第2章 纯培养与显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术
（Streptococcus lactis）
无乳链球菌（Streptococcus
agalactiae)
溶血链球菌 （ Streptococcus
hemolyticus)
沿两个相垂直的平面进行，分裂后 每四个细胞特征性地连在一起，呈 田字形. 如四联微球菌
（Micrococcus tetragenus）
（3）螺旋菌
螺旋状的细菌称为螺旋菌。 根据其弯曲情况分为： 弧菌（vibrio)：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌 螺旋菌(spirillum)：螺旋满2—6环，螺旋状 例：干酪螺菌 螺旋体(spirochaeta)：旋转周数在6环以上，菌体柔 软。 例：梅毒密螺旋体
Vibrio cholerae
杆菌端部特征
Rod-Shaped Bacterium, hemorrhagic E. coli, strain 0157:H7
Bacillus megabacterium
Legionella pneumophila (causes Legionnaires Disease)
(causes anthrax), Bacillus anthracis
③培养基应少含或不含糖分（尤以细菌）
④试管密封以隔绝空气 优：方法简单，成活率高
缺：保存时间短，传代次数多，易变异。
②石蜡油封藏法
原理：低温、缺氧 方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管 内（油量高出斜面1cm）包扎后竖直放入冰箱 保藏。 说明：①液体石蜡于170℃干热灭菌1h。 ②斜面培养基能干燥则保藏效果好。 ③保藏时间1—2年。 ④适于保藏霉菌、酵母、放线菌及芽孢杆 菌。 ⑤能细菌中种类最多的，工农业生产中所用的细菌大多是 杆菌，如淀粉酶、蛋白酶生产菌--枯草杆菌，谷氨酸生产菌-北京棒杆菌，细菌肥料--根瘤菌，杀虫剂--苏云金杆菌，致 病菌--伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌等。 细菌应用：工业上生产各种氨基酸、核苷酸、酶制剂、乙醇、 丙酮、丁醇、有机酸、抗生素等；农业上用作杀虫菌剂、细 菌肥料的生产和在沼气发酵、饲料青贮等方面的应用；医药 上如各种菌苗、类毒素、代血浆和许多医用酶类的生产等； 以及细菌在环保和国防上的应用等，都是利用有益细菌活动 的例子。 细菌危害：人、动物、植物的传染病、食物和工农业产品腐 烂变质。 2、古生菌 与细菌有着类似的个体形态，但多生活在极端环境中如高温、 高盐、
2 微生物的纯培养和显微技术
2 、 扫描电镜 （ scanning electron microscope, SEM ）
电子束做电子探针在样品表面激发出二 次电子， 二次电子产生的多少与样品表面立体 形貌有关。对 二次电子处理，在荧光屏呈现放 大样品立体图像。 主要用于观察微生物的表面 三、显微镜观察样品的制备 结构。
1 、光学显微镜制样 2 、电子显微镜制样
4m 0m 焦f 距 （ ） 12m 70 m 工离 作 距 4 n光 蓝 2 µ 5 m源 0 . m 3 （ 光的率 ）分 时辨
2 、 特殊功能的光学显微镜
名称 普通光学镜 光源 可见光 特殊装置 视野 亮 样品处理与观 应用 察 染色、清晰 形态结构 观察
暗视野镜 相差镜
可见光 特殊聚光 器 可见光 环状光阑 ，相差板 短波光 滤光片
基分离
富集培养 目的菌验证
选择培养
练习思考题：
利用选择培养基如何筛选： （ 1 ）抗链霉素（ str ）细菌？ （ 2 ）降解利用尿素的细菌？ （ 3 ）分解利用纤维素的细菌 ？ 利用富集培养和选择培养如何分离： （ 1 ） 如何从土壤中分离筛选高温（ 70℃ ）解烃细菌？ （ 2 ） 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
同一 稀释度 培养 20 支
生长者为纯培养物
三、单细胞（孢子）分离
营养琼脂平板不能形成菌落的微生物 解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子 ） 显微镜下用显微操作仪挑选单细胞（孢 子） 操作难度与单细胞（孢子）大小成反比
四、选择培养分离
原理： 创造适于目的微生物生长条件 促使目的微生物快速生长成优势菌 抑制非目的微生物生长 从混杂微生物中选择分离目的微生物 1 、 利用选择培养基直接分离目的微生物 选择培养基（ selective medium ） 只允许特定微生物生长，而同时抑 制或阻止其它微生物生长的培养基。
第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。
（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。
（3）高温干热灭菌。
2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。
二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。
三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。
稀释法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。
四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。
较大的微生物较容易，个体较小的较难。
对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。
五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。
1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。
山东大学微生物学学习指导第2章： 纯培养技术和显微技术
第2章：纯培养技术和显微技术重点与难点剖析一、纯培养技术1、分离获得微生物的纯培养物是研究利用微生物的基础。
获得纯培养物涉及的相关技术包括：无菌技术、微生物的分离与分离纯化技术和微生物培养和保藏技术。
2、无菌技术：包括培养基和物品的各种灭菌技术和微生物各种接种过程的无菌操作技术等。
重点在实验课中掌握相关的技术原理和操作规范，以牢固树立“无菌”的思想和概念。
3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。
自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。
进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体-即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。
固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法：（1）划线平板法将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。
（2）倾注平板法和涂布平板法这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
稀释倾注平板法的操作是：选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液与灭完菌冷却到50-55°C的培养基混合均匀，一起倒入无菌培养皿中，冷却形成平板后，培养。
稀释倾注平板法操作较麻烦。
在进行微生物分离纯化时，该方法需要样品与热的培养基混合，因此对热敏感微生物的影响明显；该方法操作过程中，样品中的微生物有的分布于平板表面，有的则裹在培养基中，后者则会影响严格好氧微生物的生长；而且，对于同一种微生物，平板表面的菌落形态与培养基内的菌落形态会存在着明显的差别，影响菌落形态的判别。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
4、稀释摇管法（dilution shake culture method）
四 、液体培养基分离纯培养
1、原因
不是所有的微生物都能在固体培养基上生 长 。例如：许多原生动物、藻类、大细胞细菌 等。
2、方法
稀释法 （必须在同一个稀释度的许多平行试 管中，应超过95%表现为不生长）
五、单细胞（孢子）分离
有性繁殖：细菌结合
conjugation
2、放线菌
1）菌丝形态： 营养菌丝、气生菌丝和孢子丝（鉴定指标）
Chain of conidiospores
Aerial hyphae
Agar surface
Substrate mycelium
孢子丝不同形态
3、古生菌
古生菌与细菌具有类似的个体形态，但它们多生活 于一些生存条件十分恶劣的极端环境中，例如高温、 高盐、高酸等 。
直接采取显微分离法从混杂群体中 直接分离单个细胞或单个个体进行培 养以获得纯培养。
六、选择培养分离
（一）原因：
1、单一培养不能满足所有微生物生长。 2、微生物对培养条件的选择。 3、微生物对营养的竟争。
（二）分离方法 1、利用选择平板进行直接分离
依据：利用微生物自身特点选择分离条件，如 耐高温、产特殊酶类等。
高压蒸汽灭菌锅
超净工作台
三、固体培养基分离纯培养
（一）相关概念
1、菌落（colony） ：单个微生物在
适宜的固体培养基表面或内部生长、繁 殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有 一定形态结构的子细胞生长群体 。
2、菌苔（lawn） ：当固体培养基表
面众多菌落连成一片时，便成为菌苔 。
细菌菌落形态
（二）微生物分离的手段
第二章 纯培养和显微技术
3、单细胞（孢子）分离法
解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子） 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行； 操作难度与细胞或个体的大小成反比；
4、选择培养分离法
原理：
创造适于目的微生物生长条件； 使待分离的目的微生物成为优势菌； 抑制大多数其它非目的微生物；
• 方法：
• 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 • 2. 富集培养
三、显微观察样品的制备
• （1）光学显微镜制样 • 有活体直接观察和染色观察 • 悬滴法
• 活体观察
• •
压滴法
菌丝包埋法
（2）细菌染色法:
种类
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法
细胞壁染色法
抗酸染色
革兰氏染色
• 步骤： • 固定（加热固定、化学剂固定） • 染色
第二章思考题： 1、利用选择培养基如何筛选： （1）抗链霉素（str）细菌？ （2）降解利用尿素的细菌？ （3）分解利用纤维素的细菌？ 2、利用富集培养和选择培养如何分离： （1） 如何从土壤中分离筛选高温（70℃）解烃细菌？ （2） 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
• 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 • 抑制性选择培养基（selective medium）:
•
根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、 物理因素的抗性而设计，只允许特定微生物生长， 而同时抑制或阻止其它微生物生长的培养基。
•
例一：从土壤中分离筛选蛋白酶产生细菌
含牛奶选择培养基目的菌的平板
常用的灭菌方法：
第2章 微生物的纯培养和显微技术
荧光显微镜
荧光：荧光素吸收紫外线会转放出可 见光，这就是荧光 荧光显微技术：把标本用不同的荧光 素作标记，在荧光显微镜下，经 过紫外线照射，标本会在黑暗背 景下表现出有光亮的物体。使标 本更便于观察。
透射电子显微镜
用电子波代替光源，最短波长的可见光 λ=450nm；而电磁波的波长最短可以达到 λ=0.005nm。所以，电镜的分辨率远高于光 学显微镜。
通冰箱冷冻室保存。
干燥保藏——砂土管保存法和冷冻真空干燥
保藏法
纸片保藏法、薄脉保藏法、寄主保藏法等
第二节 显微镜和显微技术
决定显微观察效果的两个重要因素：
分辨率：指能辨别两点之间最小距离的 能力 反差：指样品区别于背景的程度
一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜
光学显微镜的分辨率(最小分辨距)：
D=0.5λ/n sinθ
式中λ为光源波长； n为玻片到物镜介质的
折射率； θ为物镜镜口角的半数，它取决于物镜 的直径和工作距离。 n sniθ叫作数值孔径。不 同介质的折射率：空气为n=1.0 ；水n=1.33；香 柏油n=1.55。因此，油镜的分辨率高。
暗视野显微镜
暗视野显微镜利用特殊聚光器实现 给样品斜射照明，由样品反射或折射的
非细胞型微生物：病毒、类病毒、朊病毒
一、细菌和古生菌
•细菌的形态和排列
形态：球状—球菌，杆状—杆菌，螺旋状——螺菌和 弧菌。 排列：单个、成对、链状、成簇 特殊形态的细菌 如柄细菌有柄、菌丝、附器等 球衣菌有衣鞘 支原体无细胞壁，只有细胞膜，故柔软形态多变 有些细菌不同生长阶段具有不同形态：如放线菌 形成营养菌丝、气生菌丝和孢子丝。 细菌的形态也受环境条件的影响，培养时间、培 养温度等均能引起形态的改变。
第二章微生物的纯培养和显微技术
第一节 微生物的分离和纯培养 第二节 显微镜和显微技术 第三节 显微镜下的微生物
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术（aseptic technique）
1、概念：在分离、转接及培养纯培养物时 防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操 作环境的技术。 2、方法：器具、培养基及其灭菌
接种操作——无菌操作
菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同， 给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。
保藏的方法： 传代培养保藏 4℃ 冷冻保藏 -196℃，-70℃，-30～-20℃ 干燥保藏法 沙土管，安瓿管（冷冻真
空干燥保藏，最普遍最重要）
第二节 显微镜和显微技术
绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察 极限，因此一般必须借助显微镜放大系统的作用， 才能看到它们的个体形态和内部结构。
除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重 要因素，分辨率和反差。分辨率是指能辨别两点之 间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的 程度，它们与显微镜的自身特点有关，也取决于进 行显微观察时对显微镜的正确使用以及良好的标本 制作和观察技术，这就是显微技术。
现代显微技术不仅仅是观察物体的形态、 结构，而且发展到对物体的组成成分的定性 和定量，特别是与计算机技术结合出现的图 像分析、模拟仿真等技术，为探索微生物的 奥秘提供了强大武器。
五、选择培养
1、选择平板培养 根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件 （对于从自然界中分离、寻找有用的微生物十分 重要，如从土壤中筛选蛋白酶产生菌，分离高温 菌，分离某种抗菌素抗性菌株）
2、富集培养 加富性选择培养基（投其所好）--对羟基苯甲酸 抑制性选择培养基（取其所抗）--致病性肠道杆菌
六、微生物的保藏技术
纯培养和显微技术
二、用固体培养基分离纯培养
固化剂
柯赫（Robert Koch） 的助手W Heese和 他的夫人Fran Heese
参见P15
琼脂
培养基： 液体培养基； 固体培养基； 半固体培养基；
菌落（colony）：
01
单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体。 （P15，倒数第2段）
明亮的标本在黑暗的背景中
观察未染色的活菌体或难以染色的微生物，可以观察其运动情况
相差显微镜
使用可见光加物镜中的相板，并通过特殊聚光器使部分光线照到标本后以不同相彼此分开
样本呈现出不同的亮度和暗度
详细观察未染色的活体微生物内部结构
透射电子显微镜
使用电子束代替光束，电磁透镜代替光学透镜；图像被投射在荧光屏上；价格昂贵；准备工作耗时，并需经验
常用的器具：
(具体灭菌方法第6章介绍) 高温干热灭菌 高压蒸汽灭菌 试管、瓶子、培养皿等 常用的灭菌方法： 1、微生物培养的常用器具及其灭菌 参见P14
无菌操作：
接种操作 火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行 参见P15
二、用固体培养基分离纯培养
参见P15
培养基： 液体培养基； 固体培养基； 半固体培养基；
一、显微镜的种类及原理
透射电子显微镜；6. 扫描电子显微镜
参见P25
一、显微镜的种类及原理
透射电子显微镜；6. 扫描电子显微镜
参见P25
类型
特点
现象
用途
明视野显微镜
使用可见光，操作最简单，价格最便宜
染色或透明标本处在明亮的背景下
观察染过色的死菌体或具明显反差的带色活菌体
第二章微生物的纯培养和显微镜技术
第二章微生物的纯培养和显微镜技术2．纯培养和显微技术一、纯培养技术1、无菌技术包括两方面的内容：（1）用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；(2)在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；2、分离纯化技术（1）固体培养基分离纯培养技术微生物个体微小，常以群体混合状态存在，将单个细胞从群体中分离出来，即纯培养。
菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：众多菌落连成一片。
获得纯培养的方法有：倾注平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！平板划线法：厌氧微生物的分离：（2）液体培养基分离纯培养稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
（3）选择培养分离：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。
使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。
3、单细胞分离技术用显微操作仪，在显微镜下进行。
难度与细胞或个体的大小成反比，局限于高度专业化的科学研究中。
4、选择培养分离选择平板：抑制大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。
富集培养：造成有利于某种菌生长的环境。
（1）利用选择平板进行直接分离高温培养分离嗜热菌，培养基中不含有N，分离固氮菌；培养基中含有抗生素分离抗生菌。
牛奶培养基分离产蛋白酶菌株。
（2）富集培养利用不同微生物之间的生长特性不同，制定特定的环境条件，使仅适合条件的微生物旺盛生长，从而使其在为生物群落中的比率大大增大，易于从群落中间将墓地君主分离出来。
5、二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物。
如病毒与宿主；蛭弧菌与和E.coli.6、微生物的保藏技术影响微生物菌种稳定性的因素：a. 变异；b. 污染；c. 死亡基本要求：在一定时间内使菌株不死，、不变、不乱基本方法生活态：培养基传代培养（斜面、平板、半固体），多见于冰箱4℃培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2)电子带电荷，电镜是用电磁圈 使之聚焦 3)电子像人眼看不到，用荧光屏 显示或感光胶片记录
透大 射肠 电杆 子菌 显 微 镜 图
二、显微镜和显微技术
扫描电子显微镜（SEM）
大肠杆菌扫描电镜图
扫描电子显微镜
二、显微镜和显微技术
显微镜种类和原理：
决定显微观察效果重要因素：分辨率和 反差 分辨率：辨别两点之间最小距离的能力 反差：样品与背景区别程度
普通显微镜
机械装置：镜座、支架、载物台、 调焦螺旋 光学系统：物镜、目镜、聚光器 普通显微镜结构示意图
二、显微镜和显微技术
光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？
其横向分辨率：0.1～0.2nm，纵向分辨率：0.001nm
这种分辨率足以对单个原子观察。
利用这种显微镜直接观察蛋白质、DNA、RNA等以及 CM、virus等结构。
扫描隧道显微镜下的DNA 棉纤维上的汗垢
厨 房 抹 布 上 的 细 菌 和 霉 菌
二、显微镜和显微技术
显微样品制备
样品好坏直接影响观察结果。
二、显微镜和显微技术
分辨率与所用波长成反比！
二、显微镜和显微技术
N：玻片与物镜间介质的折射率
空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）
显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质
二、显微镜和显微技术
光线在穿过折射率不同的介质时发生折射
二、显微镜和显微技术
浸没油与玻璃的折射率相近 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。
一、微生物的分离和纯培养
单细胞（单孢子）显微分离：
稀释法缺点
分离的优势菌
显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯培养
显微操作仪，专业程度高
一、微生物的分离和纯培养
选择培养分离方法：
对某微生物生长需要了解后，设计适合其生长繁殖的培 养基，抑制其他菌生长，即使该微生物在混杂群体中很
少也可分离。
ห้องสมุดไป่ตู้
一、微生物的分离和纯培养
二、显微镜和显微技术
相差显微镜
二、显微镜和显微技术
相差显微镜
光线透过透明标本，波长（颜色）和振幅（亮度） 没有多大变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态 和内部结构难以分辨。细胞各部分折射率和厚度不同， 当光线通过时，直射光和衍射光光程有差别，而人眼 看不到，但是可通过相差显微镜看到。 相差显微镜采用特殊光学装置：环状光阑和相差板， 利用光的干涉，将光的相位差转变为人眼可见的振幅 差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某 些显微结构。其发明人F.Zernike因此获1953年诺贝尔 物理奖。
二、显微镜和显微技术
暗视野显微镜
活细菌在普通显微镜下是透明，观察不清，采用暗 视野显微镜，如：黑夜看星星就很清楚。
暗 视 野 显 微 镜 结 构 与 照 明 示 意 图
二、显微镜和显微技术
暗视野显微镜
特殊聚光器实现斜射照明，给样品照明的光线不直接 穿过物镜，而经样品反射或折射后进入物镜，使样品 与背景差别大，可以清楚看到透明微小颗粒。用于： 生活细菌运动性观察。
负染技术简便易行，病毒、细菌鞭毛、离 体细胞器、蛋白质和核酸可用此方法观察。
二、显微镜和显微技术
透射电镜制样
投影技术：
真空蒸发设备将铂或铬等对电子散射能力强的金属原子，由 样品斜上方喷镀，提高样品反差。可用于病毒、细菌鞭毛、 离体细胞器、蛋白质和核酸等观察。
超薄切片技术：
微生物个体虽小，微弱电子束无法透过整体标本，需制成 100纳米以下的超薄切片才能看清内部细微结构。基本操作 过程：取样、固定、脱水、浸透与包埋、切片、捞片、染色、 观察。
课后练习题
1.常用的固体分离纯培养都有哪几种？如何操 作？ 2.分析、比较各类显微镜在原理、样品制备和 观 察方面的异、同。 3.名词解释： 菌落 纯培养 平板 富集培养 二元培养物
考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样 方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用各种 方法提高反差。
二、显微镜和显微技术
显微样品制备之
压滴法 悬滴法 菌丝埋片法
光学显微镜制样
光学显微镜制样
活体观察
染色
死菌 简单染色 鉴别染色
活菌
美蓝染色
革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色
二、显微镜和显微技术
光学显微镜样品制备－－活体观察
中国微生物菌种保藏委员会 （CCCCM)，中国典型培养物 保藏中心（CCTCC），美国 典型菌种保藏中心（ATCC） 等
为何保藏
如何保藏
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则 生产或科研都无法正常进行。 要求：菌种不死，不污染，不变
一、微生物的分离和纯培养
微生物菌种保藏技术：
根据菌种特性和保藏目的不同， 给特定环境使其存活而得以保存
特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄 食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察
压滴法：菌悬液滴载玻片，加盖玻片直接观察 悬滴法：盖玻片滴一滴菌悬液，反转置于特制凹载玻 片直接观察
菌丝埋片法：无菌小玻璃纸铺平板表面，涂布孢子悬 液，培养后，取下玻璃纸置于载玻片，观察
二、显微镜和显微技术
光学显微样品制备－－染色观察
一、微生物的分离和纯培养
接种操作，最基本技术
接种针或接种环分离或将微生物从一个培养器皿转
接到另一个，无菌操作。火焰旁边、超净台或无菌室
进行。
接种环采用迅速加热和冷却的镍铬合金制备
液体培养物用无菌移液管或移液器
一、微生物的分离和纯培养
超净台
火焰旁无菌区
一、微生物的分离和纯培养
用固体培养基分离纯培养
用于分离、培养微生物。
一、微生物的分离和纯培养
常用固体分离纯培养方法：
稀释平板法（pour plate method)
将细菌或其他微生物无菌水梯度稀释，取少量与冷 却至50℃固体培养基混合，摇匀，倒入培养皿，凝 固，倒置培养24小时，就会出现菌落。
一、微生物的分离和纯培养
稀释平板法
一、微生物的分离和纯培养
混合培养物
培养物
纯培养物
纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一
个体小
显微技术是微生物研究的另一项重要技术
一、微生物的分离和纯培养
无菌技术（aseptic technique)
分离、转接、纯化时防止其他微生物污染的技术
一、微生物的分离和纯培养
微生物培养常用器皿及灭菌
试管、烧瓶、培养皿等常用器皿 灭菌方法有：高压蒸汽灭菌、高温干热、煮沸
二、显微镜和显微技术
荧光显微镜
荧光素吸收uv放出波长较长的可见光，因此在uv照射下， 发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体，为荧 光显微技术原理。在免疫学和分子生物学应用广泛。
二、显微镜和显微技术
荧光显微镜
二、显微镜和显微技术
透射电子显微镜（简写TEM）
用波长短的电磁波取代可见光， 使分辨率提高。
目镜：10 ~ 15 ╳；物镜： 100 ╳；总放大倍数1000~1500 ╳；
如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？ 使用油镜，即在100 ╳物镜和载玻片之间滴加香柏油； 香柏油与玻璃折射率相近
二、显微镜和显微技术
0.5 l 分辨率（最小可分辨距离）= ———— n sin q
分辨率与所用波长成反比！
接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等 划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。
平板划线分离
一、微生物的分离和纯培养
稀释摇管法(dilution shake culture method）
厌氧微生物可用此法进行纯培养分离。
操作：盛培养基试管加热融化，冷却至50℃， 待分离 材料用这些试管梯度稀释 ，摇匀，冷凝，石蜡封口
活体观察难看到微生物的细致形态和结构，需染色观察。
染色前需要对样品固定，目的：杀死细菌使菌体黏附在
玻片上；还可增加对染料的亲和力。
常用：酒精火焰加热和化学固定两种方法
二、显微镜和显微技术
枯草杆菌革兰氏染色
大肠杆菌革兰氏染色
二、显微镜和显微技术
显微样品制备之
电镜制样
电镜制样 样品观察前要固定和干燥，一般要重金属盐染色或喷镀， 提高反差，使电子图像清晰。
二、显微镜和显微技术
显微样品制备之
电镜制样
透射电镜制样
覆盖有支持网的载网（一般为铜网、不锈钢、 金、银等）
负染技术：电子密度高、本身不显示结构、
与样品几乎不反应的物质，如：磷钨酸钠进 行染色。 重金属盐不被样品吸附沉积在四周，若样 品具有表面结构，重金属盐就进入表面凹陷 部分，通过散射电子能力差异把样品外形和 表面结构衬托出来。
菌落(colony)：单个微生物在固体 培养基或内层）生长繁殖形成肉眼 可见的，有一定形态结构的子细胞 生长群体。
各种菌落
菌落连成片为菌苔（lawn）
一、微生物的分离和纯培养
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征
（形状、颜色等），是微生物分类、鉴定的重要依据。
一、微生物的分离和纯培养
工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激 发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。 电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于 荧光屏上。 主要用于：样品表面结构
二、显微镜和显微技术
扫描隧道显微镜（STM）
80年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。
一、微生物的分离和纯培养
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落