盐法提取菠萝蛋白酶的研究
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶纯化方法总结
菠萝蛋白酶的提取方法：（1）沉淀法沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。
用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。
以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。
酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。
从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。
（2）离子交换色谱法离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。
国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。
Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。
用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。
（3）固定化金属离子亲和色谱法固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。
此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。
Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化15.4 倍，回收率达94.6%，而且不会造成任何变性。
菠萝蛋白酶的提取和活力测定
三、实验材料和试剂
1、实验材料
新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白
2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素c 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化 钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调 PH至7.0） 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L 硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）
四、实验器材和仪器
1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（2cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；
五、实验操作方法法和步骤
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将菠萝切碎
加柠檬酸钠，榨汁 冻存备用
菠萝汁
纱布过滤
酶复合物沉淀
（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量
1、标准曲线的制作 按下表操作
试管号 标准蛋白 （0.1mg/ml) 1 0 0 1.0 4 0 2 0.1 0 0.9 4 0.115 3 0.2 0 0.8 4 0.148 4 0.4 0 0.6 4 0.245 5 0.6 0 0.4 4 0.395 6 0.8 0 0.2 4 0.525 7 1.0 0 0 4 8 0 1.0 0 4
离 心
澄清液
2000r/min，7min离心 加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液 4200r/min,5min离心
钠加 溶适 液量 ，
1.5% 氯 化
酶复合物
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液， 摇匀，于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号
吸光度A
1
2
3
4
ห้องสมุดไป่ตู้
5
实验过后对结果进行分析和计算
数据的处理
1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中 蛋白酶的总质量m 2、菠萝蛋白酶活力=A/10 3、比活力=菠萝蛋白酶活力/m 4、提取率=m/菠萝的质量
应该注意的事项
1.操作过程温度的控制，确保所得的蛋 白不失活。 2.弄清所加试剂和每步操作对实验结果 的影响。 3.在酶活力的测定中，加入氢氧化钠是 为了终止反应。 4.所加酪蛋白溶液的量对实验结果有影 响。需要多次实验确定所加的量，避免 反应不完全或蛋白剩余，影响实验结果。
一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用
1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中， 可使面筋降解，生面团被软化后易于加工。 并能提高饼干与面包的口感与品质。 2、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质 的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨 基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的 精加工。 3、干酪：用于干酪素的凝结
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
背景介绍
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎中，从菠 萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白酶（FruitBromelain）， 从菠萝的茎中提取的称为茎菠蛋白酶（Stem Bromelain）。 菠萝蛋白酶的分子量为33000，是典型的巯基蛋白酶，能分 解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋 白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一 种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、 明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶 解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症； 它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中 小面积深度烧伤的治疗。这里就菠萝蛋白酶的三种提取方 法
菠萝蛋白酶的研究及应用进展
Ｎｏ．８．２００８品工业科技，２００１，１７（３）：４３－４６［１５］李霞．保加利亚乳杆菌缩浓缩培养及生化代谢规律的研究［Ｊ］．河南工业大学学报（自然科学版），２００５，２６（２）：７５－７８［１６］刘飞．罗地亚．直投型发醉剂发酵特性研究［Ｊ］．中国乳品工业，２００５，３３（１）：１１－１３［１７］郭本恒．乳品微生物［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，２００１：２３０－２３９菠萝蛋白酶的研究及应用进展吴茂玉１，２，马超３，乔旭光３，宋烨１，赵岩１（１．中华全国供销合作总社济南果品研究院，济南２５００１４；２．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京１０００９４；３．山东农业大学食品学院，泰安２７１０１８）摘要：综述菠萝蛋白酶的结构和性质，工业生产和实验室分离提纯方法及在医药和食品行业中的应用。
关键词：菠萝蛋白酶；纯化；应用中图分类号：ＴＳ２０１．２＋５文献标志码：Ｂ文章编号：１００５－９９８９（２００８）０８－００１７－０４ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｂｒｏｍｅｌａｉｎＷＵＭａｏ－ｙｕ１，２，ＭＡＣｈａｏ３，ＱＩＡＯＸｕ－ｇｕａｎｇ３，ＳＯＮＧＹｅ１，ＺＨＡＯＹａｎ１（１．ＪｉｎａｎＦｒｕｉｔＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＡｌｌＣｈｉｎａＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＳｕｐｐｌｙ＆ＭａｒｋｅｔｉｎｇＣｏ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅｓ，Ｊｉｎａｎ２５００１４；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４；３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉ＇ａｎ２７１０１８）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂｒｏｍｅｌａｉｎａｓｗｅｌｌａｓｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｒｏｍｅｌａｉｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ菠萝蛋白酶（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称，主要存在于菠萝茎和果实中，根据提取部位的不同，分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。
菠萝蛋白酶应用的性质研究
本 身 对 菠 萝 蛋 白酶 没 有 激 活 作 用 ， 能 鳌 合 酶 反 应 所 需 的 金 属 离 子 ， 酶 活 降 低 。 它 使 关键词 菠萝蛋 白酶 酶反应速 度 金 属 离 子
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔｈ ｓｐ ｐｅ ｔｄｉｓｔ ｆｅ ｔｏ ｅ ｅ ａ ａ ｔｒ ｎ ｂ ｏ ｅａｎ． ｓｒ ｃ ｉ ａ ｒｓｕ ｅ ｈｅ ｅ ｃ ｆｓ ｖ ｒ ｌｆ ｃｏ ｓｏ ｒ ｍ ｌｉ Ｔｈｅｒ ｓ ｌｓｓ ｗ ｈ ｔｔ ｐｉ ａ Ｈ ｌｅ ｆ ｅ ｔ ｎ Ｓ７． ａ ｄ ｅ ｕ ｔ ｈｏ ｔａ ｈｅ ｏ ｔ ｌｐ ｖａｕ ｏｒｒａｃ ｏ ｉ １， ｎ ｍ ｉ
适 ｐ 为 ７ １最 稳 定 的 ｐ 范 围 为 ３ ９～ ． ， 适 反 应 温 度 为 ５ ℃ ， 般 的 金 属 盐 Ｎ Ｃ 、Ｃ 对 酶 反 应 影 响 不 大 ， Ｏ２Ｃ Ｃ２ 高 Ｈ ．， Ｈ ． ４２最 ５ 一 ａ １ｋ １ Ｍｇ 、 ａ １在 浓度 下对酶 有一定程 度的抑制 作用 ， 低浓 度下影 响 不显 著 ， 胱 氨 酸在一 定 浓度 的范 围 内 ， 酶 反应 速 度有 促进 作 用。Ｅ Ｔ 在 半 对 ＤＡ
菠 萝蛋 白酶 属 巯 基蛋 白酶 类 ， 存 在 于 菠 萝 植 株 测 定 方法 ， 是 测定 其酶 活 ， 获得 最 大 酶 活 性 的 ｐ Ｈ即 为最
Ｈ。 将 酶 分 别 稀 释 在 不 同 ｐ 的 缓 冲 液 中 Ｈ 中的蛋 白水 解 酶 系 ， 在 食 品 、 药 等 行 业 中有 着 广 适 ｐ 它 医 泛的 用途 … 。 国 内大 部 分 的 生 产 是 利 用 菠 萝 罐 头 的 （ ａＨ ￣４ ６ ｓ ７ ， 温 放 置 ２ ｈ 按 酶 活 测 定 方 法 ， １ Ｎ ２ Ｉ 一Ｃ Ｈ ０ ） 等 ４，
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一．实验目的:1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性；2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。
二．实验原理：菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。
主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。
其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。
有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。
本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。
在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。
单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。
采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
菠萝中蛋白酶的提取研究
烬８０ 髓６０
４０ ２０
２
口Ｈ值 田ｌ 不周ｐＨ值环境对菠萝蛋白酶活力的影响
２．２ ｐＨ值对菠萝中的菠萝蛋白酶活力的影响 虽然菠萝的ｐＨ值为３．５左右，但菠萝蛋白酶
的最适ｐＨ值并不一定是３．５，酶活性的测定应在最 适ｐＨ值下进行。取菠萝汁加水稀释，分装于７支试 管中，分别用乳酸或ＮａＯＨ溶液调ｐＨ成ｐＨｌ．７，测 定各ｐＨ下的蛋白酶活力，即可得到ｐＨ对酶活性 的影响结果，见图２。
采用正交实验,运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶,对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究,并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定.
5.期刊论文 李兴.林哲甫 某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响 -药物生物技术2001,8(6)
当温度恒定时A,菠萝中菠萝蛋白酶的热失活过程遵循一级蜕变规律:d[E]/dt=-Kd.t,失活半寿期是常数,可以用作衡量菠萝蛋白酶热稳定性的指标.某 些羧酸盐和金属离子能明显延长菠萝蛋白酶在较高温度下的半寿期.这些物质的稳定化作用可能是由于它们影响了溶剂结构和疏水相互作用,从而维护了 酶分子的活性三维构象的结果.
将菠萝肉直接捣碎，用４００目的分样筛过滤， 滤汁测定酶活备用。分别向菠萝皮汁和菠萝肉汁中 加入适量的９５％食用酒精，静置２０ｍｉｎ后，在 ２０００ｒｐｍ下离心分离１５ｍｉｎ。收集沉淀，干燥后即为 菠萝蛋白酶。 １．４测定方法 １．４．１菠萝蛋白酶测定方法刚 １．４．２糖度测定方法使用糖度计测定 １．４．３酸度测定方法使用精密ｐＨ计测定
２结果与讨论 ２．１菠萝的成熟度对果实ｐＨ值的影响
菠萝成熟度不同，含糖萤不同，口感风味不同， 其果实的ｐＨ值有所不同稍有差别，其中菠萝蛋白 酶的含量必定有所差异，研究中对市场上的不同成 熟度的菠萝进行了测定，结果觅表ｌ。 表１菠萝成熟度（以糖度表示）对其ｐＨ值的影响
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盐法提取菠萝蛋白酶的研究
张桂香王元秀矫强石玉宝
济南大学化学化工学院生物技术系济南,250022
摘要：论文采用正交实验，运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶，对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究，并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定。
关键词：菠萝皮、菠萝蛋白酶、正交实验、盐析法
前言：酶的应用已有几千年的历史。
特别是近30来，随着酶生产的不断发展，酶已广泛地用于食品、轻工、医药、环保以及科技等领域。
目前已经发现的酶约有3000种，但现在已应用的酶不足十分之一，而已工业化生产和应用的酶不过几十种[1]。
菠萝蛋白酶就是其中的一种酶，它存在于菠萝家族之中，它不仅存在于芽中，
而且也存在于果实之中。
通过压榨芽殖细胞，用丙酮、NaCl 或(NH
4)
2
So
4
使沉淀物
凝固的办法可获取菠萝蛋白酶[2]。
一般提取用的酶源是凤梨，但是价格较贵，约6000元/吨。
而用菠萝皮，不但可以减少资源的浪费，降低费用，又能减少环境的污染。
对于菠萝蛋白酶来说，使用盐析法提取是比较理想的一种方法，也使用的最广泛，其基本原理是：不同的蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同而能分离。
此法简便、安全[3]。
1、材料与设备
1.1 材料与试剂
菠萝皮：市场采集；高岭土、酪蛋白：化学纯
pH试纸：山师化工厂；其它试剂均为分析纯
1.2 仪器与设备
电子恒温水浴锅：DZKW-C型，黄骅市卸甲综合电器厂
数显温控仪（电热恒温培养箱）：ZJYY-XMT-142，上海跃进医疗器械厂
离心机：LG10-2.4A型，北京医用离心机厂
高速组织捣碎机：Ds-1，上海标本模型厂制造
架盘药物天平：Hc-TP11-1型，上海第二天平仪器厂
722光栅分光光度计:上海第三分析仪器厂
2、实验方法
2.1 菠萝蛋白酶的提取方法
2.1.1 工艺流程[4-5]
菠萝皮洗净→去杂→捣碎过滤→[滤液
滤渣→乙醇→浸提液→过滤→滤液
]→加苯甲酸钠→压出液→
10℃加白陶土→吸附物→加(NH
4)SO
4
调pH6.5-7→洗脱液→正交实验方法→粗制
品→溶解→NaOH调pH→待测液。
2.1.2流程说明
2.1.2.1滤液制备：选取干净的菠萝皮，除杂，在清水中漂洗三次，沥干，放入冰箱冷冻备用。
用高速组织捣碎机打浆，过滤，取滤液，滤渣加入乙醇进行第二次浸提、过滤，合并两次滤液，按汁加0.05%苯甲酸钠作防腐剂，送入冰箱存放备用。
2.1.2.2吸附、洗脱：压出汁液置不锈钢保温缸中，不断搅拌，加入汁液量的 4%白陶土，在10℃吸附15-20分钟，静置过夜，次晨虹吸除去上清液，留下湿陶土，
加入Na
2CO
3
饱和液调节pH6.5-7，再加入按湿土计50%的(NH
4
)
4
So
4
，搅拌25-30分
钟，进行洗脱。
2.1.2.3待测酶液制备:将上述洗脱液分别离心两次，取沉淀，溶解.按正交试验要求，加入食盐沉淀（盐析），5分钟后，离心，弃上清液，洗涤沉淀，过滤，定容。
2.2菠萝蛋白酶测定方法: C.D.U.方法[5]
2.3 菠萝蛋白酶盐析实验方法:利用L
25
(56)正交设计表[6]
表1 正交试验设计表
2 18 5 10
3 22 6 15
4 26 7 20
5 30 8 25
3、结果与讨论
3.1标准曲线测定结果
根据标准曲线测定方法，测定三次，取平均值,计算一元线性回归方程为A=0.0091x+0.03736,其中，A:吸光度，x：未消化酪蛋白的量。
3.2正交实验结果
从菠萝皮中按正交实验提取蛋白酶，并采用测定 C.D.U方法分别进行测定，结果如表2。
由表2可以看出，影响酶提取的影响因素主次顺序为B>A>C，最优组合为
A
1B
4
C
1
,即：NaCl的量14%，溶液的pH值7，沉淀温度为0℃为最佳。
表2 正交实验结果
实验号因素酶含量
A B C
1 1 1 1 16.093
2 1 2 2 23.479
3 1 3 3 27.349
4 1 4 4 28.134
5 1 5 5 24.521
8 2 3 4 20.600
9 2 4 5 23.845
10 2 5 1 24.754
11 3 1 3 14.989
12 3 2 4 21.829
13 3 3 5 15.254
14 3 4 1 25.505
15 3 5 2 24.325
16 4 1 4 18.838
17 4 2 5 21.281
18 4 3 1 19.884
19 4 4 2 24.017
20 4 5 3 26.390
21 5 1 5 23.414
22 5 2 1 21.198
23 5 3 2 25.130
24 5 4 3 22.662
25 5 5 4 24.075
K1
K2 和 K3
K4
K5 极差 R 120.576
103.027
101.902
110.410
116.479
18.674
89.708
105.141
108.317
124.263
124.095
34.555
107.434
113.425
104.744
113.476
108.315
8.732
4、结论
4.1用菠萝皮提取菠萝蛋白酶，工艺简单，提取率较高，可以解决资源的二次污染和浪费问题。
4.2食盐作为沉淀剂，可以使菠萝蛋白酶沉淀，用于酶提取，其添加量和浓度对酶提取有较大的影响。
4.3溶液酸碱直接影响菠萝蛋白酶的活性和提取量。
4.4用盐法提取菠萝蛋白酶的最佳条件为:NaCl量为14%,pH 值为7,且温度为0℃。
参考文献
1、郭勇著，《酶工程》，中国轻工业出版社,1984.
2、颜思旭、蔡红玉编《酶催化动力学原理与方法》，厦门大学出版社,1982.
3、罗就浦编《酶和酶工程》，上海交通大学出版社,1984.
4、陈来同、唐运编写《41种生物化学产品生产技术》，金盾出版社1994.
5、[德]施特尔马赫著、钱嘉渊译《酶的测定方法》，中国轻工业出版社,1979.
6、吴栩、李永乐、胡庆军、《应用数理统计》，国防科技大学出版社,1997.
英文题目：
Study on Bromelin Extracted by Salt Method
作者简介：张桂香，1975年生，女，硕士，讲师，主要从事于食品生物技术的研究
说明：论文在作者名单上稍做修改，敬请留意，对贵刊工作造成的不便敬请原谅。