实验五 菌种组织分离法
简述平菇组织分离技术
简述平菇组织分离技术平菇组织分离技术是一种用于培养平菇菌丝体的方法。
通过这种技术，可以将平菇菌丝体分离出来，进一步用于培养和繁殖平菇。
本文将简要介绍平菇组织分离技术的原理、步骤和应用。
一、原理平菇组织分离技术基于平菇的生物学特性。
平菇是一种真菌，其生命周期包括菌丝体和子实体两个阶段。
菌丝体是平菇生命的基础，通过分离菌丝体可以实现平菇的繁殖和培育。
二、步骤1. 选择适宜的平菇子实体：选取外观完整、无病虫害的平菇子实体作为材料。
将子实体放入无菌环境中，加入蒸馏水进行清洗。
2. 去除子实体表面的杂质：使用消毒棉球蘸取75%的酒精，擦拭子实体表面，去除污垢和杂质。
3. 切取菌盖或菌柄组织：在无菌条件下，使用无菌刀具切取平菇子实体的菌盖或菌柄组织。
注意切取的组织应尽量新鲜，避免经过长时间的暴露。
4. 菌丝体分离：将切取的菌盖或菌柄组织放入无菌培养基中，培养基可以是琼脂糖或马铃薯葡萄糖琼脂。
培养基应含有适宜的营养物质，如葡萄糖、氨基酸和无机盐等。
将培养基培养在适宜的温度和湿度下，通常为25-30℃，相对湿度70-80%。
5. 菌丝体培养和繁殖：在培养基上，菌丝体会逐渐生长并扩展。
可以通过观察菌丝体的生长情况来判断培养条件是否适宜。
菌丝体可以通过分生孢子或菌丝体生长末端的分枝来繁殖和扩展。
三、应用平菇组织分离技术在平菇的培养和繁殖中有着广泛的应用。
主要应用包括以下几个方面：1. 种质资源保存：通过分离和培养平菇菌丝体，可以保存和繁殖平菇的种质资源，保证其遗传多样性和纯度。
2. 菌株选育：通过分离和培养不同菌株的菌丝体，可以筛选出具有良好特性的菌株，如高产、抗病性强等。
3. 种子生产：通过分离和培养平菇菌丝体，可以大规模生产平菇的种子，用于平菇的商业化种植。
4. 研究平菇生物学特性：平菇组织分离技术可以为研究平菇的生长发育、代谢途径、基因调控等方面提供材料和方法。
总结：平菇组织分离技术是一种用于培养平菇菌丝体的方法。
细菌的分离培养
细菌的分离培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
实验室微生物菌种分离方法!
实验室微生物菌种分离方法！纯种分别从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分别与纯化。
在分子生物学的讨论及应用中，不仅需要通过分别纯化技术从混杂的自然微生物群中分别出特定的微生物，而且还必需随时留意保持微生物纯培育物的"纯净'，防止其他微生物的混入。
纯种分别的目的是将目的菌从混杂的微生物中分别出来，获得纯培育。
假如样品没有经增殖培育而直接进行分别，那么要得到具有某一特性的纯种，就更该细致、谨慎的操作。
纯种分别的常用方法有4种：倾注平板分别法、涂布平板分别法、平板划线分别法和组织分别法。
1、倾注平板分别法：培育后，在培育基内部及表面形成单菌落。
倾注平板法:将无自生理盐水稀释后的样品加入无茵培育基混合匀称。
待凝固后倒置培育，内部及表面形成单自落。
2、涂布平板分别法：培育后，在培育基表面形成单菌落。
由于将微生物悬液先加到较烫的培育基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采纳稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学讨论中常用的纯种分别方法是涂布平板法。
用途：一般多用于菌种的纯化；优点：可以观看菌落特征，对混合菌进行分别；缺点：不能计数；掌握每个平板中微生物的菌落数在肯定的范围可获得抱负的分别效果，对于细菌和酵母，以每平板10~200菌落为佳，对于丝状菌，则应掌握每平板菌落数30~50或更少。
假如分别菌丝呈扩散性生长的丝状菌如根霉、毛霉等，则可以在培育基中添加0.1%左右的去氧胆酸钠（去氧胆酸钠在低PH下灭菌过程中易形成絮状沉淀，可以通过分别灭菌、倾注平板前混合的方法避开）或山梨糖（在察氏培育基中加山梨糖0.1%，蔗糖0.01%），这样可防止菌丝扩散，便于挑取。
3、平板划线分别法：能达到纯种分别的目的。
经培育后会得到呈分散状态的单菌落纯培育。
最简洁的分别微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培育基表面多次作"由点到线'稀释而达到分别目的的。
实验菌种的分离
一、菌种的来源 • 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂
或菌种保藏部门索取或购买； • 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
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二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
• 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工 艺等。
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（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作
过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主， 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵 母和霉菌较多，如一些野果生长区和果 园内。采样的对象也可以是植物，腐败 物品，某些水域等。
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Байду номын сангаас
从自然界筛选
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• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去
表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
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2．植物体采集方法
• 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、 安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一 小块，并注意不要损伤周围边缘。
• 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在 一片叶上的取样部位。
• 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法 相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时， 一般与根际土样一起保存。
植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验
植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验1、病原菌的分离培养及保存1.1材料：（1）病害组织（2）分离培养基（PDA培养基）：20%土豆煮汁，2%琼脂条，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌（3）次氯酸钠（4）试管斜面培养基：成分为PDA培养基，121℃高温灭菌1.2方法：剪取作物病害部位，将病害部位用次氯酸钠表面消毒后，置于分离培养基上，然后放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，通过菌落形态和孢子镜检挑选出所要分离的病原菌转接试管斜面，然后将斜面放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，包好放于4℃冰箱内低温保存。
2、病原菌摇瓶菌丝体的培养及菌液的制备2.1材料：（1）试管斜面孢子（2）摇瓶培养基：20%土豆煮汁，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌。
2.2方法：将试管斜面孢子转接到摇瓶培养基，然后将摇瓶放到220转/分的摇床上培养，2—3天后，摇瓶菌丝体长到一定的成熟状态（不同真菌菌丝体不同）后，取下摇瓶，放于4℃冰箱内低温保存，待需要做抑菌圈实验时，将摇瓶从冰箱内取出，用组织捣碎机将摇瓶菌丝体高速捣碎2分钟左右，至菌液状态。
3、供试药剂的抑菌圈实验3.1材料：（1）打碎的病原菌菌液（2）底层培养基：2%琼脂粉、蒸馏水，121℃高温灭菌。
（3）上层培养基：成分同PDA培养基，121℃高温灭菌。
（4）链霉素溶液：2400U/mL3.2方法：（1）融化底层培养基，待温度降至70℃，倒入测定木盘，放平至凝固。
（2）融化上层培养基，待温度降至54℃，用无菌移液管加入1mL链霉素溶液以防杂菌干扰；继续降温至48℃，用无菌移液管加入6—12mL的病原菌菌液后迅速晃匀后，倒入测定木盘，放平，待凝固后，即做成抑菌圈实验所用的测定盘。
（3）稀释供试药剂到制定浓度。
（4）在测定盘内摆放牛津杯。
（5）用P型移液器将稀释好的药剂滴入牛津杯内，滴液量为0.26mL/杯，然后盖上玻璃板，放置于28℃恒温培养箱内培养，培养时间为16—18小时。
实验五植物原生质体的分离和培养
实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。
实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。
植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。
分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。
其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。
原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。
酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。
游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。
实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。
2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。
⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。
三、试剂1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏⽔。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。
常见病原菌分离方法
常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。
，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。
材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。
如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。
6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。
分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。
二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。
振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。
直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。
三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。
菌种的分离与纯化
接种、分离纯化和培养技术一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。
在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图３－３）图３－３接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。
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实验五菌种组织分离法
目前食用菌主要栽培种类如平菇、香菇、草菇等生产上多采用组织分法制备菌种。
一、目的：
了解和掌握食用菌组织分离法的方法步骤，制备出栽培用菌种。
二、实验器材：
1、平菇或香菇等子实体。
2、接种箱、解剖剪、解剖刀、镊子、试管斜面、75%酒精、酒精棉球、无菌水、培养皿、紫外线灯、或硫磺。
三、实验方法：
1、菌种的选择：在出菇场要选择肉厚肥大、鲜嫩，出菇早、菇形整齐、菌柄短且无病害的做种。
2、将种菇表面用清水冲洗干净，放在接种箱（或无菌室内）进行表面消毒。
用镊子将种菇放在培养皿内，用另一反镊子夹75%酒精棉球（或0.1%升汞棉球）对种菇进行表面消毒，然后移入另一培养皿内再用无菌水反复洗涤三次，洗净残留的消毒剂。
3、用解剖刀或鲜剖剪蘸酒精进行火焰消毒，冷却后把自己消毒的种菇纵切开，然后用菌盖笔菌柄交界处，切取长宽的0.3-0.5厘米的菌肉组织块，用接种针移到斜面培养基上，置24℃恒温箱中培养。
4、每天检查试管斜面菌落生长情况，如从分离的菌肉组织块上长出正常的白色菌丝，即分离成功，及时将生长出来的菌丝转移新的试管斜面。
若在组织块附近或其他地方出现其他颜色杂菌生长应予以淘汰。
四、作业：
叙述组织分离的方法步骤，体会和注意事项，观察记载斜面菌落生长速度和成功率。