简单染色法与革兰氏染色法
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
细菌的简单染色实验报告
细菌的简单染色实验报告细菌的简单染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验细菌的简单染色和革兰氏染色实验实验目的1. 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
、2. 巩固显微镜的使用方法。
基本原理1. 简单染色法:用单一染料对细菌进行染色的方法。
此法操作简单，适用于一般形态的观察。
在中性，碱性或酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而是细菌着色。
带正电的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
通常的碱性染料除了美蓝外，还有结晶紫，碱性复红，番红等。
细菌体积较小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后与背景形成鲜明的对比，是易于在显微镜下观察。
2. 革兰氏染色法:将所有的细菌分成革兰氏阳性菌G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以将细菌分为G+和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙酸溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使染色的结晶紫和碘的复合物易于渗透，结果细菌被脱色，在经复红染色后就成了红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时颜色。
革兰氏染色需要四种不同的溶液，碱性染料初染液，煤染剂，脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或付着力，即已某种方式帮助染料固定在细胞上，是不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染剂，复染的目的是使被脱落的细胞染上不同于初染液的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的染色液是复红。
实验二、细菌的简单染色与革兰氏染色
2、掌握好乙醇脱色时间。ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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葡萄球菌
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杆菌
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五、实验数据及处理结果
1、根据油镜观察结果，绘出普通变形杆菌和表皮 葡萄球菌的简单染色形态图。 2、列表简述普通变形杆菌和表皮葡萄球菌的革兰 氏染色油镜观察结果（菌的形态、颜色、革兰氏染 色反应）。
G-菌：细胞壁薄，肽聚糖含量低，类脂含量高，肽聚糖 分子交松散，故经乙醇处理后，壁会出现较大的缝隙， 细胞透性增大，结晶紫－碘复合物易被洗脱出来，再经 番红复染后使细胞显红色。
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三、实验器材
1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌 2、染色剂：简单染色液(吕氏碱性美蓝染液)；革兰氏 染色液（草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、 番红染液） 3、仪器或其他用具：载玻片、生理盐水、酒精灯、接 种环、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、滤纸等
细菌产酸使培养基pH下降时，细菌带正电荷增
加，可采用酸性染料。酸性染料有：伊红、酸性复
红、刚果红等。
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2、革兰氏染色
革兰氏染色是采用二种染料对细菌细胞进行染色， 初染采用的是结晶紫，复染采用的是番红。
G＋菌：细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，基本不含类脂， 肽聚糖分子交联度较紧密，故经乙醇处理后，肽聚糖网 孔因脱水而明显收缩，使壁的通透性降低保留着结晶紫 －碘复合物，所以复染液番红不能进入,细胞显紫色。
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四、操作步骤
1、简单染色
涂片
加热干燥固定
染色 1min 水洗
干燥
镜检
简单染色与革兰氏染色
2 革兰氏染色: (7)水洗:用水洗去碘液. (8)脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色30 s )脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色30 左右至流出液无色,立即水洗. (9)复染:滴加蕃红复染2 min. )复染:滴加蕃红复染2 min. (10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液. 10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液. (11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水 11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水 纸吸干. (12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油 12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油 镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性.
2 革兰氏染色: (1)涂片:涂片方法与简单染色涂片相同. (2)晾干:与简单染色法相同. (3)固定,与简单染色法相同 (4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上, 加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1 加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1 min. min. (5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗. (6)媒染:滴加碘液,媒染1 min. )媒染:滴加碘液,媒染1 min.
实验器材
菌种: 苏云金芽胞杆菌,金黄色葡萄球菌 液体培养12-16h的枯草芽胞杆菌和培养24h的大肠 液体培养12-16h的枯草芽胞杆菌和培养24h的大肠 杆菌 染色液和试剂:结晶紫,碘液,95%酒精,蕃红, 染色液和试剂:结晶紫,碘液,95%酒精,蕃红, 美蓝,醇醚,香柏油 器材:废液缸,洗瓶,载玻片,接种杯,酒精灯, 擦镜纸(脱脂棉),显微镜
简单染色与革兰氏染色
实验目的
学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法
实验原理
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态,简单染 色不能辨别细菌细胞的构造. 革兰氏染色法是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定 的.G 的.G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且 肽聚糖层较薄,交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂 质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易 于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色.G 于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色.G+菌 细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处 理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保 留初染时的紫色.
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
简单染色法和革兰氏染色法
簡單染色法和革蘭氏染色法染色的原理:因細胞表面或細胞內活化位置和染料分子產生物理作用和化學反應（每種染料對特定的細胞物質都有特殊的親和力）。
設備:1.載玻片2.酒精燈3.塑膠滴管4.拭鏡紙5.牙籤6.光學顯微鏡菌種及採樣來源:1.枯草桿菌(Bacillus subtilis)2.大腸桿菌(Escherichia coil)3.口腔上皮細胞試劑:1.甲烯藍染劑 2.結晶紫染劑 3.碘液4.酒精5.沙番紅染劑簡單染色的步驟:1.滴1或2滴的菌液在載玻片上2.利用酒精燈把水分蒸發乾3.在載玻片上滴滿甲烯藍染劑,等一分鐘4.以蒸餾水洗去染劑5.用吸水紙吸乾水分,等乾後放在顯微鏡下觀察革蘭氏染色的步驟:1.滴1或2滴的菌液在載玻片上2.利用酒精燈把水分蒸發乾3.以結晶紫染劑(一分鐘)、碘液(一分鐘)、酒精(30秒)、沙番紅染劑(一分鐘)，依序進行染色。
4. 以蒸餾水洗去染劑5.用吸水紙吸乾水分,等乾後放在顯微鏡下觀察實驗結果: 簡單染色革蘭氏染色問題與討論:1.試述革蘭氏染色法之原理、實驗步驟及各階段染色結果?妳們這組所得到的實驗結果為何?使用的原理是利用只有存在於革蘭氏陽性菌體的核醣核酸鎂鹽蛋白質醣類複合物與染劑間的作用她會跟染劑中的結晶及碘分子形成一種無法被酒精和水所溶解的物質，保留複合物的生成。
2.微生物進行革蘭氏時應注意的事項為何?ａ染色時要使用培養１８～２４小時的微生物為最佳ｂ微生物的取樣不要太多，因為以免染色只染到上面的微生物而下面的微生物並未染色到ｃ注意碘液有效配置的時間不然為會失效ｄ脫色時用的乙醇用量不能太多ｅ最好利用不同時間培養之菌種，進行多次實驗確定結果3.試續簡單染色髮的原理以及在環工上之應用主要的原理是細胞表面或細胞內活化位置與染料分子產生物理作用與化學反應，每種染料對特定的細胞物質都有特殊的親和力。
應用:常用於廢水生物的處理時，以甲烯藍為染劑進行單染法，藉以判定活性汙泥系統中的活菌升場情形。
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌是微生物中最常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气等。
为了更好地了解细菌的形态和结构，科学家们开展了许多实验，其中包括细菌的简单染色和革兰氏染色。
一、细菌的简单染色实验细菌的简单染色是一种常用的染色方法，通过给细菌染色，可以使其在显微镜下更加清晰可见。
这种染色方法主要使用了一种叫做甲基蓝的染料。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片。
将一根无菌的钢丝棒蘸取一小滴细菌悬液，然后将其均匀地涂抹在玻璃片上。
待涂片干燥后，将其固定在火焰上加热的玻璃柱上，以使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将制备好的涂片放入染色盒中，加入适量的甲基蓝染料，浸泡片刻。
然后，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
最后，用纸巾轻轻吸干涂片上的水分，将其放入显微镜下观察。
在显微镜下观察，我们可以清楚地看到细菌的形态和结构。
不同种类的细菌可能会呈现出不同的形状，例如球状、杆状、螺旋状等。
通过简单染色，我们可以更好地观察和研究细菌的特征。
二、革兰氏染色实验革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法主要使用了紫晶染料和碘酒。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片，方法与简单染色相同。
然后，将涂片放入染色盒中，加入适量的紫晶染料，浸泡片刻。
接着，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
接下来，将碘酒滴在涂片上，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
随后，滴入乙醇或酒精醛溶液，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
最后，滴入蓝色染料，浸泡片刻后用蒸馏水冲洗涂片。
在显微镜下观察，我们可以看到细菌的染色效果。
革兰氏阳性菌会呈现紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌则呈现红色或粉色。
这是因为革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胆固醇，可以吸附紫晶染料和碘酒，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，无法吸附这些染料。
实验三简单染色法和革兰氏染色法
实验三简单染色法和革兰氏染色法实验三简单染色法和革兰氏染色法（一）细菌的简单染色法1实验目的1.1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能1.2学习微生物涂片、染色的基本技术1.3掌握细菌的简单染色法1.4初步认识细菌的形态特征，学习油镜的使用方法和无菌操作技术2 实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简单，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
一般使用碱性染料进行简单染色。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的燃料有美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
3实验材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。
3.2染色剂草酸铵结晶紫染液，番红染液。
3.3仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。
4 流程涂片干燥固定染色水洗干燥镜检5 步骤5.1涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸馏水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。
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简单染色法与革兰氏染色法
（一）细菌的简单染色法
1 目的
1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。
1.2 掌握细菌的简单染色法。
1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。
2 原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。
其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
3 材料
3.1 菌种
枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)约24h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia coli）24h营养琼脂斜面培养物。
3.2 染色剂
吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。
3.3 仪器或其他用具
显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。
4 流程
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
5 步骤
5.1 涂片
取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作（图2-1），分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。
注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
5.2 干燥
室温自然干燥。
也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。
但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。
5.3 固定
如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。
图2-1 涂片、干燥和热固定
5.4 染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。
吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。
5.5 水洗
倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要水流直接冲洗涂面。
水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
5.6 干燥
甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。
5.7 镜检
涂片干后镜检。
涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
（二）革兰氏染色法
1 目的
1.1 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性.
1.2 学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。
2 原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。
经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
3 材料
3.1 菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌
（Bacillus subtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。
3.2 染色剂
结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。
3.3 仪器或其他用具
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。
4 流程
涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
5 步骤
5.1 涂片
5.1.1 常规涂片法
取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。
玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
5.1.2 “三区”涂片法
在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。
再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
5.2 初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
5.3 媒染
用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。
5.4 脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。
脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
脱色时间一般约20～30s。
5.5 复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。
在染色的过程中，不可使染液干涸。
5.6 镜检
干燥后，用油镜观察。
判断两种菌体染色反应性。
菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
5.7 实验结束后处理
清洁显微镜。
先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。
染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。