生化实验课 琥珀酸脱氢酶

二、实验原理
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀 酸竞争，而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶 已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种 现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度， 则可减轻丙二酸的抑制作用。
三．器材与试剂


1. 器材 大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、 量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、 恒温水箱、电热水浴锅 2. 试剂 0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶 液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L丙二 酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）、 0.02％甲烯蓝、液体石蜡
五．实验结果记录
试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6 [I]/[S] 0 0.1 1 10 0 0 褪色时间（分钟）
六．注意事项




1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降 低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气 中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要 倾斜，注意不要产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空 气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重 新氧化成蓝色。 4、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管 的褪色情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体 石蜡。
七．临床意义


竞争性抑制是可逆抑制过程,不破坏酶结构,不 改变酶浓度。 磺胺药与二氢叶酸结构类似，可竞争性抑制二 氢叶酸合成酶活性，进而减少菌体内四氢叶酸 的合成，达到抑制细菌生长的作用。
八．思考题


1.随着竞争物浓度与底物浓度的比值 （[I]/[S]）增加，褪色时间如何变化，为什 么？ 2. 试阐述竞争性抑制作用的特点，并举例 说明其临床意义。
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争 性抑制作用
一、实验目的要求

学习和掌握竞争性抑制作用的特点。 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。
二、实验原理


化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底 物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧 失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 琥珀酸脱氢酶是位于动物细胞线粒体内膜上的一种 氧化酶，它直接与电子传递链相连，是机体内参与 三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，也是呼吸链的标 志酶。在体内，琥珀酸脱氢酶可以使琥珀酸脱氢生 成延胡索酸。脱下的氢进入FADH2呼吸链，通过一 系列传递体，最后传递给氧而生成水。当在缺氧的 情况下，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的 甲烯白。这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
四.操作步骤

2.取试管6支，编号，再按下表步骤操作：
0.2mol/L 0.02mol/ 0.2mol/L 0.02mol/L 蒸馏水 甲烯蓝 琥珀酸溶 L琥珀酸 丙二酸溶 丙二酸溶液 （滴） （滴） 液（滴） 溶液（滴） 液（滴） （滴） 8 8 4 8 8 3
酶提 磷酸缓 取液 冲液 (ml) (ml) 试管1 2 试管2 2 -
试管3
试管4 试管5 试管62来自2 22 -8
8 8
8 -
8
8 -
-
8 8
3
3 3 3
注意：试管6中的酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min，再 加入其它溶液。各管中将溶液加入后立即混均匀。然后沿试管壁加 入液体石蜡，约0.5cm(1ml)厚。各管置于37℃的水浴中保温，切勿 摇动试管，随时观察比较各试管颜色的变化，记录褪色时间。
四.操作步骤

1. 酶提取液的制备： 取大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，称重?，用 冷水洗3次，剪小块。加入10X(重 量)1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4），在匀 浆器中进行匀浆（最大速度1-2分钟），然 后用4层纱布过滤，滤纸过滤 (4000RPM10MIN)，用干净的烧杯收集过滤 液，备用。