大肠杆菌质粒DNA的提取
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
提取大肠杆菌的质粒
感受态细胞
分子生物学最基本的实验操作
提取大肠杆菌和凝胶电泳
碱裂解法提取质粒
质粒是分子生物学中载体
扩增培养细菌便于提取，为客观化，养细胞来获得质粒二倍体增加
培养后收集裂解，裂解物质有很多物质，分离质粒和纯化质粒
质粒提取的方法
2-3ml少量提取方法碱裂解法
两个环，染色体独立复制能从亲代传到子代
质粒DNA是圆环状
目的基因越多，复性有不好影响
需要大量，让宿主细胞扩增
EP2232考量目的基因的作用，个体，看生物学功能发现
可以弥补目的细胞缺陷
沉默基因片段可以质粒
质粒提取与介质有关
控制PH是细胞破裂，染色体基因变性，质粒基因微变性，空间结构稳定，变性小开链缠绕在一起，蛋白质会沉淀，质粒在水相离心抽提纯化
原理核心物质
Ph8左右培养，变性需要12
Sds裂解细胞，染色体核酸变性，环境是碱
抑制杂菌，空气中的菌，培养中其它生长出来的菌
裂解用的试剂SDS和NAOH溶液
提取试剂溶液1，2，3
先配原始浓度，用时工作浓度，使用时变成终浓度
苯酚氯仿异戊醇分层，用苯酚氯仿比重大，易沉，相配现用
充分混匀
TE Buffer专门储存DNA
裂解时加RNA酶，不加，检测有条带，使制剂更纯
溶液123作用尽可能全地写到讨论区
溶液一震荡混匀二是轻柔颠倒混匀3颠倒混匀
涡旋混匀器。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳二、实验原理：1.质粒DNA的提取：质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。
除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。
（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。
与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。
进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。
SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。
（2）四种溶液作用及原理：①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。
质粒提取实验报告
质粒提取实验报告质粒提取实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，它的目的是从细菌中提取质粒DNA。
质粒是一种环状的DNA分子，存在于细菌细胞质中，具有自主复制的能力。
质粒提取实验对于研究基因功能、基因工程以及遗传学等领域具有重要意义。
实验材料与方法：本次实验所用材料包括细菌培养物、质粒DNA提取试剂盒、离心管、离心机等。
实验步骤如下：1. 选择合适的细菌培养物，如大肠杆菌。
2. 将细菌培养物转移到含有适当抗生素的琼脂平板上，孵育过夜。
3. 从琼脂平板上挑取单个菌落，接种到含有适当抗生素的培养基中，培养过夜。
4. 将过夜培养的细菌转移到含有适当抗生素的液体培养基中，继续培养。
5. 收集培养物，离心沉淀细菌细胞。
6. 使用质粒DNA提取试剂盒进行质粒提取。
实验结果与讨论：经过以上步骤，我们成功地从细菌中提取到质粒DNA。
提取的质粒DNA经过琼脂糖凝胶电泳分析，显示出明亮的DNA条带。
这些条带的大小与我们预期的质粒大小相符，证明提取的质粒DNA质量良好。
质粒提取实验的成功与否受到多个因素的影响。
首先，选择合适的细菌培养物非常重要。
常用的大肠杆菌是质粒提取实验的理想选择，因为大肠杆菌具有较高的质粒含量。
其次，培养条件的控制也是关键。
适当的培养时间和培养温度可以提高质粒的复制效率。
此外，质粒提取试剂盒的选择和使用方法也会对实验结果产生影响。
正确操作试剂盒中的各个步骤，如细胞破裂、DNA纯化和洗涤等，是保证实验成功的关键。
质粒提取实验在科学研究和应用中有着广泛的应用。
首先，通过质粒提取实验可以获得大量的质粒DNA，为基因克隆、基因测序等实验提供了材料基础。
其次，质粒提取实验也是进行基因工程技术的前提。
通过将目标基因插入质粒中，可以实现基因的定向表达和转基因等操作。
此外，质粒提取实验还可以用于研究细菌的耐药性、毒力因子等重要基因的分析。
然而，质粒提取实验也存在一些局限性。
首先，质粒提取实验只能提取到细菌中的质粒DNA，无法获取真核生物的质粒。
大肠杆菌质粒DNA的提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
质粒DNA的提取实验
实验六质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒二、实验原理质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。
它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS （十二烷基硫酸钠）包盖。
当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
三、实验材料与试剂1、实验材料大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）2、实验试剂(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；(5) 异丙醇、70%乙醇；四、实验步骤（一）提取质粒1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。
（由老师完成）2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。
3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm 离心1min。
4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。
大肠杆菌质粒DNA的提取
③ 向上清液中加入等体积酚-氯仿混合液，震荡 混匀，以10000r/min离心2min,将上清转至新 的离心管中（用酚与氯仿的混合液除去蛋白， 其效果比单独使用酚或氯仿更好)
④ 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀。室温 放置2min后，离心5min倒去上清乙醇溶液，把 离心管倒置在吸水纸上吸去液体。
⑤ 加入0.5mL 70%乙醇溶液，震荡并离心，倒去 上清，干燥，溶于实验用品均需高温处理，以灭活残余的 DNA酶 • 所有试剂均需用高压灭菌双蒸水配制
• 酚抽提后小心吸取上清液
• 0.2mol/L NaoH溶液（内含1%SDS） • 70%乙醇溶液/无水乙醇
实验过程
1、培养细菌扩增质粒： 将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养 基中，37℃过夜培养
2、收集菌体及裂解细菌:
① 取液体培养菌液1.5mL置于EP管中， 10000r/min 离心1min, 去上清。 ② 加入150uL G.E.T 缓冲液，充分混匀，室温放 置10min （溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须 在使用时重新配置，使用EDTA是为了除去细胞 壁上的钙离子，使溶菌酶更易与细胞壁接触）
大肠杆菌质粒DNA的提取
实验目的
• 学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法
• 掌握质粒DNA制备的方法和原理
实验原理
质粒DNA的提取分为三个步骤：培养细菌使 质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质 粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十 二万基硫酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经 溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细 菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离 心时易被沉淀出来，而质粒DNA 则留在上清 液中，将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后，可 得到质粒DNA.
③ 加入新配置的0.2mol/L NaoH溶液（内含1%SDS） 加盖，倒置2-3次，使之混匀。冰浴5min（SDS 能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性）
细胞生物学实验碱性SDS法提取大肠杆菌源质粒
溶液Ⅱ： 0.2MNaOH， 1%SDS
溶液Ⅲ： 3M乙酸钠 PH 4.8
试剂
4、1：1 Tris饱和酚/氯仿
5、溶解质粒用TE：
10mmol/L Tris-HCI PH 8.0
1mmol/L EDTA
PH 8.0
6、溶解质粒用TER：
每ml TE 中含1mg RNase。
用品
摇床、恒温箱、普通离心机、高速冷冻 离心机、1.5ml离心管、电泳仪等。
断开）
DNA的琼脂糖凝胶电泳分离的原理及装置
琼脂糖（agarose）是从海藻中提取出来的一 种线状高聚物，在溶液中形成一定孔径的凝胶。 具有分子筛作用。可依据分子大小及分子构型 不同分离物质。
琼脂糖凝胶电泳装置：Walter Schaffner发明
的水平板凝胶电泳装置。
电泳步骤
1.配缓冲液：Tris－乙酸缓冲液、Tris－乙酸盐缓冲液、 Tris-硼酸盐缓冲液、Tris－磷酸盐缓冲液
三、裂菌及提取质粒DNA
1、100l预冷的溶液Ⅰ重悬菌液，激烈振荡(涡旋）， 使细胞完全分散，室温放置5min；
2、加入200l新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒几次混匀， 置于冰上（此时溶液PH应为12.6）不超过5min ，使细 胞破裂，蛋白和染色体DNA变性；
3、加入150l用冰预冷的溶液Ⅲ，颠倒温和混匀，置 于冰上5min(此时溶液PH应为7.0左右,可使质粒DNA选 择复性；高浓度的盐使蛋白及染色体DNA沉淀)；
Tris-硼酸盐缓冲液 Tris-EDTA缓冲液 巴比妥缓冲液 缓冲液 缓冲液离子强度：0.02-0.05。
琼脂糖凝胶的制备
１.配琼脂糖溶液。用电泳缓冲液配制。 2.封胶板，插梳子。
3.倒胶。熔化液倒入胶模中，放置1530min令其凝固。
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大肠杆菌质粒DNA的提取一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法:碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下:1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37?振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1,葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1, SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0?静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70,乙醇0(5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0(05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4?下12000,离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4?下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
(一)、碱法1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4?下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中(此步可省略)。
3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。
5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。
6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
7、4?下5000g离心15分钟。
8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37?水浴20分钟。
9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4?下12000g离心10分钟。
10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4?下12000g离心10分钟。
11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。
12、4?下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4?下12000g 离心5分钟。
13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。
[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。
3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80? 1小时),使DNA酶失活。
二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
(1)琼脂糖凝胶电泳装置由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。
对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。
使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。
在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。
凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。
凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
(2)琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。
然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。
凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。
(3)琼脂糖凝胶的染色电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。
三、大肠秆菌感受态细胞的制备感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37?振荡培养过夜2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37?振荡培养3h 至OD600=0.33、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。
4、在4?下以4000rpm离心5min，去上清液5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min6、然后再在4?下以4000rpm离心10min，去上清液7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。
四、质粒DNA高频转化大肠杆菌制备好感受态细胞后，接下来就是质粒DNA转化入大肠杆菌细胞的过程。
但要注意的是感受态细胞最好是新制备的，因为保存一定时间的感受态细胞会使转化率降低;此外DNA的浓度也要注意，不能太高。
1、取新制备的一管感受态细胞。
2、取0(03ml感受态细胞转和4ng质粒DNA混匀，置冰浴30min3、将 Ep管置于42?水浴中热冲击2分钟，立即置于冰上1分钟。
4、在 Ep管中加70u1 LB培养基混匀，37?培养30min5、涂在含适当浓度抗生素的LB平板上。
6、37?培养过夜，长出的菌斑既为阳性克隆。
五、线形质粒DNA 5'-粘性末端去磷酸经限制性内切酶酶切的质粒DNA 5'端均带有磷酸集团，如用此载体直接转化大肠杆菌，其自身环化几率非常高，影响连接、转化效率。
因此一般酶切的质粒DNA 要经脱磷，使用碱性磷酸酶(CIAP)去除5'端磷酸集团。
方法如下:1、质粒DNA和CIAP以及BUFFER 37?水浴30min2、补充CIAP 再37?水浴30min3、加入50mM EDTA至终浓度5mM 75?加热10min 失活CIAP4、冷却至室温，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩。
5、抽干溶液，加适量TE溶解。
六、聚合酶链式反应(PCR)技术PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。
其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。
所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是ssDNA片段。
待扩增DNA模版加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。
此时，两引物的3'端相对，5'向背。
在合适的条件下，由Taq DNA 聚合酶催化引物引导的DNA合成，既引物的延伸。
上述过程是由温度控制。
这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。
PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
理论上扩增产物量成指数上升，既n个循环后，产量为2n拷贝。
典型的PCR操作过程如下:1、反应体系:体积成分工作液浓度终浓度14.0 µl PCR Water ————2.5 µl 10X Taq Buffer 10X 1X1.5 µl MgCl2 25 mM 1.5 mM4.0 µl *dNTP Mix 1.25 mM each dNTP 0.2 mM each dNTP0.25 µl Primer 1 100 pmoles/µl 1 µM0.25 µl Primer 2100 pmoles/µl 1 µM0.25 µl Taq DNA Polymerase 5 U/µl 0.05 U/µl 2.5 µl DNA 25 µl Total Reaction Volume(反应溶液可置于毛细管或薄壁离心管中扩增) 2、操作过程:(所用仪器为AMP1605热循环PCR扩增仪预变性:94? 90秒循环过程:94? 1秒 48? 1秒 72? 40秒 40个循环延伸:72? 5分钟3、检测:琼脂糖电泳检测。