中药中黄曲霉毒素检测方法研究
中药材中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2测定方法研究
ＭＳ ／ ＭＳ ）ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｆ ｌ ａ ｔ ｏ ｘ ｉ ｎ ｓ Ｂ １ ， Ｂ ２ ， Ｇ ｌ ａ ｎ ｄ Ｇ ２ ｉ ｎ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｈ ｅ ｒ ｂ ｓ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ａ ｔ ｆ ｅ ｒ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｙ ７ ０ ％ ｍｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｌ
关键词 ： 中药材 ； 黄 曲霉毒素 ； 免疫亲和柱净化 ； 高效液相 色谱分 离 一串联三重四级杆质谱
中图 分 类 号 ： １ １ ２ ８ ４ ． １ ： １ １ ２ ８ ２ ． ７ １ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ６— ４ ９ ３ １ （ ２ ０ １ ５ ） １ ０—０ ０ ５ ７—０ ３
材样本 经 ７ ０ ％ 甲醇溶液提 取 ， 并采用免 疫亲和柱净化和 浓缩后 ， 以Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ—ＭＳ ／ ＭＳ对 ４个黄 曲霉毒 素的含量进行测 定。 结果 黄 曲霉
毒 素 和 Ｂ 进样量在 ０ ． ３～ ３ ０ Ｐ ｇ 、 黄 曲霉 毒 素 Ｇ 。 和Ｂ 进 样 量在 １ ～１ ０ ０ Ｐ ｇ范 围 内 与峰 面积 呈 良好 线性 关 系 （ ｒ ＞０ ． ９ ９ ９ ０ ） ， 加 样 回收 率为 ７ ５ ． ３ ３ ％ ～９ ２ ． ２ ９ ％。 结 论 该 法速 度 快 、 操 作 简便 、 灵敏度 高、 重复性好 ， 适 用 于 中药 材 中霉 菌 毒 素 的检 测 。
ｓ ｅ ｎ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ ， ｂ ｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｂ ｌ ｅ ａ ｎ ｄ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ａ ｌａ ｆ ｔ ｏ ｘ ｉ ｎ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｈ ｅ ｒ ｂ ｓ ．
陈皮中黄曲霉毒素的测定法_液相条件摸索
测黄曲霉毒素方法：一．（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul(2)色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)533 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5: 125: 5: 125 (ng/ml)602 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5: 10: 2.5 (ng/ml)603（二）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.5ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)544 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25: 1:0.25 (ng/ml)545色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25: 1:0.25 (ng/ml) cromasil150柱604（三）（1）色谱条件色谱柱：依利特C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.3ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)594 (四)（1）色谱条件（到此方法时，荧光灯的灯能量快不行了。
峰面积也受影响了。
）色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)534 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25:1:0.25 (ng/ml)535 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10:2.5:10:2.5 (ng/ml)598（五）（1）色谱条件（从这一步开始，换了新的荧光灯）色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.6ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5:10:2.5 (ng/ml)611（六）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.5ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5: 1.25:5:1.25. (ng/ml)608 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5:10:2.5(ng/ml) cromasil150柱609（七）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.3ml/min进样量：20ul(2)色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25:1:0.25 (ng/ml).597（八）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：水（45:55）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5:1.25:5:1.25 (ng/ml)538 陈皮样品色谱图（一）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56））荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.6ml/min进样量：20ul（2）陈皮色谱图2个重复616617（二）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：水（45:55）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长455nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）陈皮色谱图541（十）分析结果一览表结论：药典中关于黄曲霉毒素的测定法，步骤比较简单。
中药材中黄曲霉毒素的检测
黄曲霉毒素 B1 标准品
黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 混标 （GB/T 5009.23-2006） 标准品 Athena C18-WP 液相色谱柱 优级纯氯化钠，ACS-ISO，≥ 99.5% SPE 小柱连接件【1，3，6mL】，PP 材质 CNW 12 位固相萃取真空装置 亲水 PTFE 针式滤器 2ml 无针注射器 3ml 塑料巴斯德吸管、160mm、未灭菌
3mL，20 支 / 盒 (4℃ -8℃保存 ) 1mL，25 支 / 盒 (4℃ -8℃保存 ) 3mL，20 支 / 盒 (4℃ -8℃保存 )
3 mg/L 乙腈，1mL 于 Certan Vial
不同浓度于乙腈，1 ml 于 Certan Vial 4.6*150mm，5um 500g 12 个 / 包 12 位 13mm*0.22um，金色，100 只 / 罐 100 只 / 包 500/ 箱 2ml，12*32mm，9mm，100 只 / 盒
安谱实验推出 Beacon 黄曲霉毒素总量免疫亲和柱用于中药材（僵蚕，酸枣仁，陈皮，桃仁）中的黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 的检测 , 方法简单易行 , 回收率高。
一 . 前处理方法
1. 称取供试品粉末约 5g( 过二号筛 ) 于 50ml 离心管中，加入氯化钠 1g； 2. 加入 70％甲醇溶液 25ml，高速混匀震荡 5 分钟，离心 5 分钟 ( 离心速度 4000 转／分钟 )； 3. 量取上清液 15ml，置 50ml 容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀； 4. 用玻璃纤维滤纸滤过； 5. 量取滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，用去离子水 20ml 淋洗，淋洗液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用 1.5ml 甲醇洗脱，收 集洗脱液，待测。 6. 取洗脱液 500ul，加入 500ul 去离子水，混匀后待测。
中药黄曲霉毒素含量测定及限度标准的研究
性 很 高 ， 热 到 ２０Ｃ才 能 发 生 裂 解 破 坏 ， 般 的水 加 ８￣ 一
洗 、 热炮 制等对 其 含 量 影 响 不大 ， 加 因此 ， 中药 材 一旦 发 生霉 变污 染黄 曲霉 毒 素 ， 很难 消 除 ， 立 中药 材 、 建 中 药 饮 片和 中药制 剂 的黄 曲霉 毒 素 限 度标 准 ， 证 临床 保
用 药 的安全 ， 具有 一定 意义 。
定 ， ｐ —３的强 酸 性 溶 液 中 才 稍 有 分解 。黄 曲霉 在 Ｈ１
毒素 在波 长 ３５ ｍ 的紫 外 光 照射 下 有 很 强 的荧 光 反 ６ｎ 应 ， Ｂ 呈蓝 紫 色 荧 光 ， Ｇ Ｂ和 ２ 、 ，和 Ｇ ２呈 黄 绿 色荧 光 ，
摘要： 中药材在加工、 贮藏、 运输的过程中， 如条件不当， 很容易发生霉变， 污染黄曲霉毒素。建立黄曲霉毒素 Ａ Ｂ 含量限度标 Ｆ。 准非常必要。可以采用酶联免疫吸附法（ＬＳ ＥＩ Ａ法）在实验研究的基础上， ， 参考食品黄曲霉毒素Ａ Ｂ 含量限度标准， Ｆ 分别建立中药
材、 中药饮片和中成药的黄曲霉毒素含量限度标准。
关键词： 中药； 黄曲霉毒素； 限度标准
在我 国 ， 曲霉 和青霉 大多 用 于制备 各种 发酵 食 品 ，
水、 己烷 、 乙醚 、 石油 醚 等 ， 溶 于 氯仿 、 而 甲醇 、 、 酮 苯 丙 等 ， 曲霉 毒 素 耐 酸 、 热 性 很 高 ， 热 到 ２０Ｃ才 能 黄 耐 加 ８￣ 发生 裂 解 破 坏 ， 加 碱 可 破 坏 毒 素 结 构 ； 如 ， 在 但 例 Ｂ ２０Ｃ 温 、 ０ ￣高 紫外线 照射 下 都 不 能 被 破 坏 ， 热 到 其 熔 加
测 物 （ 原 和抗体 ） 抗 起特 异 的免 疫 学 反应 ， 最后 用 测 定
黄曲霉毒素的检测和分析研究
黄曲霉毒素的检测和分析研究黄曲霉毒素是由黄曲霉属真菌产生的一种毒素，对人和动物具有强烈的毒性和致癌性，对食品安全和人类健康构成了威胁。
因此，开展黄曲霉毒素的检测和分析研究具有重要的现实意义。
本篇文章将从黄曲霉毒素的危害、检测方法、分析研究等方面进行探讨。
一、黄曲霉毒素的危害黄曲霉毒素是一种多环芳烃类毒素，具有高度的毒性和致癌性。
其可引起急性或慢性中毒，主要症状包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头痛、发热、肝肾损伤等。
而长期暴露于黄曲霉毒素环境下，还可能导致肝、胃、肠道、肺等多种癌症的发生。
因此，黄曲霉毒素对人和动物的健康都构成了巨大的威胁。
此外，黄曲霉毒素还对食品安全产生了负面影响。
黄曲霉毒素污染的食品，如玉米、花生、小麦等，可能会被误食，导致人类健康问题。
因此，黄曲霉毒素的检测和分析研究对于保护食品安全和人类健康至关重要。
二、黄曲霉毒素的检测方法为了确保食品安全和人类健康，需要对食品中的黄曲霉毒素进行检测。
目前，常用的检测方法主要有生物检测法和物化检测法两种。
1.生物检测法生物检测法是通过对特定微生物的反应来检测样品中黄曲霉毒素含量的方法。
常见的生物检测法包括小麦胚芽发芽试验、日本葡糖酸钠涂抹试验、蝎尾鱼毒素试验、酵母荚膜实验等。
这些方法可以通过观察生物体的反应来测定样品中的黄曲霉毒素含量，但是存在较大的误差和不确定性，需要在实验操作和数据处理方面做出很多努力。
2.物化检测法物化检测法是通过对样品所含黄曲霉毒素的物理和化学特性进行分析，确定样品中黄曲霉毒素的含量。
常见的物化检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱法、液质联用法、电化学法、荧光光谱法等。
物化检测法具有检测快速、准确性高等优点，是目前应用最广泛的检测方法。
三、黄曲霉毒素的分析研究黄曲霉毒素的分析研究对于深入了解其毒性机理、探索其防治方法具有关键作用。
目前，黄曲霉毒素的分析研究主要从以下几个方面展开：1.黄曲霉毒素的合成对黄曲霉毒素进行人工合成，可以深入了解其结构和毒性机理，并探索新的防治方法。
中药中黄曲霉毒素的测定
• 1962年，研究发现花生粉中含有一种荧光物质是导致 火鸡死亡的病因，后被证实为黄曲霉的代谢产物， 故命名为“黄曲霉毒素”。
黄曲霉毒素的化学结构
• 黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，已 分离鉴定出12种包括B1，B2，G1，G2，M1，
黄曲霉毒素的理化性质
• 稳定性： 对热稳定，分解温度300℃； 紫外线对黄曲霉毒素有一定的破坏作用； 中性和酸性溶液中很稳定， 在强碱（pH9-10）溶液中可迅速分解， 5%的次氯酸钠溶液可瞬时破坏毒素
黄曲霉毒素的危害
• 毒性极强
黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌 物，毒性比砒霜大68倍，仅次于肉毒霉素， 是目前已知霉菌中毒性最强的。
免疫亲和柱
泵ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ操作架
全自动固相萃取仪 光化学衍生器
HPLC—荧光检测器
四、我国现行法定检测方法
•提取
高速搅拌2分钟 （>11000r/min）
样品+NaCl 3g 70%甲醇75ml
离心5分钟 （2500r/min）
取上清液15ml，置 50ml量瓶中，用水 稀释至刻度
0.45μm滤膜滤 过，取续滤液 20.0ml
陈皮、大枣、柏子仁、、薏苡仁 胖大海、莲子、桃仁、槟榔、麦芽 • 动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣 • 共19种
三、黄曲霉毒素现有检测方法
• 薄层色谱法（TLC）：对仪器要求低， 但前处理繁琐，有机试剂使用量大，灵 敏度低，定量困难；
• 酶联免疫吸附法( ELlSA)：方便快捷，但 部分中药具有与黄曲霉毒素相似的化学 成分，易产生假阳性、假阴性结果。
二、黄曲霉毒素检测药典收载情况
中药黄曲霉毒素检测方法学的改良研究
世界最新医学信息文摘 2016年第16卷第98期 119投稿邮箱：sjzxyx88@·医学检验·0 引言作为一类化学结构类似的化合物，黄曲霉毒素也属于主要由黄曲霉（aspergillus flavus）、寄生曲（a.parasiticus）产生的次生代谢产物。
一般情况下，土壤、动植物、坚果等中均有存在黄曲霉毒素的可能性，尤其是会对花生、玉米等粮油产品造成污染。
黄曲霉毒素有一定的毒性，尤其是黄曲霉毒素B1所具有的毒性非常大，如果人们食用了被黄曲霉毒素污染的食物，则会对人类身体健康造成严重的威胁[1]。
由于受到一些因素的影响，如未按照要求合理保存导致受潮等情况，就会有使中药材被黄曲霉毒素污染的可能性。
为了确保人们所使用的中药材是安全的，就有必要准确地检测出中药材中黄曲霉毒素的含量。
本研究对经常使用的中药材黄曲霉毒素检测方法中的参数实施改良和优化，旨在探寻能够对中药材黄曲霉毒素进行准确检测的检测方法。
现把具体实验研究情况汇报如下。
1 材料和方法1.1 所应用的试剂与仪器选择一级纯化水；所采用的甲醇、乙腈都为色谱纯；所应用的碘都为分析纯；选用含量为1.067µg/ml 的黄曲霉素B1、含量为0.308µg/ml 的黄曲霉素 B2、含量为1.046µg/ml 的黄曲霉素G1、含量为0.296µg/ml 的黄曲霉素G2的黄曲霉毒素混合对照品；选用中药原药材——陈皮；ToxinFast ®免疫亲和柱；所应用的高效液相色谱系统为安捷伦1260液相色谱系统；VCETOR PCX 柱后衍生系统。
1.2 所设置的色谱条件色谱柱设定为PhenomenexC18(250×4.60mm，5µ)；所采用的流动相为常见的流动相——乙腈-甲醇-水(比例为35：10：55)；所设定的流速为每分钟0.8毫升。
所设定的柱温为30℃；所采用的衍生溶液为浓度为0.05%碘溶液；衍生化泵流速为每分钟0.3ml/；衍生反应器的温度设定为70℃；荧光检测器激发波长设定为365nm，荧光检测器激发发射波长设定为450nm；进样量定为2µl。
中药材中黄曲霉毒素检测方法初探
法 、柱后光衍 生法。为 中药材中黄曲霉毒 呋 喃 氧 杂 萘邻 酮 的衍 生 物 。 即 含 有一 个 双 黄 曲霉 毒 素Ｂ １ 。 素检 测进一步研究提供参考。 关键词：黄曲霉毒素；检测方法
中图 分类 号 ：Ｒ ２ ８ ４ ． １ 文 献标 识码 ：Ａ 文 章 编号 ：１ ０ ０ ５ — ８ ２ ５ ７（ ２ ０ １ ５ ）０ ９ — ０ ０ ７ ２ — ０ ２
一
的荧光点 ，无其他杂质荧光点 ，原点上
没有 任 何 残 留 的荧 光 物 质 。 黄 曲霉 毒 素 Ｂ １
性，其检 测方法主要有：薄层 色谱法 、酶 Ｑ，Ｈ１ ，Ｇ Ｍ，Ｂ ２ ａ 和 毒 醇 。黄 曲霉 毒 素 的 标 准 使 用 液 ：用 苯一 乙 腈 混 合 液 准确 稀 释
联 免 疫吸 附 法 、 荧 光光 度 法 、柱 后 碘 衍 生 基 本 结构 为二 呋 喃 环 和香 豆 素 ，Ｂｌ 是 二 氢 标 准溶 液 至每 毫 升 相 当于０ ． ２ ｇ 及０ ． ０ ４ ｇ
安 ， 当时 命 名 为 “ 火鸡事件”。１ ９ ６ １ 年发 曲霉４ 种产 生 。五 种黄 曲霉 毒素 是Ｂ １ 、Ｂ ２ 、
现 饲 料 中混 有 的 花 生粕 能 够 使 大 鼠诱 发肝 Ｇ１ 、Ｇ ２ 、Ｍ１ 。黄 曲霉 毒素 Ｍ１ 是 黄 曲霉 毒 素 ２ ． ３荧 光 光 度 法 激 发 波 长 ３ ６ ０ ｎ ｍ，发 射波 癌 ，１ ９ ６ ２ 年 鉴 定 了 这种 致 癌 物 质 ，并命 名 Ｂ １ 在体 内经 过 羟化 而衍 生 成 的代 谢 产 物 。
以Ｂ １ 的毒 性 最 强 。食 米 储 存 不 当 ，极 容 易 紫 外 光 下产 生蓝 紫 色 荧 光 ，根据 其 在 薄 层 摇 匀 ，精 密 量 取 ２ ５ ｍｌ ，通 过 免 疫 亲 和柱 ，
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
2351 黄曲霉毒素测定法
• 增加了第二法：高效液相色谱 - 串联质 谱法
• 附注：当测定结果超出限度时,采用第 二法进行确认
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
9305 中药中真菌毒素测定指导原则
• 粮谷类、种子类、油性成分多的品种应 注意黄曲霉毒素的检测
急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。 慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性
坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和 胰脏也有轻度的病变。
黄曲霉毒素的检测意义
存在极其广泛
主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自 制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。一般在热 带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比 较高。未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生， 在农作物正常的生长期中也可以形成。
灵敏度高，可用于痕量检测
检测方法详解
方法难点：
痕量分析：PPb级别，灵敏度高，要有质量保证体系：重复
性、标准曲线、随行回收、阴性样品、阳性样品、质控样品
黄曲霉毒素在样品中分布不均匀 中药样品种类多，基质各异，成分复杂，提取困难 假阳性及假阴性的排除：多种方法比较，随行空白，液
中药中黄曲霉毒素药典检测方法详解
方法来源：《中国药典》2010年版第二 增补本附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法
基本步骤
提取 过柱 洗脱 测定
提取 上样
检测流程
样品前处理
过滤除杂
免疫亲和柱 纯化
洗涤
柱后衍生、 HPLC检测
稀释 洗脱
黄曲霉毒素检测主要设备
气孔操作架
免疫亲和柱
黄曲霉毒素检测主要设备
HPLC-荧光检测器
光化学衍生器
免疫亲和柱的原理
IAC
①上样，载体上的抗 体结合样品中的待测
物①
②清洗，将杂 质冲洗干净
②
用大剂量的黄 曲霉毒素单克 隆抗体固化在 水不溶性的载 体上然后装柱 而成
③
抗待测物（半抗原）抗体
待测物（半抗原）
无关杂质
固相载体（凝胶）
③洗脱，将结合在抗体上的待测物冲洗下来 进入仪器检测
光化学衍生法：紫外光灯（254）nm照射，操 作简单，对衍生温度无要求，无需冲洗
黄曲霉毒素的衍生化
AFB1
衍生原理
紫外光灯照射
AFG1
紫外光灯照射
黄曲霉毒素的衍生化
增强B1、G1的荧光强度。
黄曲霉毒素的检测
荧光检测器，激发波长 = 360nm (或 365nm) ， 发射波长= 450nm
• 处方中含有易污染的药材以及生粉投料 的中成药品种应注意相关真菌毒素的检 测
历年中国药典标准收载状况
2015年版总则草案
9302 中药有害残留物限量制定 指导原则
• 根据具体品种和具体污染状况，参考相关 品种国外药典和各国、各国际组织相关限 量标准等规定，尽可能控制在最低范围内
• B1 限量和 B1、 B2、 G1、 G2 总和的限量
总结
黄曲霉毒素危害极大，应引起重视 检测前先多了解被检测物质和成分的性
质，了解检测方法的原理及实验中每一 步操作的目的，避免不必要的差错 检测过程中大家一定要注意安全措施的 防护，保护好自己、保护好环境
真菌毒素简介
毒素名称
毒素来源
毒性
黄曲霉毒素（常见 黄曲霉、寄生曲霉等 毒素）
黄绿青霉毒素
黄绿青霉
肝毒性 神经毒性
橘青霉毒素
橘青霉
肾毒性
黄天精和环氯素 岛青霉
肝毒性
T2毒素
拟分枝镰刀菌和梨孢镰刀 心衰、出血 菌
黄曲霉毒素的起源
第一次发现黄曲霉毒素的起源事件： 1960年，英国发现有10万只火鸡死于一种以前没见过的病，
黄曲霉毒素
显微镜下 的黄曲霉
点击录 入内容
点击录 入内容
点击录 入内容
点击录 入内容
黄曲霉毒素的检测意义
毒性极强
1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO） 的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，是一种 毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒霉素，是目 前已知霉菌中毒性最强的。
黄曲霉毒素的检测意义
毒性极强
被称为“火鸡X病”，主要症状为食欲减退，羽翼下垂，染病后 昏睡死亡，死时头脚向后伸。解剖可见肝出血、坏死，肾肿大。 再后来鸭子也被波及。追根溯源，最大的嫌疑是饲料。这些可怜 的火鸡和鸭子吃的是花生饼。花生饼是花生榨油之后剩下的残渣， 富含蛋白质，是很好的禽畜饲料。科学家们很快从花生饼中找到 了罪魁祸首，一种真菌产生的毒素。它被命名为“aflatoxin ”，就 是现在所说的黄曲霉毒素。
历年中国药典标准收载状况
2015年版正文
未查到具体品种规定是否有变化黄曲霉毒素药典检测方法详解
液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42） 衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生。 混合对照品溶液的制备：液体标液
（B1\B2\G1\G2=1\0.3\1\0.3 ug/ml）梯度稀释500 倍。 供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲 醇提取，免疫亲和柱纯化。 测定： 吸取混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、 20μl、25μl，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供 试品溶液20-25μl，测定。
质联用，关闭衍生器
结果报告
未检出
低于检测限（标出检测限）
限度内
报告具体值
限度外
报告具体值
黄曲霉毒素检测安全防护措施
应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境 黄曲霉毒素标准品禁用固体 实验全程佩戴手套 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，
应泡在专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶 液内，浸泡24小时以上 ，再用清水将玻璃器 皿冲洗干净。 流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常 规处理。
薄层层析法：灵敏度低，定量困难 HPLC-紫外检测法：不衍生，灵敏度低，
采用UPLC可以增强灵敏度 HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高
（目前药典采用此法）
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
免疫化学分析方法
酶联免疫吸附法：快速、简便、单一毒素、假阳性多 免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳性多 微柱筛选法 ：半定量，测总量 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法 ：快速、现场大批量
黄曲霉毒素的种类及性质
化学结构
B1,B2,G1,G2, M1,M2
M1是B1在体内经过羟 化而衍生成的代谢产物
M1、M2主要存在于牛奶中
B1：最常见、毒性 及致癌性最强
黄曲霉毒素化学结构式
黄曲霉毒素化学结构式
黄曲霉毒素化学结构式
理化性质
相对分子量 为312-346
难溶于水、易溶于油， 甲醇、丙酮和氯仿等有 机溶剂，但不溶于石油
药材 5
黄曲霉毒素 食用坚果、玉米、调味品 10， AlfatoxinsB 食用干制水果及其制品 4.
1,B2,G1
,G2
药材 4
药材 10
药材 10
黄曲霉毒素的种类及性质
根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为B族和G族两大类及其衍生物
1 • B族：蓝色荧光
12
2
• G族：黄绿色荧光
ACCD PPT
方法详解
操作中可能出现的问题及注意点
对照品溶液的配制 取样 ：混匀，严格按要求取样，要有代表性 提取 ：方式可比较后选择 滤过 :普通滤纸有吸附，可采用玻璃纤维滤纸或离心
方法详解
操作中可能出现的问题及注意点
净化和富集
采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗 体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成
黄曲霉毒素的检测意义
存在极其广泛
中药中容易产生黄曲霉毒素的有：种子、果实、 粮谷类中药材或含此类药材的中成药；发酵类 中药；贮存期中药材、中成药; 油性成分多的 中药材
黄曲霉毒素的检测意义
国际上对中药材中黄曲霉毒素的检测越来越多
欧盟（μg/kg）
德国
中国香港
（μg/kg） （μg/kg）
醚、己烷和乙醚中
中性溶液及弱酸性 溶液中较稳定，强 酸性溶液中稍有分 解，强碱溶液中分 解迅速
紫外线对低 浓度黄曲霉 毒素有一定 的破坏性
纯品为无色结晶.在紫 外光灯下，B1、B2发 蓝色荧光，G1、G2发 绿色荧光
耐高温，一般烹调 温度不能破坏，B1 的分解温度为 268℃
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
初筛
HPLC/MS/MS ：不衍生，灵敏度高，假阳性 少，成本高
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
色谱学方法
HPLC
LC-MS/MS
TLC
GC
黄曲霉毒素现有检测方法介绍
免疫学方法
ELISA
胶体金
历年中国药典标准收载状况
2005年增补本
附录：第一次增加了黄曲霉毒素 测定法
历年中国药典标准收载状况
原理：抗原、抗体反应， 注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水
其它注意事项：亲和柱储存、使用温度，接头、容器 洗涤
方法详解
黄曲霉毒素标液
supelco
黄曲霉毒素的衍生化
衍生原因 B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化 药典附录收载的两种衍生方法
碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求， 试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗。
2010年版一部
正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、 胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残 留量检查
附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法
历年中国药典标准收载状况
2010年版一部第二增补本： 修订了附录方法