降香新黄酮latifolin对大鼠急性心肌缺血影响及介导Nrf2信号通路机制研究

降香新黄酮latifolin对大鼠急性心肌缺血影响及介导Nrf2信号通路机制研究研究降香新黃酮latifolin对垂体后叶素（Pit）及异丙肾上腺素（ISO）致大鼠急性心肌缺血保护作用及作用机制。

Pit及ISO分别诱导大鼠急性心肌缺血，观察大鼠心电图变化。

ISO诱导大鼠急性心肌缺血，ELISA法或比色法检测血清中心肌损伤标志物含量或活力、比色法检测心肌中SOD活力及MDA含量；HE 染色进行组织病理学检查；心肌组织冰冻切片进行DCFHDA荧光染色，检测心肌中ROS含量水平；Western blot法检测心肌中Nrf2，Keap1，HO1及NQO1的蛋白表达水平。

心电图结果显示，latifolin抑制Pit及ISO引起的ST段变化，抑制Pit引起心率减慢。

机制研究结果显示，latifolin降低血清中cTnI含量和AST 及LDH活力；升高心肌中SOD活力，降低心肌中MDA含量；降低心肌组织炎细胞浸润、肌纤维断裂及坏死的程度；减弱心肌DCFHDA荧光染色的荧光强度；抑制Keap1的蛋白表达，促进Nrf2核转移，促进HO1及NQO1的蛋白表达。

结果表明降香新黄酮latifolin对大鼠急性心肌缺血具有保护作用，主要机制可能与激活Nrf2信号通路从而发挥抗氧化作用有关。

标签：latifolin；垂体后叶素；异丙肾上腺素；心肌缺血；Nrf2信号通路[Abstract]The present study was designed to evaluate the cardioprotective effect of latifolin on pituitrin（Pit）or isoproterenol（ISO）induced myocardial injury in rats，and further investigate its underlying mechanisms Rats were administrated sublingually with pituitrin or subcutaneously with isoproterenol to induce acute myocardial ischemia in rats，and lead II electrocardiograph was recorded In rats with isoproterenol，ELISA assay or colorimetric method was used to detect the content or activity of myocardial injury markers in serum，and the SOD activity and MDA content in myocardium were detected by colorimetric assay；histopathological examination was conducted by HE staining；the frozen section of myocardial tissues was used for DCFHDA fluorescent staining to detect the content of ROS in myocardium；Western blot was used to detect the protein expression levels of Nrf2，Keap1，HO1 and NQO1 in myocardium Results showed that latifolin significantly inhibited STsegment changes induced by pituitrin or isoproterenol，and increased heart rate Further mechanism study showed that latifolin reduced cardiac troponin I （cTnI）level，aspartate transaminase（AST）and lactate dehydrogenase（LDH）activities in serum，increased myocardial superoxide dismutase（SOD）activity and reduced myocardial malondialdehyde（MDA）level，and protected myocardium with less necrosis，infiltration of inflammatory cells and fracture of myocardial fibers Furthermore，latifolin obviously reduced ROS level in myocardium，inhibited the expression of Kelchlike ECHassociated protein1（Keap1），increased the nuclear translocation of nuclear factor erythroid 2 related factor 2（Nrf2），and promoted the expression of Heme oxygenase1（HO1）and NAD（P）H quinone oxidoreductase1（NQO1）in myocardial tissues Our data suggest that latifolin has a potent protective effect against pituitrin or isoproterenolinduced myocardial injury，which may be related to inhibition of oxidative stress by activating Nrf2 signaling pathway.[Key words]latifolin；pituitrin；isoproterenol；myocardial injury；reactive oxygen species；Nrf2 signaling pathway缺血性心脏病是引起人类死亡的主要因素，世界卫生组织公布的数据显示，2015年缺血性心脏病死亡人数占全球死亡人数的155%，对人类健康有着极其重大的威胁。

药物治疗是目前缺血性心脏病的首选治疗方法，因此研发安全、有效、毒副作用小的治疗药物对缺血性心脏病的防治具有重要意义。

降香为豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T Chen树干和根的干燥心材，可化瘀止血，理气止痛，被广泛用于治疗胸痹刺痛和跌扑伤痛等[1]。

舒心宁片、冠心丹参胶囊、血栓通、冠心Ⅱ号及通心络等含降香的中成药被广泛用于缺血性心脏病的治疗。

降香主要包含挥发油和黄酮类化合物，药理学研究表明这些成分具有抗血栓、抗炎及抗氧化等生物活性[2]。

课题组前期研究证实降香具有明显的抗心肌缺血作用，本课题主要开展降香有效成分latifolin對心肌缺血的保护作用及机制研究。

1材料11动物SPF级SD大鼠，雄性，体质量180～200 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）20110003。

12药品及试剂latifolin[化学结构名称为（-）（R）latifolin，PubChem编号为340211]由江西中医药大学药学院提供，纯度>98%；硝酸异山梨酯片购自山西云鹏制药有限公司（批号B141001）；盐酸普萘洛尔片购自江苏亚邦爱普森药业有限公司（批号1505109）；垂体后叶素注射液购自南京新百药业有限公司（批号150104）；异丙肾上腺素（批号WXBB7695V）及DCFHDA（批号015M4038V）购自Sigma公司；AST试剂盒（批号20160311）、LDH试剂盒（批号20160311）、SOD试剂盒（批号20160311）、MDA试剂盒（批号20160309）均购自南京建成生物工程研究所；cTnI酶联免疫吸附试剂盒购自武汉优尔生商贸有限公司（批号L160303092）；胞浆/胞核蛋白提取试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司（批号20160113）；兔Nrf2多克隆抗体（批号GR2499535）、兔Keap1多克隆抗体（批号GR2851673）、兔HO1单克隆抗体（批号GR9679510）、兔NQO1单克隆抗体（批号GR1950438）均购自Abcam公司；兔H3多克隆抗体（批号20）及兔βactin 多克隆抗体（批号0007）购自Cell Signaling公司。

13仪器ML866型Powerlab电生理记录仪（澳大利亚ADI Instruments）；SpectraMaxi3型多功能酶标仪（美国Molecular Devices）；5810R型冷冻离心机（德国Eppendorf）；COVER015型光学显微镜（日本OLYMPUS）；CM1850型冰冻切片机（德国LEICA）；DMI300B型荧光倒置显微镜（德国LEICA）；Western blot 系统（美国BioRad）；BioRad凝胶成像系统（美国BioRad）。

2方法21latifolin对急性心肌缺血大鼠心电图的影响211latifolin对Pit致急性心肌缺血大鼠心电图的影响分组、给药及造模：SD 大鼠随机分为正常组、模型组、硝酸异山梨酯片组（3 mg·kg-1）及latifolin高、中、低剂量组（100，50，25 mg·kg-1），正常组及模型组给予等体积的05%CMCNa 溶液，连续灌胃给药5 d。

末次给药后1 h，除正常组外，各组舌下静脉恒速推注Pit（1 U·kg-1），复制大鼠急性心肌缺血模型。

正常组则按相同方法注射等体积的生理盐水。

心电图检测：腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠，仰卧位固定于鼠板上，Powerlab 电生理记录仪记录Ⅱ导联心电图。

记录各组大鼠造模前后的心率和ST段高度（其中ST段无论抬高或压低，均以造模前后变化的绝对值进行统计学分析）。

212latifolin对ISO致急性心肌缺血大鼠心电图的影响分组、给药及造模：SD 大鼠随机分为正常组、模型组、普萘洛尔组（30 mg·kg-1）及latifolin高、中、低剂量组（100，50，25 mg·kg-1），正常组及模型组给予等体积的05%CMCNa 溶液，连续灌胃给药5 d。