固体组织蛋白提取.
固体组织蛋白提取
2017-07-18
固体组织蛋白提取
1. 每100mg固体组织剪碎后加入0.5 ml裂解液，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。注意：初始组织的量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。
2. 取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，加2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。室温或4℃静置10分钟，偶尔晃动。注意：(1)组织量<10mg且静置时间短30min，在下一步离心时所形成的蛋白膜易碎，此时可静置30min。(2)提取脂肪组织时应4℃静置40min以上以充分去除油脂。
3. 10,000g 4℃离心10分钟，溶液分为两相，中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。(2)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入0.5-0.8ml纯乙醇混匀，10,000g 4℃离心5分钟。弃所有液体，蛋白沉淀在管底。
4. 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。
5. 每100mg组织所得到的蛋白加 200ml用户自备的缓冲液，
95℃煮10分钟。室温放置20分钟溶解沉淀。注意：(1)可4℃过夜溶解沉淀，偶有少量不溶性组织纤维碎片可离心去除。(2)有时染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来，溶解时则形成粘稠物。延长95℃热变性时间、不时振荡、用注射针头反复抽吸，有助于彻底打断DNA。
3．样本组织RNA提取：取液氮保存的肺组织，研碎后加入RNAisoTMPlus，将研碎的样品完全覆盖，室温静置至样品完全融化，在研磨至裂解液呈透明状。移至离心管后加入l／5l埘AisoTMPlus体积量的氯仿，用力振荡后移至离心管中，室温静置 5min。12，000rpm／min 4 0C离心15min，取出离心管吸取上清夜，移入新的.离心管。向上清中加等体积的异丙醇，混匀后室温静置
10min。12，000rpm／min 4"C离心10min。弃取上清，加入75％的乙醇lml，洗涤管壁后12，000 rpm／min4。C离心5min，弃去乙醇。室温干燥沉淀5min 后加入适量RNase．free水溶解沉淀，完全溶解后置于--80℃ 保存。
4．按照试剂盒说明在微管中配制反应混合溶液，将提取的RNA),II入微管后70℃ 反应5min，离心收集。依试剂盒说明依次加入5×reaction buffer，Ribolock Ribonuclease inhibitor和10 mM Dntp mix，混匀后离心收集。置
于25℃5min。加入逆转录酶，然后置于25℃10min，再置于42℃60min，加热到70℃10m in停止反应。
组织剪碎，称重，加裂解液（含蛋白酶抑制剂）后匀浆，超声破碎也可以，注意要在冰上进行。然后12000转，10分钟，4度，离心取上清，测蛋白浓度，加loading buffer煮沸5-10分钟，做western
天根有一款样本保存液，能迅速渗入组织细胞，高效抑制RNase活性
17动物组织蛋白提取
1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。 2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。 3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。 1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。 2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。 3、10,000×g 离心15分钟。 4、收集上清，进行下一步的实验。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 ①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer 中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。④4℃摇床，温和振摇15分钟。⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。 细胞提取步骤 1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。 2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。 3. 4℃摇床，温和振摇30min。 4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物 5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
膜蛋白提取
1分离组织膜蛋白的方法： 1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。 3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。 4、收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 2 取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。样品蛋白含量测定采用酚试剂法。 3 我们实验室提取膜蛋白的方法如下： 1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。3．按 2.5毫升（T75）/每瓶或5毫升（T175/ 每瓶加入冰冷的匀浆液（HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。 4．将匀浆液转入离心管中，加入适量的Tris –HCl (50mM, PH7.4) 4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心，共离心三次。 5．在最后一次离心得到沉淀中按250微升每瓶（T75）或500微升每瓶（T175）加入tris-HCl buffer，匀浆，取50微升匀浆液测量蛋白浓度。 6．按实验要求，将匀浆分装于1毫升的Eppendoff 管中，其于-80oC 冰箱中待用。 主要基于膜蛋白分子量较大，在40000g时易沉降来分离。 做膜蛋白的免疫荧光，可以用荧光抗体染色，然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，具体的protocol可以找到，就不多说了。需要注意的是，要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域，如果是胞外，可以直接染色；如果在胞内，则需要用无水甲醇在-20度处理10min，使细胞膜通透，然后再用抗体孵育，这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合。
实验九-动物组织中核酸的提取和鉴定
实验七动物组织中核酸的提取和鉴定 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。 此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。 H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O H3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O5 2、嘌呤碱：能与苦 味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸 (盐酸与硫酸)共热生成 糠醛，后者可与3;5二羟 甲基苯缩合成绿色化合 物。 (2)脱氧核糖：在强 酸中加热，可生成ω—羟 基γ—酮基戊醛，后者再 与二苯胺作用生成一蓝 色化合物。 上述二反应如下 【操作】
(一)核酸提取 l、用酚提取法： （1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。 （2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。 （3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。 （4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。 2、用三氯醋酸提取法 （1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。 （2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 （3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心， （4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。 (二)核酸的水解： 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。 (三)鉴定： l、嘌呤碱的鉴定： 取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。 2、脱氧核糖的鉴定：
组织蛋白提取
1. 提取蛋白裂解液配方： 25 mM HEPEs PH:7.4 5 mM EDTA 5 mM EGTA 50 mM NaCl 1 mM Na3VO3(矾酸钠) 1 mM sodium phosphophate 0.05% SDS 0.05% sodium deoxycholate (脱氧胆酸盐) 1% Triton-X 100 5 mM NaF 0.1% 2-mercaptoethanol 1 mM PMSF (1ul 100mmol/L+纯水99ul) 1uM Microcysin-LR 40ug/ml pepstatin A 40ug/ml aprotinin 40ug/ml leupeptin 2..组织蛋白提取及定量： 称量组织重量置小烧杯 用PBS清洗1-2次 加入组织裂解液【悬浮buffer储存液500ml+苯甲基磺酰氟（PMSF，有毒物）30+leapeptin （蛋白抑制酶）0.5ul于EP管混合，倒入盛组织的烧杯】 置冰上5min 用眼科剪剪碎 倒入5ml匀浆器（反复抽吸匀浆组织） 倒入或吸入EP管 离心（4°C 1000g 10min）取上清 用于蛋白定量或储存于-80°C 蛋白定量 取5ul蛋白样本+15ul去离子水（DW）+200ulBCA（A:B为50:1即196:4），分别混合样本与DW和BCA的A液与B液置于干净的96孔板上37°C，30min
酶联免疫测OD值（570nm，ELX-800型酶标仪） 由OD值计算蛋白浓度（用excel表或用下列公式计算） （OD值×987.7108－198.342）×103ng/ul；OD=样本OD值－空白对照OD值）
各种动物蛋白原料的加工方法
各种动物蛋白原料的加工方法 1、鱼粉的加工海杂鱼、淡水鱼及海产品加工下脚料等，均可作为鱼粉加工的原料，先将原料通过晒干、烘干或水煮后晒干等程序，然后加工成粉状即成，水煮法经高温处理，质量一般较好。 2、肉骨粉的加工主要原料是肉食品加工下脚料，以及不合乎卫生要求的动物屠体组织，将原料加水蒸煮，一般脏器煮1小时，头、蹄组织煮2-3小时。煮后去掉汤表面的油脂，经烘干粉碎即成。加工较好肉骨粉呈淡红色，水分不超过6%，粗蛋白质含量达40%以上。 3、血粉的加工主要以屠宰动物血液为原料，将血液放入锅内加热，直到血液凝固和水分蒸发后，晾在水泥地板上直至干燥，然后加工成粉状即成，值得注意的是：血液加热时要不断搅拌，加入0.5%-1.5%的生石灰，煮后将血块装入麻袋内挤压沥水，使水分沥掉50%以上，再晾晒，并每隔1-2小时翻动1次，直至晒干为止。加工血粉蛋白质含量可达70%-80%，水分不超过10%，土法加工的血粉应立即饲喂。 4、羽毛粉的加工原料为禽类羽毛。将羽毛用水冲洗干净、晒干，然后在耐酸的锅中按1:6的比例先放入羽毛，再放入0.2%的稀盐酸液，加盖煮沸到用手轻轻拉断时捞出，沥去酸液，然后在阳光下晒干，用粉碎机加工成粉即可。加工好的羽毛粉蛋白质含量在70%左右。 5、骨粉的加工以动物骨头为原料，将动物骨头放入普通锅中连续煮沸7-8小时，待骨头上的脂肪煮出后，在阳光下晒干，然后加工成粉状即成，也可将骨头堆在金属架上进行焙烧，粉碎后即成骨粉，骨粉是补充钙磷元素的好饲料。 6、蛋壳粉的加工以新鲜洁净蛋壳为原料，将蛋壳洗净放入锅内煮沸，
捞出后再放入60℃的铁锅内焙炒，炒脆后取出粉碎即成蛋壳粉，蛋壳粉是补充钙的好饲料。 7、蚕蛹的加工蚕蛹是缫丝工艺的副产品。将蚕蛹放入锅内，反复煮沸数次，去掉油脂，捞出后晒干、粉碎成末即成蚕蛹粉，蚕蛹粉含粗蛋白质为45%左右，适宜饲喂猪及家禽。
植物组织蛋白提取方法
植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm 以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g，5 min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根 1、200毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重复离心5min
动物组织胚胎学专升本作业题参考答案
东北农业大学网络教育学院 动物组织胚胎学作业题 作业题（一） 一、名词解释 1.组织学：是研究动物体微细结构及其与功能关系的科学。研究容包括细胞、组织和器官组织三个部分。 2.胚胎学：是研究动物个体胚胎发育的科学。 3.皮：衬在心、血管和淋巴管面的上皮叫皮。皮薄而光滑，有利于血液和淋巴的流动以及皮细胞外的物质交换。 4.肌节：肌原纤维之相邻两Z线之间的部分，称为一个肌节，是肌肉收缩的基本结构和机能单位。 5.胎盘：是胎儿与母体进行物质交换的结构，它由胎盘的胎儿部分和母体部分所组成。 6.神经元：神经细胞是一种高度分化的细胞，具有很长的突起，能够感受刺激和传导神经冲动，是神经组织结构和机能的基本单位，因此又叫神经元。 7.骨单位：是位于、外环骨板之间的一些平行于骨干长轴排列的圆柱体。它们由许多呈同心圆排列的筒状骨板和中央的哈氏管所组成。 8. 胰岛：是胰腺中的分泌细胞团，散在分布于胰腺外分泌部的腺泡之间。胰岛主要有A、B、D、PP四种细胞，它们都具有蛋白质分泌细胞的超微结构特点；分别分泌高血糖素、胰岛素、生长抑素、分泌胰多肽。 9.尘细胞：肺巨噬细胞：数量较多，广泛分布于肺间质，也可进入肺泡腔。来源于单核细胞，有活跃的吞噬、免疫和分泌功能，起重要的防御作用。当吞噬进入肺的尘粒后，称为尘细胞。 10.肾单位：肾单位是尿生成和排泄的基本单位，由肾小体和肾小管两部分构成。 二、判断下列句子正确与否并用“√”或“×”标明 1～5√××××；6～10××××√ 三、单项选择 1～5DCDDB ；6～10DCBCA 四、填空题 1.细胞膜、细胞质、细胞核。2髓鞘、神经膜（施万）细胞。3骨骼肌、心肌、平滑肌。 4表皮、真皮和皮下组织。5过滤淋巴、参与免疫应答、产生淋巴细胞。6 鼻、咽、喉、气管、支气管、肺。 五、简答题 1. 外分泌腺的腺细胞有几种分泌方式，举例子说明。 1)透出分泌：分泌物以分子的方式透出细胞膜，例如胃壁细胞盐酸的分泌。 2）局部分泌也叫胞吐分泌。所形成的带包膜的分泌颗粒逐渐移到细胞的游离面并与质膜融合，将容物胞吐出去，细胞膜本身不受损伤。唾液腺和胰腺外分泌部都是此种分泌方式。 3）顶浆分泌胞质中形成的分泌物移到游离面质膜下后，顶着质膜向外突出，最后自突出部位与细胞折离，损伤的质膜很快修复。乳腺和汗腺细胞都为顶浆分泌。 4）全浆分泌当胞质充满分泌物后，细胞发生死亡性变化，最后整个细胞解体，连同分泌物一起排除，由邻近的腺细胞补充。皮脂腺细胞属于全浆分泌型。 2. 哺乳动物血液的组成。
动物组织各种固定液及优缺点
动物组织各种固定液及优缺点 编 号 类别名字配方优缺点或备注 甲醛：从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:1. 组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.2. 固定均匀,穿透力强.3. 能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.4. 能保存脂肪及脂类物质.5. 成本较低. 缺点:1. 杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.2. 含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.3. 可产生福尔马林色素,影响观察.4. 不能固定尿酸和糖类物质.5. 容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.6. 可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,临床活检不用.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败。 1 10%缓冲福尔马林固 定液甲醛100ml 蒸馏水900ml NaH2PO44g Na2HPO4 6.5g 该固定液是当今流行的固定液,因它对组织固 定较好,损伤较少,因对其后的各方面研究都较 好,尤其是对免疫组化的染色. 2 10%福尔马林固定液甲醛100 ml 自来水900ml 这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用这种固定液。 3 10%福尔马林盐固定 液甲醛100ml 自来水900ml Nacl 9克 先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种 较为简单的固定液，但由于加入Nacl，它是 一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染 色，增加染色的强度 4 Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 2 ml 冰醋酸 5 ml 该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平 5 醛糖钙固定液甲醛100ml 蔗糖300ml 乙酸钙20g 蒸镏水90ml 先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。 酒精：优点：1、可保存尿酸结晶和糖原等物质。2、能在任何比例的情况下与水混合，如组织的脱水，切片染色前后都离不开酒精，通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。 3、可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色，能除去石蜡的物质有苯及汽油等，因此称它为桥梁试剂。 4、能除去切片上的水份，使切片无水化。切片经染色后，到无水酒精中已完全无水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会褪色。5，可与其它试剂配成多种的混合固定液，加快固定，它的缺点是：1、可溶解脂类物质，凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时，切不能用含有酒精的固定液去固定组织，也不能用石蜡切片。2、对组织收缩较大，不宜作单纯固定液。3、渗透力不强。当用酒精固定组织时，组织表面很快就被固定，并形成了一层蛋白膜，这层膜可阻挡固定液向里渗透，造成了中间组织固定不佳的现象。4、可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡经酒精固定的组织，核的染色都不好。 5、可脱去切片上已着染的各种颜色，切片经染色后，一是必须洗去多余的染液，二是必须脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必须仔细地掌握显微镜下观察，还要掌握酒精的浓度，低浓底的酒精脱色力强，稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时，要较快地通过低浓度的酒精，以免使已着染的颜色被脱去。
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
蛋白提取方法
?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品
脂肪组织蛋白的提取方法.doc
①用液氮研磨的方法更佳，具体方法可以联系本公司****@***.c*m索取详细资料。 beibokit https://www.360docs.net/doc/521485625.html, - 2 - 产品说明书 相关产品： 产品 总蛋白提取试剂盒核蛋白提取试剂盒 膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒Bradford蛋白定量试剂盒ECL化学发光检测试剂盒细胞蛋白提取试剂盒组织蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒昆虫蛋白提取试剂盒磷酸化蛋白提取试剂盒SDS-PAGE凝胶配制试剂盒总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）植物蛋白提取盒（2D电泳用）细菌膜蛋白提取盒（2D电泳用） 产品号BB-3101 BB-3102 BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3126 BB-3105 BB-3702 BB-3181 BB-3183 BB-3187 产品 磷酸化蛋白富集试剂盒膜蛋白提取试剂盒活性蛋白提取试剂盒BCA蛋白定量试剂盒植物核蛋白提取试剂盒细菌膜蛋白提取试剂盒植物总蛋白提取试剂盒植物膜蛋白提取试剂盒
蛋白酶抑制剂混合物真菌蛋白提取试剂盒磷酸酶抑制剂混合物SDS-PAGE上样Buffer 细菌蛋白提取盒（2D电泳用）酵母蛋白提取盒（2D电泳用）线粒体蛋白提取盒（2D电泳用） 产品号BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3127 BB-3311 BB-3703 BB-3182 BB-3185 BB-3191 beibokit https://www.360docs.net/doc/521485625.html, - 3 -
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如
动物固体组织蛋白提取-Protocol(可编辑修改word版)
WT LOST 动物固体组织蛋白提取 Protocol 1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。 2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。置入 4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行）： a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。 b 、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块， 一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎， 也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～5 次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部分酶活力会受影响。 c 、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心 15min 。 d 、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的 EP 管中。可-80℃保存。4、蛋白浓度测定。 a 、配工作液：溶液 A ：溶液 B=50：1（200ul ：4ul ）。 需测试复孔。标本 X ，则需 A 量=2* ；B=2*（X+1+1）*4。 c 、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH 2O ，混匀。即 10 倍稀释。 d 、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后，37℃ incubat e 30min 。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换 tip ，再加入工作液即起反应，应缩短时间。 e 、酶标仪检测 562nm 吸光度。Program f 、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y ：蛋白浓度；X ：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y （ug/ul 、mg/ml ） g 、蛋白样本放-80℃冻存。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化， 这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。 Commassie 法（Bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。 BCA 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）
不同组织的蛋白提取方法99
不同组织的蛋白提取方法 2017-07-18 不同组织的蛋白提取方法 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 或者用三氯醋酸―丙酮沉淀法，离子浓度小的1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3-204℃8000rpm以上1 3、的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000r pm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的'DTT65ul/ml。 二、组织：肠黏膜
应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心：7500g，5min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于BLOT存在的问题：加入1％SDS4度离心后又多了白色沉定，SDS左右。 2XBUFFER，然后煮5－10三、材料：细菌蛋白 2%的SDS，20mmol的2-巯基乙醇 四、肿瘤组织 0-4°C生理盐水冲洗组织表面血迹，以1：9（即100ug重量加入900ul体积）的比例加入蛋白匀浆提取液，0-4°C冰水混合物中用1ml匀浆器制成10%的蛋白匀浆。匀浆在10000G离心10-15分钟，取上清备用。 注：蛋白匀浆提取液(PH7.6)：Nacl50mMTris10mMEDTA1mM，PMSF1mM， Na3VO4.12H2O0.5mMNaF50mMBenzamidine1mM 五、脑组织
肝组织蛋白提取
1肝组织蛋白的提取 准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上） 1）取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状 2）加入组织裂解液约500μL（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20~30min 3）吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4℃离心，12000rpm×15min 4）取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2μl的上清用于蛋白浓度的测定 5）剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min 6）瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。 2. RNA抽提 1、取等量肝组织，液氮中磨碎； 2、加入TRIZOL Reagent lml，室温孵育5min； 3、 )b[I)k2001al氯仿剧烈振荡l 5sec，室温孵育2min； 4、 4℃，12，000rpm，离心15min； 5、吸取上层含有RNA的水相入新管，Dla入500rtl异丙醇沉淀RNA，室温孵育l 0min； 6、 4℃，12，000rpm，离心l 5min； 7、弃上清，加入lml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4"C，75009，离一L,5min；
8、干燥RNA，用20tal DEPC水溶解RNA； 9、用紫外分光光度计测定RNA的含量，．20℃保存，准备做RT．PCR。 2蛋白浓度测定 1）蛋白标准液（用BSA配制）25mg/ml储存液，稀释为0.5mg/ml，稀释步骤：例：10μL 25mg/ml的蛋白标准液＋90μL PBS混合成2.5mg/ml蛋白标准液20μL 2.5mg/ml的蛋白标准液＋80μL PBS混合成0.5mg/ml蛋白标准液2）需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用BCA试剂盒测出蛋白浓度，标准孔设置及所加试剂量如下： 试剂添加量（μL） 蛋白标准液 3）配制BCA蛋白测定液，溶液A：溶液B=50：1先混合均匀，至完全互溶备用4）待测蛋白孔加：2μL蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为20μL 5）每孔加180μL配好的BCA蛋白测定液，使每孔总体积均为200μL； 6）室温避光放置两个小时或37℃放置30min； 7）用酶标仪测出每孔的吸光度，（570nm），测三次； 8）用excel工具根据标准孔的数据作散点图，并做出直线及公式。以标准孔的浓度为X轴（分别为0，0.0025，0.005，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05），以所测标准孔的吸光度为Y轴，绘制线性关系图，并取相关度（R2值）最高的公式代入计算出需测的蛋白浓度，进而计算出做Western的每孔加样量=（所需上样的蛋白量）/（蛋白浓度×100）μL。 （注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考。可复制、编制，期待 你的好评与关注）
动物病理名词
贫血：循环血液总量减少或单位容积外周血液中血红蛋白量、红细胞数低于同龄、同性别健康动物的正常值，称为贫血。 栓塞：循环血液中出现不溶于血液的异常物质，随血流运行并阻塞血管腔的过程，称为栓塞。 梗死：由于动脉血流断绝，局部组织器官因缺血发生坏死而形成的区域，称为梗死。 水肿：过多的水在组织间隙或体腔中积聚，称为水肿。浮肿:皮下水肿称为浮肿。 积水：大量液体积聚在浆膜腔时，称积水或积液。 脱水：机体在某些情况下，由于水和电解质的摄入不足或丧失过多，而引起体液总量减少，并出现一系列功能、代谢紊乱的病理现象，称为脱水。 等渗性脱水：机体失水、失钠比例大致相等，又称混合性脱水。 高渗性脱水：以水分丧失为主，盐的丧失较少的一种脱水，又称缺水性脱水、单纯性脱水。 代射性酸中毒：由于代谢障碍引起体内固定酸生成过多或碱性物质（碳酸氢根）大量丧失，导致酸碱平衡紊乱的现象，称代谢性酸中毒。 萎缩：发育正常的器官、组织细胞，由于物质代谢障碍而发生体积缩小和功能减退的过程，称萎缩。 淤血：由于静脉回流受阻，血液淤积在小静脉和毛细血管里，引起局部组织中的静脉血含量增多的现象，称为静脉性充血，简称淤血。 槟榔肝: 由于淤血的肝组织伴发脂肪变性，故在肝切面形成暗红色淤血与土黄色脂变肝细胞区相间，眼观似槟榔状花纹，故称为“槟榔肝”。血栓：在活体的血管或心脏内，血液凝固或血液中的某些成分析出，黏集形成固体物质的过程，称为血栓形成，所形成的固体物质称为血栓。 坏疽：组织坏死后，受外界环境影响和腐败菌继发感染而引起的变化。肉芽组织：即幼嫩的结缔组织。富含新生毛细血管和成纤维细胞并有炎症细胞浸润。 肿瘤：在致瘤因素的作用下, 机体局部组织的细胞在基因水平上失去了对其生长的正常控制，导致克隆性异常增生形成的新生物。这种新生物常形成局部肿块，故称肿瘤。 疾病：是动物机体在一定病因作用下，引起的损伤与抗损伤反应，由于稳态调节紊乱，从而引起一系列功能、代谢和形态结构改变，临床出现许多不同的症状和体征：使机体与外环境的协调关系发生障碍，这种异常的生命活动过程，称为疾病。 瘀点：漏出性出血时，在皮肤、粘膜、浆膜和实质器官呈点状出血，称为血点或瘀点。瘀斑：严重时，呈斑块状出血，称为血斑或瘀斑。坏死：活体内局部组织或细胞的病理性死亡，称为坏死。 萎缩：由于物质代谢障碍，发育正常的组织，器官或细胞，发生体积缩小，功能减退的过程称为萎缩。 绒毛心：纤维素性心包炎时，心脏表面覆盖有易于剥落的黄白色薄层纤维素。病程稍长的病例，这种纤维素因心跳动而摩擦牵引、形成绒毛状，称为绒毛心。 修复: 机体对死亡细胞、组织的修补性生长过程及对病理产物的改造过程。肉芽组织：是由毛细管内皮细胞和成纤维细胞分裂增殖形成的幼稚的结缔组织。 炎症：机体在致炎因素作用下产生的防御意义的应答反应。炎症介质：在致炎因素的作用下，由细胞或血浆产生的参与引起炎症反应的化学活性物质。脱水：机体内水分因摄入不足或丧失过多，所造成水的负平衡，称为脱水。 水肿：是指过多的液体在组织间隙或体腔中积聚。 动脉性充血：指由于小动脉扩张而流入局部组织或器官中的血量增多。又称“主动性充血”，简称“充血”。 静脉性淤血：指由于静脉血液回流受阻而引起局部器官或组织中的血量增多，简称“淤血”。 渗出性出血：由于血管壁通透性增高，红细胞通过扩大的内皮细胞间隙和损伤的血管基底膜而漏出到血管外。 休克：微循环血液灌流不足导致重要器官机能代谢紊乱和结构损伤的一种全身性病理过程。 积水：指浆膜腔内有大量液体积聚。 病理性萎缩：依据病变范围可分为全身性萎缩和局部性萎缩 颗粒变性：指实质脏器的功能细胞胞浆内出现大量的细小的蛋白颗粒，同时细胞肿胀，功能低落。常见于心、肝、肾等实质脏器。 水泡变性：指实质脏器的功能细胞胞浆内出现大小不一的水跑，同时细胞肿胀，功能低落。常见于心、肝、肾等实质脏器。 脂肪变性：实质脏器的功能细胞胞浆内出现大小不一的游离脂肪小滴，同时细胞肿胀，功能低落。 凝固性坏死：在蛋白凝固酶的作用下，坏死组织发生凝固。坏死组织灰白或黄白色，质地干燥，界限清楚。有贫血性梗死、干酪样坏死、蜡样坏死、脂肪坏死。 坏疽：指组织发生坏死后，受外界环境影响和腐败菌感染而形成的特殊的病理学变化。 干性坏疽：常见于皮肤，坏死的皮肤干燥、变硬，呈褐色或黑色（由于硫化铁的影响）。 炎症渗出：炎症过程中，血液成份通过血管壁进入炎症灶的过程。 炎症浸润：炎症过程中，血液中白细胞穿过血管壁进入炎区，并在炎区组织间集聚，称之为炎症浸润。 虎斑心：心脏发生脂肪变性时，在正常心肌之间有灰黄色的条纹或斑点分布，外观上呈黄红相间的虎皮状斑纹，称为虎斑心。 肉芽组织：是指由毛细血管和成纤维细胞增殖形成的一种幼稚结缔组织。肉眼观呈颗粒状、鲜红色、质地柔软、类似肉芽。 出血性梗死：是指多发生在组织疏松的器官瘀血时，当其动脉阻塞后，梗死灶内组织间隙可容纳多量血液，而呈暗红色。 癌：是指来源于上皮组织的恶性肿瘤。 肉瘤：是指来源于间叶组织的恶性肿瘤。 心肌梗死：是指心脏冠状动脉供血区的持续性缺血，导致较大面积的心肌坏死。 黄疸：由于胆红素代谢障碍，胆红素在血液中积存过多，把机体的浆膜、粘膜、骨膜、脂肪等等染成黄色，称为黄疸。 蜂窝织炎：皮下或肌肉之间疏松结缔组织弥漫性化脓性炎症、称为蜂窝织炎。