谷氨酸棒杆菌S9114摇瓶发酵产γ-氨基丁酸的研究
γ-氨基丁酸及其在谷物发酵食品中的研究进展
γ-氨基丁酸及其在谷物发酵食品中的研究进展
俞德慧;杨杨;陈凤莲;范婧;边鑫;王冰;王梦桔;刘思淼;邢文静;张娜
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2022(48)11
【摘要】γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是广泛存在于动物、植物、微生物中的一种功能性成分,具有治疗焦虑、降血压、抗糖尿病、抗癌、治疗癫痫、哮喘等多种生物活性,GABA在天然谷物中含量普遍较低,但通过微生物发酵处理可有效富集。
该文综述了GABA的作用机理、代谢途径、合成方法及生理功能,并对富含GABA的谷物发酵食品研究现状进行了系统阐述,为后期开发更多富含GABA 的谷物发酵食品提供理论依据。
【总页数】7页(P290-296)
【作者】俞德慧;杨杨;陈凤莲;范婧;边鑫;王冰;王梦桔;刘思淼;邢文静;张娜
【作者单位】哈尔滨商业大学食品工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.内蒙古传统谷物发酵食品-酸粥中益生乳杆菌的体外筛选
2.谷物中γ-氨基丁酸(GABA)富集工艺的研究进展
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4.γ-氨基丁酸的生理功能及其在食品中的应用研究进展
5.微生物发酵法降解谷物中抗营养因子的研究进展
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产γ-氨基丁酸益生菌的研究
产γ-氨基丁酸益生菌的研究邹建勋;毛茂;张丽宁;李慧丹;楼徐栋;陈蔚青【摘要】益生菌是对人体健康具有促进作用的活性微生物,具有食用安全性.从酸乳制品中筛选出一株具有产γ-氨基丁酸能力较高的菌株,经形态学观察、生理生化检验和16S rDNA序列分析,初步鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis),属益生菌范畴.经培养基和发酵条件优化,发酵液中γ-氨基丁酸的含量可达2.03 g/L.以该菌株为出发菌株进行紫外诱变处理,得到一株突变菌株,γ-氨基丁酸产量达2.31 g/L,与出发菌株相比提高了11.4％.经过多次传代,稳定性较好.研究结果有助于拓宽益生菌产品应用领域.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2015(044)001【总页数】6页(P22-27)【关键词】益生菌;短乳杆菌;γ-氨基丁酸;鉴定;优化;紫外诱变【作者】邹建勋;毛茂;张丽宁;李慧丹;楼徐栋;陈蔚青【作者单位】浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州310015;浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州310015;浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州310015;浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州310015;浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州310015;浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州310015【正文语种】中文【中图分类】Q939.9γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是由谷氨酸脱羧生成的非蛋白质组成型氨基酸。
它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性，是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，在中枢神经系统中作为抑制性神经递质起作用[1-3]。
GABA具有降血压、调节心律失常、促进精神安定、调节激素分泌、增进脑活力、营养神经细胞、改善更年期综合症等功效，在医疗保健方面有着重要作用[4-9]。
益生菌（probiotics）是指来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的活性微生物。
微生物发酵法制备γ—氨基丁酸的研究进展
微生物发酵法制备γ—氨基丁酸的研究进展作者：杨宏芳朱宏阳李泳宁王金海林伟铃来源：《安徽农业科学》2017年第24期摘要γ-氨基丁酸（GABA）是一种广泛存在于动植物体内的非蛋白质天然氨基酸，具有重要的生理活性，在医疗、食品加工等领域应用广泛。
论述了微生物发酵法生产GABA及乳酸菌的诱变选育和发酵条件优化等方面的研究进展。
关键词γ-氨基丁酸；乳酸杆菌；研究进展Research Progress on the Preparation of γ-aminobutyric Acid by Microbial FermentationYANG Hong-fang，ZHU Hong-yang*，LI Yong-ning et al （Fujian Health College，Fuzhou，Fujian 350101 ）Abstract γ-aminobutyric acid is one of non-protein natural amino acids which widely exists in animals and plants.GABA has wide application in the medical and food industries due to its important physiological activity.This paper discusses the GABA production by microbial fermentation and the research progress of mutation breeding of lactic acid bacteria and its optimization of culture medium.Key words γ-aminobutyric acid；Lactic acid bacteria；Research progressγ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA，又称氨酪酸），分子式为C4H9NO2，分子量103.12，是广泛存在于动物、植物和微生物中的一种非蛋白质天然氨基酸[1]。
益生菌生物转化制备γ-氨基丁酸的研究
益生菌生物转化制备γ-氨基丁酸的研究益生菌生物转化制备γ-氨基丁酸的研究摘要：益生菌是一类对人体有益的微生物，其代谢产物γ-氨基丁酸在人体中具有多种生理功能。
本文通过益生菌生物转化制备γ-氨基丁酸的研究，探索了不同条件对于γ-氨基丁酸产量的影响，并分析了可能的生理机制。
结果表明，在适当的培养条件下，益生菌能够高效地合成γ-氨基丁酸，为其广泛应用提供了重要的理论和实践基础。
关键词：益生菌；γ-氨基丁酸；生物转化；产量；生理功能引言γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种重要的非蛋白氨基酸，存在于动植物组织中，具有多种生理功能。
在人体中，GABA是一种重要的抑制性神经递质，能够通过β-受体抑制脑细胞的兴奋性，具有镇静、催眠和抗焦虑等作用。
此外，GABA还具有降血压、抗抑郁、抗炎和增强免疫力的功能。
因此，GABA在医药、保健品及食品工业中具有广泛的应用前景。
目前，合成GABA的方法主要包括化学合成和微生物转化两种方式。
化学合成方法虽然能够得到高纯度的GABA，但存在成本高、环境污染等问题。
而微生物转化法具有环境友好、产能高和多样性等优势，受到广泛关注。
其中，益生菌作为一类对人体有益的微生物，应用于GABA的生物转化制备中具有重要的潜力。
本文旨在探索益生菌生物转化制备GABA的条件和生理机制，为其产业化应用提供理论和实践基础。
材料与方法1. 样品准备选择常见的益生菌菌株，如嗜热菌属（Thermophilus）、酸乳菌属（Lactobacillus）等，通过菌种活化保存，并在适宜的培养基中培养。
2. 益生菌生物转化试验将培养好的益生菌菌株接种到含有合适基质的培养基中，控制培养温度、pH值和培养时间，观察GABA的产量。
3. GABA含量测定采用高效液相色谱法检测GABA的含量，建立标准曲线，通过外标法计算样品中GABA的浓度。
结果与讨论通过益生菌生物转化试验，我们观察到不同条件对于GABA产量的影响。
1株产γ-氨基丁酸菌株的分离鉴定及发酵特性研究
1株产γ-氨基丁酸菌株的分离鉴定及发酵特性研究作者：陈国伟贾娇杜丹解修超耿敬章邓百万来源：《福建农业科技》2021年第12期摘要：對谢村黄酒酒曲中细菌进行分离，利用薄层层析法定性、柱前衍生高效液相色谱法定量筛选出1株产γ-氨基丁酸（Gama-aminobutyric，GABA）能力的菌株N1，通过对该菌株进行形态学观察、生理生化试验、16S rDNA序列分析鉴定，并绘制其生长曲线，研究谷氨酸钠（L-MSG）的添加量、发酵时间、发酵温度等对菌株N1发酵产GABA含量的影响。
结果表明：经初筛得到的菌株N1，复筛测得发酵液中GABA含量为448.6 mg·L-1。
结合形态学、生理生化及分子生物学鉴定菌株N1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，菌株N1在液体培养0～4 h处于延滞期，4～12 h处于指数期，12～16 h为稳定期，16 h之后为衰退期; 菌株N1最适培养条件为发酵时间72 h、发酵温度36℃、pH值6、接种量2%、装液量100 mL、谷氨酸钠添加量1%，在此条件下菌株N1发酵产GABA含量可达583.5 mg·L-1。
关键词：谢村黄酒酒曲;γ-氨基丁酸;分离鉴定;发酵特性中图分类号：Q 93-331 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）12-0012-07DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2021.12.003Isolation， Identification and Fermentation Character istics of γ-aminobutyric acid-producing StrainsCHEN Guo-wei1， JIA Jiao1， DU Dan1，3， XIE Xiu-chao1，2*， GENG Jing-zhang1，DENG Bai-wan1，2（1. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology，Hanzhong， Shaanxi 723000， China;2. Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;3. Xianyang Academy of Agricultural Sciences， Xianyang， Shaanxi 712000， China）Abstract： The bacteria in the yellow rice wine koji of Xiecun were isolated， and a strain N1 which was capable of producing γ-aminobutyric acid （GABA） was quantitatively screened by using the methods of thin layer chromatography and precolumn derivatization high performance liquid chromatography. The morphological observation， physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequence analysis and identification of the strain were carried out， and its growth curve was plotted， in order to study the effects of the addition amount of sodium glutamate （L-MSG），fermentation time and temperature on the content of GABA produced by the strain N1. The results showed that the content of GABA in the fermentation broth was 448.6 mg·L-1 after the initial screening. Combined with the identification of morphology， physiology， biochemistry and molecular biology， the strain was identified as Bacillus subtilis. The strain was in the lag phase from 0 to 4 h after the liquid culture， the exponential phase from 4 to 12 h， the stable phase from 12 to 16 h， and the decline phase after 16 h. The optimum culture conditions for the strain N1 were as follows： fermentation time 72 h， fermentation temperature 36℃， pH value 6， inoculation amount 2%， liquid volume 100 mL， and sodium glutamate 1%. Under these conditions， the content of GABA produced by the strain N1 could reach 583.5 mg·L-1.Key words：Yellow rice wine koji of Xiecun; γ-aminobutyric acid; Isolation and identification; Fermentation characteristics黄酒（Huangjiu）源于中国，是世界三大酿造酒之一，被誉为“液体面包”[1-3]，具有悠久的文化历史，是我国古代礼仪的象征[4]。
稻谷发芽富集γ-氨基丁酸研究
稻谷发芽富集γ-氨基丁酸研究吕庆云;周坚;贾喜午【期刊名称】《粮食与饲料工业》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】以收获干燥后的普通稻谷和不同水分含量的高水分稻谷为原料,研究稻谷发芽富集γ氨基丁酸(GABA)的工艺.通过测定爆腰率、发芽率、富集后GABA含量及干物质损失率几项指标,分析初始原料水分、浸泡温度、浸泡时间、富集温度、富集时间对GABA富集工艺的影响,并且利用多元回归建立了富集后GABA含量的预测模型.结果表明,使用高水分稻谷发芽,得到的发芽糙米爆腰率极低,大大提高了产品的品质,建立的预测模型能较好地预测富集后GABA含量.【总页数】5页(P1-5)【作者】吕庆云;周坚;贾喜午【作者单位】武汉轻工大学食品科学与工程学院//农产品加工湖北省协同创新中心,湖北武汉430023;武汉轻工大学食品科学与工程学院//农产品加工湖北省协同创新中心,湖北武汉430023;武汉轻工大学食品科学与工程学院//农产品加工湖北省协同创新中心,湖北武汉430023【正文语种】中文【中图分类】TS210.1【相关文献】1.Box-Behnken法优化发芽糙米富集γ-氨基丁酸条件研究 [J], 韩涛;陈野;纪绪前;郑晓晨;宋佳;刘环2.发芽糙米γ-氨基丁酸富集工艺的研究进展 [J], 张良晨;李东红;于淼;刘晓晶3.双响应值联合优化发芽糙米脉冲强光杀菌耦合γ-氨基丁酸富集技术研究 [J], 张良晨; 李东红; 于淼; 刘晓晶4.海蓬子发芽富集γ-氨基丁酸和黄酮类化合物的条件优化及关键酶活性的研究 [J], 王杰; 王笃军; 李凤伟; 商曰玲; 卜雯丽; 丁霄霄; 余晓红5.亚精胺促进发芽大豆γ-氨基丁酸富集的工艺研究 [J], 何旭东;徐佳宁;方维明;尹永祺因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产γ-氨基丁酸菌株的筛选与发酵
产γ-氨基丁酸菌株的筛选与发酵1. 实验目的（1）学习运用代谢控制发酵理论设计筛选产γ-氨基丁酸菌株的方法。
（2）对5L发酵罐的使用方法有初步了解。
2. 实验原理γ-氨基丁酸在茶叶、米胚芽等植物细胞中含量较多，可直接提取制备。
或者利用大肠杆菌，霉菌和乳酸菌等微生物细胞生产γ-氨基丁酸也同样可以达到很高的产量。
在微生物细胞中，一分子谷氨酸（L-Glu）在有一个H+存在的条件下脱去α-羧基得到一分子γ-氨基丁酸和一分子CO2（L-Glu+ H+→GABA+CO2），催化反应的酶是谷氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.15，GAD）。
谷氨酸脱羧酶是GABA合成过程中的唯一关键限速酶，最适pH在4-6之间，底物谷氨酸对它有激活作用。
在反应过程中随着H+的消耗，培养基pH会逐渐升高，当pH大于6.8时，能够使溴甲酚紫由黄变紫。
还原糖可作为微生物生长发育的碳源和能量来源，pH是调控GAD活性的关键因素，OD600可以用来衡量菌体量的多少，L-Glu和GABA的浓度变化直接反映出底物转化率和产量。
因此，在5L发酵罐的发酵试验中，需要对以上几个因素进行检测，以便为优化发酵条件提供试验依据。
3. 实验材料（1）酸菜汤：来自于市售酸菜或家庭自制的东北酸菜。
（2）培养基初筛培养基：在MRS培养基中加入溴甲酚紫0.2%，L-Glu 3%（可用同物质的量的谷氨酸钠代替）和琼脂粉2%，pH5.0，121℃灭菌20min。
溴甲酚紫用过滤器除菌。
种子培养基：液体MRS培养基。
发酵培养基：在液体MRS培养基中加入3%的L-Glu（可用同物质的量的谷氨酸钠代替），pH5.0。
L-Glu可用110℃灭菌10min，以减少高温高压条件下的损失。
（3）仪器及其他用具5L发酵罐，紫外分光光度计，高效液相色谱仪，层析缸，培养皿，锥形瓶，试管，pH计等。
4. 实验步骤及方法（1）以无菌操作，用移液管取酸菜汤汁1mL吹于装有9mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，再从这支试管中取1mL吹于下一支装有9mL生理盐水的试管中，充分震荡摇匀。
微生物发酵法制备γ-氨基丁酸的研究进展
微生物发酵法制备γ-氨基丁酸的研究进展
杨宏芳;朱宏阳;李泳宁;王金海;林伟铃
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2017(045)024
【摘要】γ-氨基丁酸(GABA)是一种广泛存在于动植物体内的非蛋白质天然氨基酸,具有重要的生理活性,在医疗、食品加工等领域应用广泛.论述了微生物发酵法生产GABA及乳酸菌的诱变选育和发酵条件优化等方面的研究进展.
【总页数】3页(P76-78)
【作者】杨宏芳;朱宏阳;李泳宁;王金海;林伟铃
【作者单位】福建卫生职业技术学院,福建福州 350101;福建卫生职业技术学院,福建福州 350101;福建卫生职业技术学院,福建福州 350101;福建卫生职业技术学院,福建福州 350101;福建卫生职业技术学院,福建福州 350101
【正文语种】中文
【中图分类】TQ921+.4
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谷氨酸棒杆菌S9114摇瓶发酵产γ-氨基丁酸的研究斯晗;史锋【摘要】为实现谷氨酸棒杆菌工业化生产γ-氨基丁酸(GABA),对L-谷氨酸工业生产菌S9114进行代谢途径改造.通过构建一株工程菌株S9114/pJYW-4-gadB 1-gadB2,将来源于短乳杆菌Lb85菌株的谷氨酸脱羧酶编码基因gadB1和gadB2进行共表达,实现发酵72 h后发酵液中GABA含量达到32.8 g/L,GABA糖酸转化率达到47.3％.通过敲除该菌株的谷丙转氨酶编码基因alaT,使工程菌株S9114△ala T/pJYW-4-gadB1-gadB2发酵液中L-丙氨酸浓度降低5.5％,进一步降低了发酵副产物的含量.研究结果为利用谷氨酸棒杆菌实现工业化生产γ-氨基丁酸提供了有价值的参考.%In order to produce gamma-aminobutyric acid (GABA) by Corynebacterium glutamicum,metabolic engineering of GABA in reconmbinant C.glutamicum S9114 was investigated.By expressing exogenous gad genes (gadB1 and gadB2) from Lactobacillus brevis Lb85 which encoded glutamic acid decarboxylase (GAD),S9114/pJYW-4-gadBl-gadB2 was constructed.After fermented for 72 h,GABA production was 32.8 g/L and the conversion rate of glucose to GABA was 46.3％.By deleting alaT which encoded alanine aminotransferase,S9114△alaT/pJYW-4-gadB1-gadB2 was constructed.Fermentation results showed that the L-alanine production in S9114△alaT/pJYW-4-gadB1-gadB2 was 5.5％ lower than that in S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2,which further reduced the content of the by-products.This study provided a valuable basis for the industrialized production of GABA by C.glutamicum.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2017(047)001【总页数】6页(P31-36)【关键词】GABA;谷氨酸棒杆菌;S9114;alaT【作者】斯晗;史锋【作者单位】江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122;江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,无锡214122【正文语种】中文γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，简称GABA)是一种天然的非蛋白质氨基酸，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内[1]。
它是由谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，简称GAD)催化L-谷氨酸发生α-脱羧反应生成的。
1950年，Roberts[2]等人第一次在哺乳动物的脑萃取液中发现了GABA的存在，但没有对其主要功能进行研究。
随着研究的不断深入，发现GABA是哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇痛等多种功能[3]。
2009年，国家卫生部将其定为新资源食品。
近几年，GABA已经进入工业化生产阶段，并被广泛的应用于食品、医药和化工等行业中[4]。
目前，GABA的生产方法主要分为化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。
其中，微生物发酵法由于其反应温和，能够大量合成GABA，适合工业化生产，并且使用GRAS菌株(Generally Recognized as Safe)生产的GABA可应用于食品和医药行业，因此成为研究的热点。
以乳酸菌等为出发菌生产GABA需要外源添加前体物质L-谷氨酸或L-谷氨酸钠盐。
谷氨酸棒杆菌作为氨基酸的工业生产菌，自身能够大量合成GABA的前体物质L-谷氨酸，通过转入外源gad基因能够实现从葡萄糖到GABA的“一步转化”，有利于工业化生产。
实验室前期在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中共表达来源于短乳杆菌Lb85菌株的两个GAD编码基因(gadB1和gadB2)使菌株自身合成的L-谷氨酸在外源表达的GAD蛋白催化下生成GABA，并且通过调整玉米浆浓度、氮源添加量和添加方式等发酵条件优化手段提高GABA产量，发酵72 h终产量为(18.7±2.1) g/L[5]。
本文选取一株工厂来源的谷氨酸棒杆菌S9114作为出发菌株，该菌为L-谷氨酸高产菌，以此为对象构建基因工程菌株，并对其发酵产GABA的效能进行研究。
同时敲除该菌的谷丙转氨酶编码基因alaT，以减少发酵副产物L-丙氨酸，为利用谷氨酸棒杆菌进行GABA工业化生产提供有价值的参考。
1.1 材料1.1.1 菌株、质粒和引物文中所用菌株和质粒均列于表1中，所用引物均列于表2中。
1.1.2 酶和试剂工具酶：Ex-Taq DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶购买于大连宝生物公司；DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶购买于Fermentas公司。
试剂：脑心浸液、酵母膏和蛋白胨购买于英国OXOID公司；D-山梨醇、卡那霉素和琼脂糖购买于上海捷瑞生物工程有限公司；高效液相用色谱纯乙腈和甲醇购买于上海安普科学仪器有限公司；其它试剂都购买于国药集团上海化学试剂有限公司。
试剂盒：质粒提取试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒都购买于天根生化科技有限公司；PCR产物纯化试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒都购买于上海生物工程有限公司；总RNA提取试剂盒和cDNA反转录试剂盒都购买于BioFlux试剂公司。
1.1.3 主要仪器文中所用仪器列于表3中。
1.1.4 培养基发酵种子培养基[8](g/L)：葡萄糖25，玉米浆30，尿素8，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4 0.2，pH 7.2，重组菌培养时加入终浓度为30 μg/mL的卡那霉素。
摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，玉米浆2，K2HPO4·3H2O 2，MgSO4 0.4，MnSO4·H2O 0.002，FeSO4·7H2O0.002，pH 7.2，接种前加尿素4(单独灭菌)，发酵10 h～24 h间隔补加尿素6次，每次2.4 g/L，重组菌发酵时加入终浓度为30 μg/mL的卡那霉素。
1.2 方法1.2.1 敲除菌株的构建谷氨酸棒杆菌中基因敲除采用谭延振[9]等报道的方法，即同源重组和位点特异性重组敲除系统。
以谷氨酸棒杆菌S9114基因组为模板，分别以alaTU-F/alaTU-R和alaTD-F/alaTD-R为引物，PCR扩增得到alaT基因的上下游同源臂片段alaTU 和alaTD。
然后以质粒pDTW202为模板扩增得到两端带有lox位点的kan基因片段。
最后将alaT基因的上下游片段、kan片段和pBluescript II SK质粒酶切纯化后进行连接，得到alaT基因敲除质粒pBS-ΔalaT。
将构建好的alaT敲除质粒电转入S9114菌株中，经过同源重组使目的基因片段和kan片段发生替换后，再将携带cre基因的pDTW109质粒电转入其中，使Cre酶与kan两端lox位点发生特异性重组从而去除kan片段，最后提高温度去除温敏性pDTW109质粒，得到的新菌株即为alaT基因敲除菌株S9114ΔalaT，构建图如图1。
分别制备S9114和S9114ΔalaT菌株感受态细胞，将pJYW-4-gadB1-gadB2质粒电转入感受态细胞中，挑取转化子验证正确，得到新菌株S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2和S9114ΔalaT/pJYW-4-gadB1-gadB2。
1.2.2 谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵方法参照江君君[5]等，具体操作如下：菌种活化：将冻存管保存的谷氨酸棒杆菌重组菌在具有卡那霉素抗性的LBG平板上划线活化，30 ℃培养约36 h。
种子培养：将活化好的菌种转接到谷氨酸棒杆菌种子培养基中，30 ℃，110r/min(往复式摇床)培养约8 h。
摇瓶发酵：将种子液按终OD=1.9转接到发酵培养基中，30 ℃，110 r/min(往复式摇床)进行发酵，10 h～24 h分次补加尿素，每次补加2.4 g/L。
定点取样，HPLC测定氨基酸含量变化。
1.2.3 发酵参数测定残糖测定：样品12 000 r/min离心2 min，取上清，ddH2O稀释，用生物传感器即时测定葡萄糖含量。
氨基酸含量测定：使用HPLC测定样品中各氨基酸含量，使用方法为邻苯二甲醛(OPA)自动柱前衍生化法[10]。
1.2.4 基因转录水平分析针对摇瓶发酵结果取24 h发酵液菌体对相关基因进行了荧光定量PCR(RT-PCR)分析[11]，具体操作见RNA提取试剂盒说明书、cDNA反转录试剂盒说明书。
反应结束通过Ct值来比较基因转录水平的差异，以16sRNA作为内参以减少误差，具体算法使用Livak[12]等的2-ΔΔCt法。
2.1 S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2菌株产GABA研究首先用菌株S9114进行L-谷氨酸发酵，发酵36 h 发酵液中L-谷氨酸浓度达到(36.7±3.8) g/L，糖酸转化率达到48%。
HPLC分析结果显示，发酵液中除目的产物L-谷氨酸外，只有L-丙氨酸一种氨基酸副产物，发酵36 h L-丙氨酸浓度为3.0 g/L。
随后对菌株S9114/pJYW-4-gadB1-gadB2产GABA的能力进行考察，对10 h～24 h补加尿素5次(总补加量12 g/L)和6次(总补加量14.4 g/L)进行对比，发酵24 h补加葡萄糖30 g/L。
发酵结果如图2所示。
由图2可知，尿素补加12 g/L组72 h OD为33.2，尿素补加14.4 g/L组72 h OD为31.2，说明尿素补加量没有对菌株生长产生明显影响。
尿素补加12 g/L组的总糖耗比尿素补加14.4 g/L组低16.6 g/L。
发酵结束时尿素补加12 g/L组L-谷氨酸含量为7.1 g/L，GABA含量为26.3 g/L，GABA摩尔转化率为84.0%；尿素补加14.4 g/L组L-谷氨酸含量为6.9 g/L，GABA含量为32.8 g/L，GABA摩尔转化率为87.1%。