高中生物实验 叶绿体的分离和荧光观察 实验报告
高中生物 实验二 密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光观察
叶
绿 体
叶 脉
叶 肉 细 胞
菠菜叶横切图（10×40）
保卫细胞
叶绿体
菠菜表皮细胞
（匀浆后，示表皮细胞、保卫细胞、叶绿体。 10×40）
蔗糖梯度离心分离菠菜叶绿体（10×40）
菠菜叶肉细胞、表皮细胞（匀浆后10×40）
（叶绿体浓度过大）
荧光显微镜的光路及主要部件
光源 激发光挡片 激发光滤色镜 分色镜
实验二 密度梯度离心法分离提 纯叶绿体及叶绿体荧光观察
一、实验目的
学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶 绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗 粒的大小、形状和密度，也同离心力以及 悬浮介质的粘度有关；
用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在 离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小 的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降 系数较大的细胞组分沉到离心管底部， 这样，可粗 器材：光学显微镜、台式高速冷冻离心机，
研钵、剪刀、托盘、玻皿等 3. 试剂： （1）匀浆介质（0.25 mol/L蔗糖、
0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液，pH7.4） （2）50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶 液。
四、实验步骤
1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、 主脉后，称取2~3g，剪碎置研钵中。
2. 加入10ml匀浆介质于研钵中，研磨成糜状。 3. 用双层纱布过滤捣碎液到烧杯中。 4. 将滤液倒于离心管内，500rpm离心10min，
轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml加入离心管，再取 15%蔗糖溶液0.4ml小心沿管壁缓缓注入， 不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面 可见，制成密度梯度。
6. 加入0.4ml上清液，严格平衡离心管后，用 水平转头8000r/min离心，20min。
实验二叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体荧光产生的机制
荧光产生
叶绿体在接受光能后，将能量转化为活跃的化学能，这个过程会产生荧光。荧光是一种光发射现象，发生在叶绿 素和其他色素分子吸收光能后。
荧光类型
根据荧光产生的机制，可以将荧光分为自发性荧光和诱导荧光。自发性荧光是指色素分子自发地吸收光能后产生 的荧光；诱导荧光是指通过外部刺激使色素分子吸收光能后产生的荧光。
叶绿体的分离
01
02
03
04
制备匀浆
将新鲜叶片洗净后剪碎，加入 适量的磷酸缓冲液，用匀浆器
充分研磨的转速和时间进行离心分离，
使叶绿体沉淀到底部。
吸取上清液
将上清液吸出，留下叶绿体沉 淀。
重悬浮
将叶绿体沉淀重新悬浮在适量 的溶液中，以便进行后续的荧
光观察。
实验二叶绿体的分 离与荧光观察
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握叶绿体的分离技术
叶绿体的分离
通过离心、密度梯度离心等技术，从植物组织中分离出叶绿 体。
叶绿体纯化
通过过滤、洗涤等步骤，去除杂质，获得纯度较高的叶绿体 。
了解叶绿体荧光的基本原理
叶绿体分离的原理与方法
原理
叶绿体分离主要依据其密度和大小差异进行。常用的分离方法有差速离心法和密度梯度离心法。差速 离心法是通过逐渐增加离心速度，使不同大小和密度的细胞器分批分离；密度梯度离心法则是在介质 中形成密度梯度，使不同密度的细胞器在梯度中停留并形成不同的区带。
方法
叶绿体分离通常包括细胞破碎、差速离心或密度梯度离心、洗涤和重悬浮等步骤。根据实验需求，可 以选择适当的方法分离纯化叶绿体。
实验三 叶绿体的分离与荧光观察
实验三叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的1．了解差速离心法分离细胞成分的一般原理和方法。
2．掌握从植物叶组织中分离叶绿体的方法。
3．熟悉荧光显微镜的使用方法，并观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。
4．熟悉利用叶绿体得率来测量叶绿素含量。
二、实验原理叶绿体是是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的能量转换细胞器。
由于具有这一重要功能，所以它一直是植物学、细胞生物学和遗传学等的重要研究对象。
植物细胞被细胞壁所包围，因此实验中必须破碎细胞壁的同时保持叶绿体的完整。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离叶绿体等细胞器的常用方法。
差速离心就是根据一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，及离心力以及悬浮介质的粘度等因素进行的。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损坏。
先将匀浆液在1 000 rpm的条件下离心2 min（以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞），然后在 3 000 rpm的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
有些生物体内的物质受激光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光为次生荧光（或间接荧光）。
叶绿体含有的叶绿素发出火红色荧光属于自发荧光，叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光属于次生荧光。
三、实验仪器、材料和试剂1．设备与器材。
叶绿体的分离及荧光观察
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态（基态）时释放出的光。
三、荧光显微镜的成像原理
01
保持固有的荧光特性
02
荧光波长＞激发波长
03
荧光强度极小于激发光的强度
04
有不同程度的衰减
05
荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
四、荧光的性质
五、荧光显微术应用
常用的细胞破碎方法
方法
技术
原理
效果
成本
举例
机 械 法
匀浆法
细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎
适中
适中
动植物组织或细胞
研磨法
细胞被研磨物磨碎
适中
便宜
植物组织
超声波法
用超声波的空穴作用使细胞破碎
剧烈
昂贵
细胞悬浮液小规模处理
珠磨破碎法
细胞被玻璃珠或铁珠捣碎
剧烈
便宜
细胞悬浮液和植物细胞大规模处理
化 学 法
渗透冲击
生物绘图 1．要求：细胞和组织绘图是根据显微镜下的观察内容绘制的，因此，首先要充分观察了解所绘材料的特点、排列及比例。选择有代表性的、典型的部位进行绘图。客观真实地反映材料的自然状态。即生物绘图要求具备高度的科学性和真实感，形态正确、比例适当、清晰美观。 2、用线条和圆点来完成全图。如，用线条描绘细胞壁与膜。用“点”表示明暗和颜色的深浅，给予立体感 3、不要只孤独的绘制一个细胞，要表现出显微镜下还有其他细胞的存在，
介质梯度应预先形成 ，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面、底部或中间，离心后形成区带。
介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。
叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验报告
叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验报告叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验⽬的：1、通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和⽅法2、熟悉荧光显微镜的使⽤⽅法，观察叶绿体的⾃发荧光和间接荧光实验原理：差速离⼼法⽤于分离⼤⼩不同的物体。
在差速离⼼中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质⽹与⾼尔基体、醉后为核糖核蛋⽩复合体。
密度梯度离⼼法是⽤⼀定的介质在离⼼管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离⼼⼒的作⽤使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与⾃⾝密度相同的沉降区带中。
叶绿体是⼀种⽐较⼤的细胞器，利⽤差速离⼼即可分离收集，然后⽤密度梯度离⼼纯化，便可⽤于各种研究。
实验⽤品：新鲜菠菜、提取缓冲液、蔗糖溶液、0.01%吖啶橙、离⼼机、电⼦天平、荧光显微镜、剪⼑、研钵、移液管、漏⽃、滴管、10ml离⼼管实验步骤：1、选取新鲜嫩绿菠菜叶，去叶梗及粗脉，洗净擦⼲，称30克放于150ml 0.35M.Nacl溶液中2、将液、叶同装⼊组织捣碎机中，匀浆3-5分钟，转速5000r/min3、将匀浆⽤纱布（6层）过滤于500ml烧杯中4、取滤液4ml在1000r/min下离⼼2min5、取上层清液在3000r/min下离⼼5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）6、将沉淀⽤2-3mlMnacl液悬浮7、取⼀滴悬液滴⽚，加盖玻⽚后显微镜下观察8、另取⼀滴悬液滴⽚，再滴加⼀滴0.01%吖啶橙染料，混匀，盖上盖玻⽚，在荧光显微镜下观察实验结果：普通显微镜下，叶绿体呈橄榄形，绿⾊，⾼倍镜下可看到基粒（深绿⾊⼩颗粒）。
荧光显微镜下，叶绿体⾃发荧光为“⽕红⾊”，次⽣荧光为“橘红⾊”分析与讨论：1、捣碎叶⽚式时时间不宜过长，否则会破坏叶绿体2、⽤荧光显微镜找到物象后，要先拍照后观察，因为荧光会逐渐变弱。
高中生物 实验四：叶绿体的分离与荧光观察
6.沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光 学显微镜观察。使用荧光显微镜观时，将叶绿体悬液滴在 无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料， 盖上无荧光的盖玻片后即可观察。
8.观察叶绿体的形态结构、测量1~5个叶绿体的长轴和短
【ห้องสมุดไป่ตู้验原理】
某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光 能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间 内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就
称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体
内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧 光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧 光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧 光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用 荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。
实验四：叶绿体的分离与荧光 观察
【实验目的】
了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用 荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
【实验原理】
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生 特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿 体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或 0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗 透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在 1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未 被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可 获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温 下进行分离要迅速。
【仪器、材料与试剂】
仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微 镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测 微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴 管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。 材料：菠菜叶片
叶绿体的染色与观察 实验报告
细胞生物学实验报告叶绿体的分离与荧光观察1.实验目的：通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
观察叶绿体自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的使用方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、胶头滴管、离心管、离心机、组织捣碎机、（2）实验药品：NaCl溶液、吖定橙染液（3）实验材料：菠菜3.实验原理：（1）将组织匀浆悬浮在等渗介质中进行差速离心是分离细胞器的常用方法。
差速离心是指将组织悬液放在离心机中，依次增加离心场力、离心时间，以达到分离的目的。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决与颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一给定的离心场中，同一时间，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批称将在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
对于植物细胞而言，分离过程最好在0-5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
动物细胞应冷冻离心。
（2）荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光物质进行观测的一种技术。
其原理基于光致发光。
光致发光是指某种物质被一定的波长照射时，吸收一定的光能进入激发态，从激发态回到基态时，就会以电离辐射的形式释放能量的现象。
如果其释放的激发光的波长比照射光的波长长，且时间小于10-8s以内，这种激发光即可成为荧光。
（3）荧光显微镜比普通显微镜多出的结构是阻断滤片、双色镜和激发滤片。
荧光显微镜有两个光源，一个是激发光源，一般是高压汞灯（发射光的波长在500nm左右）和氙灯；另一个是普通光源，一般采用卤灯泡（发射光的波长在500-600nm左右）。
（4）本实验采用的染料是吖定橙染液。
吖定橙染液是一种核酸染料。
当调节激发光波长为488nm时，吖定橙染液结合于DNA中，其发射波长为540nm，呈绿色；结合于RNA中，发射波长为610nm，呈红色。
当用吖定橙染液对细胞染色后并置于共聚焦显微镜下观察，即可观察到细胞核呈绿色，而细胞质呈红色。
叶绿体的分离、纯化及荧光观察
叶绿体的分离、纯化及荧光观察科目细胞生物学实验姓名*** 系年级2011级生物基地学号***日期2013.05.16 同组者***叶绿体的分离、纯化及荧光观察【实验目的】1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
通过控制离心力和离心时间等因素，不同的细胞器可以通过阶梯离心的方式得到分离。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，3000r/min 的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。
某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光．若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
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实验十一叶绿体的分离和荧光观察
一．实验目的
了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。
了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般
形态，增加对叶绿体的感性认识。
掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。
掌握显微数码拍照的方法。
二．实验内容
提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。
显微数码拍照。
三．实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。
离心后可得沉淀的叶绿体。
四．实验方法与步骤
1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。
2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。
3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。
4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。
5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。
b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。
c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。
而其中混有的细胞核发
出绿色荧光菠菜叶手切片观察。
d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。
保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。
5．显微数码拍照。
五．实验结果。