骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化
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诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化
・文章要点・
该实验选用小香猪作为动物模型， 一是取骨髓非常 方便，用常规骨穿针穿刺即可获得骨髓并可反复抽取； 二是利用小香猪可进行 F9’ 同体移植实验 究结果比较容易用于人的研究。 能否寻找到一种比成骨细胞或成软骨细胞更原始，更具有 增殖能力，同时又能向成骨或成软骨细胞分化的自体细胞尤为 （;+,+*4(Q;12 重要。作者利用小香猪骨髓来源的间充质干细胞 ，在体外分离培养成功诱导了 F9’ 向成骨和成 ,7+; 4+22 ，F9’） 软骨细胞分化， 为进一步的研究打下了基础。 & &= & 材料与方法 骨髓间充质干细胞分离与培养
・论著・
（解放军第三军医大学全军复合伤研究所， 蒙， 刘晓宏， 罗成基， 程天民 重庆 ?%%%@# ）
（F9’ ） 向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。 方法 选用早期贴壁培养的小香 摘要： 目的 探讨小香猪骨髓间充质干细胞 猪骨髓 F9’ ， 在传代两三次后加入条件培养基， 观察了细胞的形态学变化， 同时检测碱性磷酸酶、 钙盐沉积以及细胞外基质和 GG 型 （HFI） 、 地塞米松和 ! J 磷酸甘油钠的作用下， 胶原的表达。 结果 F9’ 在骨形成蛋白 两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形， 细胞体 碱性磷酸酶染色为阳性， 分泌颗粒更加明显， 核固红染色 积增大， &! K &D L 时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌， !% K !D L 时， 为阳性， 表现出成骨细胞的特点； 在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子 J !& 后两三天， 可见细胞由类成纤维状变为圆形或椭 圆形状， 有的呈肾性， 体积增大， 表现为软骨细胞分化的特点。 结论 在一定 &% L 后可见细胞周围有基质分泌， GG 型胶原染色为阳性， 培养条件下成功诱导小香猪骨髓 F9’ 向成骨细胞和成软骨细胞分化 8 为我们进一步的研究打下基础。 关键词： 间充质干细胞； 分化； 成骨细胞； 成软骨细胞 中图分类号： 文献标识码： 文章编号： 5@&# M &"A& J D$!" B !%%! E &# J !"#$ J %!
成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究
磷 酸酶 、 结节、Ｉ 钙 型胶原 和骨钙素 染色阳性 。结论 ：ＭＳ ｓ ｈ Ｃ 取材方便 ． 易诱导分化 为成骨细胞 ， 研究骨组织工程 是
的理 想 种 子 细 胞 。
关 键 词 间质 干 细胞
骨髓细胞
成骨细胞
分化
组 织 工程
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干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。
干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。
在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。
在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。
在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。
从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。
干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。
二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。
2. 定向诱导干细胞分化。
3. 成长曲线测定。
4. 诱导分化后细胞鉴定。
5. 结果统计分析。
干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化及检测
三个方向诱导分化诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化一、诱导方法将细胞悬液置于50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。
完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质)转化生长因子β1 10ng/ml,（左旋）维生素C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞米松0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸钠1mmol/L亚油酸5.35ug/mg牛血清白蛋白1.25ng/ml。
倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。
细胞长成单层后进行传代。
细胞培养3周。
去除培养液,晾干,①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min ,麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。
或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，自来水冲洗15min，双蒸水冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，加人95％乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。
诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化成骨诱导培养: 取第3代细胞, 接种入含体积分数为0.1 的新生牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 抗坏血酸、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。
间充质干细胞成骨特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染色:取成骨诱导14 d 的细胞, 40 g/L 中性甲醛固定15 min, Gomori改良钙钴法染色。
取5 块玻片, 每片随机取2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。
:取第3 代细胞, 以1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
微囊化共培养诱导骨髓间充质干细胞体外定向成骨分化研究
第２ ４卷 第 ６期 ２１ 年 ｌ ００ ２月
高
校
化
学
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程
学
报
ＮＯ ６ Ｖ １ ４ ｂ． ２ Ｄｅ ． ２ Ｏ ｃ Ｏｌ
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文 章 编 号 ： １０ ・０ ５２ ００ －９ ３０ ０ ３９ １ （０１）６０ ９ －７
微 囊 化 共培 养 诱 导 骨 髓 间 充质 干细 胞 体 外 定 向成 骨 分 化研 究
刘 洋 于 滨 滨 １ 王 为 马 小 军 贺 欣 ， ， ２ ， ， ，
（．中国科 学院大连化 学物理研 究所 生物 医学材料 工程组 ， 辽 宁 大连 １６ ２ ； １ ０３ １
ｑ ａ ｔ ａｉｅａ ｄｑ ａｉ ｔ ｅａ ａｙ ｉ ｏ ｌａｉｅｐ ｏ ｐ ａａｅ（ Ｐ ａ ｄｙ ｎＫｏ ｓ ｔｉｉｇ ｗ ｒ ｅｆｒ ｄｔ ｕ ｎｉ ｔ ｎ ｕ ｌ ａｉ ｎ ｌｓｓ ｆａｋ ｌ ｈ ｓ ｈ ｔｓ ＡＬ ） ｎ ｏ ｓａｓａｎｎ ｅｅｐ ｒ ｍｅ ｏ ｔ ｖ ｔ ｖ ｎ ｏ
手段 来评价骨髓 问充质干细胞 向成骨细胞定 向分化。结果表明在体外微 囊化 培养过程 中，被诱 导细胞的胞 内 ＡＬ Ｐ酶 活性逐渐 高于对照 组的干细胞 ，接近于成骨 细胞 ；ＡＬ Ｐ以及 Ｖ ｎＫｏｓ Ｏ ｓａ定性染色证 实被诱导细胞具 有较 高的 Ａ Ｐ活性 Ｌ
以及具有 分泌钙基 质的能力 。微囊 化成骨细胞 和外部干细胞 的其培 养体系较好地模拟 了体内干细胞 向成 骨细胞转化的
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文 章 编 号 ： １０ ・０ ５２ ００ －９ ３０ ０ ３９ １ （０１）６０ ９ －７
微 囊 化 共培 养 诱 导 骨 髓 间 充质 干细 胞 体 外 定 向成 骨 分 化研 究
刘 洋 于 滨 滨 １ 王 为 马 小 军 贺 欣 ， ， ２ ， ， ，
（．中国科 学院大连化 学物理研 究所 生物 医学材料 工程组 ， 辽 宁 大连 １６ ２ ； １ ０３ １
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手段 来评价骨髓 问充质干细胞 向成骨细胞定 向分化。结果表明在体外微 囊化 培养过程 中，被诱 导细胞的胞 内 ＡＬ Ｐ酶 活性逐渐 高于对照 组的干细胞 ，接近于成骨 细胞 ；ＡＬ Ｐ以及 Ｖ ｎＫｏｓ Ｏ ｓａ定性染色证 实被诱导细胞具 有较 高的 Ａ Ｐ活性 Ｌ
以及具有 分泌钙基 质的能力 。微囊 化成骨细胞 和外部干细胞 的其培 养体系较好地模拟 了体内干细胞 向成 骨细胞转化的
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人骨髓间充质干细胞定向成骨诱导分化移植修复腭裂骨缺损的初步临床研究
பைடு நூலகம்
、
资料 和方 法
１ ．临床资料 ： 临床病例纳入 标准 ： Ⅱ度腭 裂患者 ， 深 男女不 限 ， 龄 ２ ５～６０ 岁 ， 均 年 龄 ３４ 岁。裂 隙 最 宽 距 离 年 ． ． 平 ．
＜１５ｃ 无其他全 身或局 部病 变 ， ． ｍ， 均知情 同意。将 ２ ２例患 者 （ Ｉ ８例 ， １ ） 其叶 男 女 ４例 随机分为研究组和对 照组 ， 每组 １ １例患 者 。研究组 ： 自体髂 骨 Ｍ Ｃ 扩增后联合 胶原支架 并进行 成骨 取 Ｓｓ
语音检测 。结果
研究组硬腭骨缺损完全修 复 ， 实验组骨缺损 未 见骨组织修 复。应 用腭 裂语音字表评 测 １ ｌ
例患者语音清晰度 ， ４例达到优 ， ５例结果为 良， 良，约为 ８ ％ ； 优 牢 ２ 应用鼻息镜检测发现鼻漏气得到有效控 制 ，
其 巾 ５例患者 ， 当发… ’ 时腭 喁闭合完全 ， 息镜无凝露产生 。对照组优 ｌ ， ｉ音 鼻 例 良４例 ， ６例 ， ０例 ， 良 差 劣 优
缝合处创 口愈合 良好 ， 所有病例无裂开或穿孑 。４周时两组病例 Ｌ 腭部创 口均已愈合 。术 后 ６个 月复诊 见软腭 动度 良好 ， 诊 时 触
研 究 组 患 者 硬 腭 部 巾线 区 组 织 硬 ， 照 组 患 者 硬 腭 部 巾 线 区组 对
骨细胞诱 导分化 ： 将纳 入临床 研究组 的病例 采用在 局部麻 醉及
１ ．大体观察 ： 术后 ２周拆除保护腭部创 口的碘仿纱布时 ， 腭 部松弛伤 口有肉芽组 织生长 ， 移除碘仿纱 布时有少量渗 『 ， Ｉ 中线 『 Ｌ
对照组 ： 在腭裂骨缺损区仅植入胶原支架 ， 手术亦采用两瓣法。 ２ ．实验方法 ：１ 骨髓 间充质干细胞的分离 、 （） 培养 和定 向成
、
资料 和方 法
１ ．临床资料 ： 临床病例纳入 标准 ： Ⅱ度腭 裂患者 ， 深 男女不 限 ， 龄 ２ ５～６０ 岁 ， 均 年 龄 ３４ 岁。裂 隙 最 宽 距 离 年 ． ． 平 ．
＜１５ｃ 无其他全 身或局 部病 变 ， ． ｍ， 均知情 同意。将 ２ ２例患 者 （ Ｉ ８例 ， １ ） 其叶 男 女 ４例 随机分为研究组和对 照组 ， 每组 １ １例患 者 。研究组 ： 自体髂 骨 Ｍ Ｃ 扩增后联合 胶原支架 并进行 成骨 取 Ｓｓ
语音检测 。结果
研究组硬腭骨缺损完全修 复 ， 实验组骨缺损 未 见骨组织修 复。应 用腭 裂语音字表评 测 １ ｌ
例患者语音清晰度 ， ４例达到优 ， ５例结果为 良， 良，约为 ８ ％ ； 优 牢 ２ 应用鼻息镜检测发现鼻漏气得到有效控 制 ，
其 巾 ５例患者 ， 当发… ’ 时腭 喁闭合完全 ， 息镜无凝露产生 。对照组优 ｌ ， ｉ音 鼻 例 良４例 ， ６例 ， ０例 ， 良 差 劣 优
缝合处创 口愈合 良好 ， 所有病例无裂开或穿孑 。４周时两组病例 Ｌ 腭部创 口均已愈合 。术 后 ６个 月复诊 见软腭 动度 良好 ， 诊 时 触
研 究 组 患 者 硬 腭 部 巾线 区 组 织 硬 ， 照 组 患 者 硬 腭 部 巾 线 区组 对
骨细胞诱 导分化 ： 将纳 入临床 研究组 的病例 采用在 局部麻 醉及
１ ．大体观察 ： 术后 ２周拆除保护腭部创 口的碘仿纱布时 ， 腭 部松弛伤 口有肉芽组 织生长 ， 移除碘仿纱 布时有少量渗 『 ， Ｉ 中线 『 Ｌ
对照组 ： 在腭裂骨缺损区仅植入胶原支架 ， 手术亦采用两瓣法。 ２ ．实验方法 ：１ 骨髓 间充质干细胞的分离 、 （） 培养 和定 向成
骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变
中 国组 织 工 程 研 究 与临床 康 复
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芳 73 拳 貂 1 勇 绔
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2009
e s e a rc
01
h
—
0 1
出版
7 2 009
，
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E n g ~ e e r in g R
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骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导的研究现状
质中， 以骨髓组织中含量最多， 胎儿脐血中赤可分离
得到…。因为在体外不同诱导分化条件下其可分化
Ｃ ３ｌ Ｃ ９ Ｄ１ｔ Ｔ 和 Ｄ ０的 表达 均 呈 阳性 ， Ｃ ３ 、 Ｄ１ 而 Ｄ ４ Ｃ ４和
为成骨细胞 、 软骨细胞 、 脂肪细胞及神经细胞， 具有 多向分化 的潜 能，因此命名 为骨髓 间充质 干细胞
共同刺激通道 ， 导致免疫耐受 ， 因此 Ｍ Ｃ是一种免 Ｓ 疫缺陷细胞。
国外已经建立 了鼠、兔及人 的 Ｂ Ｓ ｓ Ｍ Ｃ 的培养体系 ，
并成功将其诱 导成为各种 结缔组织 。而 国内对于
Ｂ Ｓｓ Ｍ Ｃ 的分离 、 培养及诱导分化的研究刚刚起步 。
１ ＭＳ ｓ的获取 与 分离 Ｂ Ｃ
研 究 表 明 间 充 质 干 细 胞 （ ｅｅｃｙ ａ ｓ ｍ ｍ ｓｎｈ ｍ ｌ ｔ ｅ ｃ１ ， Ｓ ｓ具有如下生物学特性【（ ） ｅｓＭ Ｃ ） １ ６ １细胞 形态呈 Ｉ ：
反应的 ｃ Ｍ 水平［ 但多大浓度最有效尚未形成统 Ａ Ｐ ８ １ 。 目前 的研究观点认为 ， 糖皮质激素对成骨分化既
。
有促进 ， 又有抑制作用 ， 它依赖于使用 的剂量 、 作用 的时间、 细胞所处的阶段和细胞的种类 ， 它对成骨细 胞的作用 尚不清楚［ ９ １ 。低浓度地塞米松对 Ｂ Ｓ ｓ Ｍ Ｃ 成
骨分 化有 促进 作用 。 现在 的观 点认 为 地塞 米松在 １ ０
均匀的梭形。２在不同的条件下可多系统定 向分化 。 （）
维普资讯
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天 津 医 科 大 学 学 报 Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｉ Ｎ Ｉ ＤＣ ＬＵ Ｉ Ｅ ＳＴ Ｏ Ｒ Ａ ＦＴＡ Ｊ ＭＥ ＩＡ Ｎ Ｖ Ｒ ＩＹ Ｎ
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［７ 彭 娴 婧 ， 伟 ， 征 宇 ．闭 塞 性 细 支 气 管 炎 伴 机 化性 肺 炎 的 ｌ １］ 宋 金 』 缶 床表现与 Ｈ Ｃ Ｒ Ｔ特 点 ［ ］ 中 国 医 学 影 像 学 杂 志 ，２ １ Ｊ． ００，１ ８
（） ０ ２ ：１ ６—１ ８ ０．
ｎ ｓａ ｎｅｓｔｌ ｎｕ ｏｉｓ ｉ ｌ ｉｌ ｏｒ ａｏ Ｊ ． ａｄｕｕｌｉｔｒ ｉａ ｐ ｅ ｍ ｎｔ ，ｗｔ ｃ ｎ ａ ｃｒ ｌｉｎ［ ］ ｔｉ ｉ ｈ ｉｃ ｅ ｔ
．
［ ９ 褚海 青 ，任 胜 祥 ．闭 塞 性 细 支 气 管 炎 伴 机 化 性 肺 炎 ２ １］ ４例 临 床
（ 稿 日期 ：００一ｌ 收 ２１ １—１ 编 辑 ： 培 德 ） ６ 林
骨髓 问充 质 干 细胞 向成 骨 细胞 的定 向诱 导 分 化
王埸 ，吴文 ，李正 ，王 小娜
广 东 省 人 民医 院 、 东 省 医 学科 学院 东 病 区 内分 泌 科 （ 州 ５０ ８ ） 广 广 １０ ０
［６ Ａ Ｅ Ｓ பைடு நூலகம்Ｕ，ＨＡ Ｅ Ａ １ ］Ｔ Ｔ ＩＨ Ｓ Ｇ ＷＡ Ｔ，Ｓ Ｋ Ｅ ＩＫ，ｅ ａ．Ｄｓａｅａｔ ｉ ｔ１ ｉ ｓ ｃｉｔ ｅ ｖｙ
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Ａｎ ｉ ｎＰｔｏ， ０ ８， ２ ３ ：１ １—１０ ｎＤａ ａｈｌ ２ ０ １ （ ） ７ ｇ ８．
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骨 髓 由非 贴 壁 的造 血 细胞 和 贴 壁 的基 质 细胞 部 分 组 成 。
骨髓间充质干细胞 由于取材比较容 易、 体外培养具有较
广东医学
２ １ ２月 第 ３ ０ １年 ２卷第 ３期
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