布病检验技术及研

4、血清在进行灭活处理时，温度过高会使血清中的少 量胶原蛋白出现凝固作用，使抗原与抗体无法充分结合， 影响结果判定。 5、氯化钠的含量增高对血清反应有明显的影响，盐的 浓度越高，反应的敏感性提高，因此在兽医界为了克服 凝集反应中的阻抑抗体的干扰，对羊血清采用高渗盐水 作凝集反应，一般浓度在10~12%，切记人血清不能用高 渗盐水（> 10% ）。
影响试验结果的因素及注意事项： 1、受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温 度不能超过10℃，采血后应于3—4日内进行检查， 因放置时 间过长可能会导致血清效价降低。 2、遵守操作规程：所用的器材要清洁、干燥，试剂的 加量一定要正确，放入温箱的温度和时间都要按要 求，否则都影响结果。 3、血清或抗原中含有过多的防腐剂，阻止或妨碍了抗 原的凝集。
试管凝集实验的评价：
• 简便、易操作，适用于各实验室应用。 • 特异性较好，敏感性也高，因此适用于检疫和临床诊
断。 • 有材料报道，人感染布氏菌后常于发烧的第一天起就 开始出现抗体，随着体温的增高效价升高，因此该方 法可做为早期诊断布氏菌病的方法，也可做为判定疾 病的活动期。
• 试管凝集反应的强度与布氏菌培养的阳性结果成正比，
样品（标本）采集要求及采样量 用灭菌注射器无菌操作抽取静脉血5ml、3000转/分离 心15min分离血清备检。 试剂及器材 试管凝集抗原、被检血清、阳性血清、稀释液（0.9% 生理盐水） ；1ml、 10ml 吸管、试管架、37 ℃温 箱、离心机等
抗原稀释
操作步骤
被检血清
SAT
标准比浊管 配置
阳性对照
操作步骤 在玻片上加0.04ml被检血清，然后加入虎红平板抗 原0.04ml，摇匀或用玻璃搅棒混匀，在5min内判定结 果。
质量控制 所用器材洁净，试剂标准，并在有效期内使用，所 加剂量必须准确。血清标本不得发生溶血 结果判定 在5min内出现可见的凝集现象为阳性反应无凝集 现象出现为阴性。 工作时限要求 个案病例，送检材料2日内完成，大批量样本不得 超过7日。如全血不能及时分离血清，可冷藏4°C保 存，但保存期不得超过3日。血清可冷冻保存，保存 期不得超过2月。
玉门市疾控中心
世卫组织建议的检测包括：
• 虎红平板试验(RBT) 血清凝集试验(SAT) Coomb`s试 验 补体结合试验(CFT) ELISA 荧光偏振 布氏菌 培养 PCR • 世卫组织未具体确定流程、取舍值和检测特征（诊断灵敏 性和特异性） • 没有明确的阳性和阴性预测值（PPV & NPV） 结论 取舍值（及灵敏性/特异性）因抗原来源和流程差异而不 同，有待优化 PPV和NPV取决于疾病的流行程度，有待确立 建议 开展检测前，应在设计适当的环境中确定诊断功效（灵 敏性、特异性、PPV和NPV等）
②标准阳性血清冻干品，使用前用蒸馏水溶解至 规定容积。 ③标准阴性血清:冻干品，使用前用蒸馏水溶解至 规定容积。 3、被检血清 ①按常规方法采血分离血清 血清必须新鲜，无 明显蛋白絮凝物、无溶血和无腐败气味。 ②运送和保存血清样品 防止血清冻结和受热， 以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，可用冷藏方 法运送血清。
出现前带现象的原因分析： 做凝集反应实验时，有个别血清会出现前带现象，比 喻为“本来是前面清亮，后面浑浊，而出现前面浑浊， 后面清亮现象”即稀释度低的血清管内（或血清量多的 管）不发生凝集，而稀释度高的管内（或血清量少的管） 出现凝集，这叫做前带现象。如果某血清在虎红平板凝 集反应中出现了前带现象，那么做试管凝集反应时应多 做几个管，多采用几个不同的稀释度进行判定。
1. 2.
3.
4. 5.
“++++”液体完全透明，菌体呈伞状沉淀或块状颗 粒状沉淀，呈100%凝集； “+++” 液体近于完全透明，菌体呈伞状沉淀，呈 75%凝集； “ ++ ” 液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈 50%凝集； “+” 液体不透明，管底有不很明显的伞状沉淀， 呈25%凝集； “-” 液体不透明，无伞状沉淀。 [注]：效价：以产生 50%凝集的(++凝集程度)血清 最高稀释倍数为受检血清的效价。
试管凝集试验（SAT） 补体结合试验（CFT）
用于确诊。
滴度1：10 +及以上。
布鲁氏菌病抗-人免疫球蛋白试验（Coomb’s）
滴度1：400 +及以上。
原理：虎红平板凝集试验(RBPT)中所用的抗原是酸化性 （PH=3.6-3.9）带色抗原，与被检血清作用时能抑制 血清中IgM类抗体凝集活性，检查出的抗体是IgG类。 目的、对布病的诊断意义 排除某些非特异性凝集及某些其它细菌共同抗原与 抗布氏菌血清出现的交叉反应，是一种快速、简便而 有效的实验。该法多用于大规模筛选。
结果判定： 1 、人血清中滴度为 1 ： 50( ± ) 判定为可疑，滴度为 1:100（+）及以上滴度判定为阳性。 2、牛、马、鹿、骆驼等大型动物血清滴度为1：100(+) 及以上者判定为阳性，滴定为1：50(±)为可疑。 3 、猪、羊 ( 绵羊、山羊 ) 、犬等小家畜血清滴度为 1 ： 50(+)及以上者判定为阳性，滴定为1：25(±)判定为 可疑。 对可疑反应的人和动物应在10-25天内重复检查，复查 时主要结合流行病学和临床表现而定，流行病学不成 立者不必复查，复查主要目的是便于进一步确定诊断。
实验前的准备
1、试管的准备 ① 把试管浸泡于带有洗涤剂的温水中30分钟，浸泡后用 试管刷将其刷干净。先用自来水冲洗10遍，再用去离子水冲洗 1遍。 ② 试管冲洗干净后倒置于篮子中，等水沥干后置干燥箱 中，160℃干燥3个小时（整个干燥过程需要5~6个小时）。 ③ 实验前要配置0.5%的石炭酸生理盐水 配置方法： 称取0.5克石炭酸，加入100ml的生理盐水中，配置后置高压锅 中121℃高压30分钟。 2、试剂的准备 ①标准抗原:按照说明书使用。使用时充分摇匀，用稀释 液作1：20(工作浓度)稀释。
凝集滴定越高细菌培养的阳性就越高，同时与临床症 状中的发烧呈正比，一般来说，体温高凝集滴定也会 增高。 • 由于试管试验有时会出现前带现象和封闭现象，所以 有时也出现假阴性结果，必要时和其它检验方法及临 床表现相联合应用。
谢谢大家聆听！
优点：简便、快速、易掌握，敏感性较好；可作为 筛查试验；经济、方便。 注意事项： 1）观察结果在自然光状态下。 2）混合液体面积尽量大，使得抗原和 血清中抗体充分反应。
原理：SAT是一种特异、较敏感、稳定的检测方法，可 以检测人、畜血清中的抗布鲁氏菌IgG、IgM、IgA 3 类免疫球蛋白，且SAT检测IgM的敏感性较高，因此可 作为布鲁氏菌病的早期诊断，同时又可用于布鲁氏菌 病疫苗免疫后血清抗体的检测。 应用：试管凝集试验（SAT）的应用已有近百年历史， 国内外成功地应用到人、畜间布鲁氏菌病的诊断上。 实践证明该试验时一种简便异形，有一定特异性和敏 感性的布病诊断方法。SAT试验操作简便，判定容易， 因此有广阔的应用前景。 检测IgM的敏感性较高。（布病主要产生IgM、IgG 两种抗体）
样品（标本）采集要求及采样量 用灭菌注射器无菌操作采取静脉血5ml置于无菌一 次性采血管内(不加任何抗凝剂的空管采血3-5ml)， 置斜面，分离血清。 所需试剂、仪器设备、试验环境条件 清洁脱脂玻片或凹形孔的玻片、1ml吸管或微量加 样器、微型玻璃搅棒（可用牙签替代）、虎红平板凝 集抗原、被检血清。
抗原的稀释：将试管凝集抗原充分混匀后， 用0.9%生 理盐水做10倍稀释，备用。 标准比浊管的制备：为了判定结果准确，应制备凝集反 应标准比浊管，作为判定透明程度的依据，其配制 方法如下：取凝集反应稀释后的抗原液再作对倍稀 释，即2ml稀释抗原再加2ml盐水，混合后按下表配 制。
管号 1 2 3 4 5 抗原稀释液 （ml） 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 生理盐水（ml） 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 透明度 100% 75% 50% 25% 0% 标记 ++++ +++ ++ + —
胶体粒子学说：血清稀释度低所含的胶体粒子多，它影 响抗原抗体的结合，而稀释度高的则含胶体粒子少，所 以出现凝集。 不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞争抗原， 所以在低稀释度的管中不凝集。 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多 防腐剂，严重污染可造成前带现象的产生，封闭抗原的 干扰。 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多 防腐剂，严重污染可造成前带现象的产生，封闭抗原的 干扰。
3、加入抗原：取出之前稀释好的试管凝集抗原，然后 从第二管开始每管加入0.5ml，加入抗原之后，血清 的最终稀释倍数为从第二管开始1：50、1：100、1： 200、1：400……1:1600，第一管为血清对照。然后 充分混匀，放于37℃温箱中18-20小时后取出，在室 温下放置1-2个小时观察结果。 阳性对照：加入1ml的生理盐水使其溶解（充分溶解 使阳性血清的效价发挥到最大），稀释、加入抗原 （方法、步骤同被检血清样本的操作）。
实验室检查方法
（一） 外周血象
白细胞计数正常或偏低。
淋巴细胞相对或绝对增加，可出现少数异型淋巴细胞。 血沉在急性期加快，慢性期则正常或偏高，持续增速
提示有活动性。
（二） 病原学检查
取血液、骨髓、组织、脑脊液等做细菌培养，急性期
培养阳性率高。
（三） 免疫板凝集试验（PAT）结果为阳性， 用于初筛。
被检血清： 1、每份血清取9支小试管，放于试管架上。 2、血清稀释：第一只管加生理盐水2.4ml，第二只不 加，第三只到第九只管各加0.5ml盐水。然后用1ml吸 管取被检血清0.1ml加入第一管中，混匀后吸1ml加入 第二、三管各0.5ml，第三管混匀后再吸0.5ml加入第 四管，以此类推到第八管吸0.5ml弃掉。