参莲提取物对TNF_刺激下单核细胞株THP_1功能的影响

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的多种细 胞 功 能 可 能 均 有 一 定 的 影 响 。本 实 验 从 SL 提取 物 对 单 核 细 胞 附 着 、 迁移 、 摄脂 、 分泌 等角度深入观察 SL 提取物对炎症因子作用下单 核细胞功能变化的影响 。 1 材料 111 仪器和试剂 J 2 301 低温超速离心机 (美国
组迁移至 transwell膜下层的细胞数明显增多 , 与对 照组比较有显著性差异 ( P < 0105 ) 。 SL 提取物 5 个剂量组均可显著减少迁移细胞数 , 与模型组比较 有显著性差异 ( P < 0105, P < 0101, P < 0105, P < 0101, P < 0101 ) 。见图 1。 314 SL 提取物对单核细胞摄脂功能的影响 与对 ( 照组比 较 , 模 型 组 细 胞 内 TC 值 明 显 升 高 P < 0101 ) 。 SL 提取物各剂量组均可显 著降 低 TC 值 ( P < 0101 ) 。 见表 2。 315 SL 提取物对单核细胞分泌功能的影响 与对 照组比较 , 模型组细胞上清中 I L2 6 含量明显升高 ( P < 0101 ) , I L2 10 含量明显降低 ( P < 0101 ) 。 SL1 可显著降低异常增高的 I L2 6 值 ( P < 0101 ) ,同时升 高细胞上清中 I L2 10 的含量 ( P < 0101 ) , 其他剂量 未见明显作用 。见表 3。 4 讨论 AS早期炎症反应过程中迁移 、 渗出到血管损伤 局部的细胞以单核 、 淋巴细胞为代表 ,单核细胞黏附 [ 13 ] 于内皮表面的数量可高出正常时的 10 ～15 倍 。 ・1 0 3 3E 紫 外 2 可 见 分 光 光 度 计 (美 国 Aglient) 。 550 型 MODEL 酶标仪 (美国 B io 2 Rad ) 。 HUVEC 由北京大学医学部分子免疫教研室王露馈
赠 。 THP 2 1 (中国协和医科大学基础部细胞中心 ) ; RPM I 1640 培养基 ( GI B CO 2 BRL , 批号 1165062 ) ; 高 糖型 DM EM 培养基 ( GI B CO 2 BRL , 批号 1292294 ) ; α ( Pep 2 胎牛血清 (B iochrom AG,批号 0379H ) 。 TNF 2 rotech, 批号 0604CY25 ) 。考马斯蓝 G2 250 ( Sigm a, 批号 BA 9719 ) 。大鼠抗人 I L2 6 Kit,批号 110371,大 鼠抗人 I L2 10 Kit, 批号 A011, ADL。其他试剂均为 国产分析纯 。 SL 提取物采用醇提取 、 大孔吸附树脂 富集纯化的方法制备 ,主要含丹参酮类 、 丹酚酸类及 穿心莲内酯类等有效组分 , 可控成分达 50%以上 , 由中国中医科学院中药研究所化学室提供 。 112 动物 健康雄性新西兰兔 ,体重 212 ～218 kg, 北京市通力实验动物养殖场提供 , 合格证号 SCXK (京 ) 2005 2 0003。 2 方法 211 药物处理 SL 提取物用 DM SO 配成储备液 , 使用前用培养基稀释到所需浓度 ( DM SO 终浓度不 超过 011% ) 。 212 高脂血清 ( hyperlip idem ic serum , HLS ) 制备 以球囊导管内皮损伤术和高脂饵食法建立家兔 AS 模型 ,模型家兔无菌条件下经腹主动脉取血 , 4 ℃ 静 - 1 置 1 h, 3 000 r・m in 离心 15 m in 分离血清 。用酶 比色法检测 TC 值为 12107 mmol・L 。过滤分装 ,
α 20 μg [摘要 ] 目的 : 观察参莲 ( SL )提取物对炎症因子刺激下单核细胞功能的影响 。方法 : SL 提取物预孵育 ,以 TNF 2 ・L 为刺激因子 , 观察 SL 提取物对单核细胞株 THP2 1 黏附 、 迁移 、 摄脂 、 分泌功能变化的影响 。结果 : SL1 ～3 ( 015 ～2 g・
10 μg・L 已具有显著的诱导作用 , 10 ～ 40 μg ・
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α各组对黏附率的影响无明显的量效关系 L TNF 2 ( 61107% , 73111% , 75189% , 81156% ) 。故选用 20
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α (M 组 ) 、 α (在 M 组的基础上 , 组 )、 TNF 2 SL + TNF 2 - 1 加入 SL 提取物 2, 1, 015, 0125, 01125 g ・L , 为 SL1 ～5 组 ) ,培养 24 ～48 h,进行细胞功能检测 。
214 HUVEC 与 THP 2 1 黏附功能检测 将 HUVEC
以 5× 10 接种于 48 孔板 ,每组均设 4 个平行孔 。待 细胞生长融合后吸弃培养基 , PB S洗孔 1 遍 ,分别加 5 入 5× 10 个 /mL 的 THP 2 1 细胞悬液 、 同时加入 SL α 20 μg・L - 1继续培养 提取物孵育 , 24 h后以 TNF 2
ICAM 2 1 无明显 影 响 , 但 可 选 择 性 地 作 用 于 其 配 基— — — 单核细 胞 表 面 黏 附 分 子 CD18 , 且 疗 效 显 [ 62 7] 著 。基于单核 细胞 在 A S 早 期 形 成 过 程 中 的 复杂 作用 , 推测 SL 提 取物 对单 核细 胞黏 附之 外
[关键词 ] 动脉粥样硬化 ; 参莲提取物 ; 炎症 ; THP2 1
单核细胞与内皮细胞的相互作用是动脉粥样硬 化 ( artherosclerosis, AS)的始动环节和 AS早期炎症 发生典型特征之一 。这种相互作用不仅是 AS损伤 局部炎症修复的重要方式 , 而且在此过程中 2 种细 胞的功能均发生相应变化 , 如单核细胞分化 、 增殖 , 受体表达改变等 。单核 2 内皮细胞的相互作用过 程中表达和产生的诸多炎症相关生物活性因子及其 继发效应所致的血管局部级联放大的失控性炎症反 [ 42 5] 应 ,与 AS的发生 、 发展密切相关 。前 期 研 究 显 ( 示 , 防治 A S有效药物 SL 提取物 由丹参 、 穿心莲 ) 组成 对 A S 家 兔 模 型 内 皮 细 胞 表 面 黏 附 分 子
P < 0101; 与 M 组 相 比 3) P <
0105, 4) P < 0101 (表 2, 3 同 ) 。
313 SL 提取物对单核细胞迁移功能的影响 模型
α刺激 HUVEC 与 THP 2 311 TNF 2 1 黏附的量效关 α 5 μg・L - 1对细胞黏附率无明显影响 ,从 系 TNF 2
[8] - 1
剂量
/ g・L 2100 1100 0150 0125 01125
1) -1
α TNF 2
/μg・L - 1 20 20 20 20 20 20
P < 0105,
2)
A 570
01336 1 ± 01031 2 01360 1 ± 01008 52) 01340 4 ± 01016 84) 01330 9 ± 01013 93) 01337 8 ± 01033 73) 01356 4 ± 01008 3 01349 8 ± 01011 9
218 统 计 学 处 理 数 据 均 以 x ±s 表 示 , 采 用 SPSS1210 软 件 进 行 检 验 , 多 组 间 差 异 比 较 采 用 ANOVA , P < 0105 为有显著性差异 。 3 结果 217 SL 提取物对单核细胞分泌功能的影响
[ 12 ]
注 : 与 C 组 相 比
第 35 卷第 8 期
2010 年 4 月
Vol135, Issue 8 Ap ril, 2010
α刺激下单核细胞株 参莲提取物对 TNF2 THP2 1 功能的影响
李玉洁 , 杨庆 , 翁小刚 , 朱晓新 , 王怡薇 , 刘小霓 , 韩晓
(中国中医科学院 中药研究所 ,北京 100700 )
THP2 1 黏附有明显抑制作用。见表 1。
表 1 SL 提取物对 HUVEC和 THP 2 1 黏附 ( ) 的影响 x ± s, n = 8
组别
C M SL1 SL2 SL3 SL4 SL5
检测黏附细胞量 ,每孔加 012 mol・L NaOH 200 μL 溶解各孔细胞 。取待测各孔细胞溶解液 100 μL 于标记管 ,每管加 500 μL 稀释的考马斯亮蓝 G2 250 染液 , 充分混匀 , 静置 10 ～ 30 m in, 570 nm 测定 A
・1 0 3 0 ・
第 35 卷第 8 期
2010 年 4 月
Vol135, Issue 8 Ap ril, 2010
用于 THP 2 1 摄脂功能检测 。
213 细胞分组及处置 常规培养 THP 2 1, HUVEC, 据实验需要按不同浓度接种细胞 ,分别设对照组 ( C
值 ,其数值大小代表黏附细胞的多少 。 [ 92 10 ] 215 THP 2 1 摄脂功能检测 将 THP 2 1以 5 × 5 10 接种于 48 孔板 , 每组均设 4 个平行孔 。 SL 提取 物孵育 24 h 后加入终浓度为 5%的 HLS 37 ℃ 孵育 - 1 48 h。收集细胞 , 1 000 r ・m in 离心 10 m in, 弃上 清 。用 PB S洗细胞沉淀 1 次 , 加入异丙醇 011 mL , - 1 超声振荡 10 s/次 × 3 次 , 再以 1 000 r・m in 离心 15 m in,吸取上清液 ,酶比色法测定 TC 值 。 [ 11 ] 5 216 THP 2 1 迁移功能检测 将 THP 2 1以 5 × 10 接种于 Transwell双层培养板上室 , 以含 SL 提取物 α 20 的无血清培养基孵育 24 h。下室加入含 TNF 2 - 1 μg・L 及 5%血清的培养基 , 37 ℃, 5% CO2培养箱 中温育 4 h。将上室取出 ,甲醇固定 ,结晶紫染色 ,显 微镜下观察各孔迁移至膜外侧细胞情况 , 取 4 个视 野进行计数 ,以细胞数的平均值为细胞迁移数 。 THP 2 1 细胞接种于 48 孔培养板 , SL 提取物孵育 24 α 20 μg・L - 1 37 ℃, 5% CO2培养箱中 h。加入 TNF 2 温育 4 h。收集各组细胞培养上清液 100 μL , EL ISA 法检测 I L2 6和 I L2 10。