏菌的感染，提高认识，强化疫情报告制度；加强食品卫生监督管理工作；加强饮食卫生的宣传教育，不吃病、死畜禽的肉类及内脏、不喝生水；加强抗生素使用管理；找出流行病学原因是控制沙门氏菌感染的关键步骤。
参考文献：
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