外源基因的表达体系
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
外源基因的导入和表达研究
外源基因的导入和表达研究随着生物技术的不断进步，人类利用基因工程技术已经可以人为地导入外源基因（即来自不同物种的基因）到特定的生物体中，并在其内部进行表达。
外源基因的导入和表达研究不仅在医学领域有重要的应用价值，而且可以用于植物和动物的育种、菌类的生产等多个领域，具有非常广泛的意义。
一、外源基因的导入方式外源基因的导入通常有三种方式：基因转染、基因克隆和基因突变。
其中基因转染是最常见的一种方法，其通过化学手段或物理手段将外源质粒导入到细胞内，使细胞内的染色体带有外源DNA序列，让生物体在遗传上发生变化。
基因克隆指的是利用重组DNA技术将外源基因插入到载体中，形成重组质粒，再将其导入到宿主细胞。
而基因突变指的是利用基因工程技术将目标基因的部分序列或全部序列进行基因剪切或点突变，从而在细胞内引入特定的改变。
二、外源基因的表达方式一旦外源基因成功地导入到宿主细胞后，就需要利用相应的机制使其被正确表达。
一般而言，外源基因的表达方式主要有两种：转录和翻译。
转录是指将某个基因的DNA序列转换成相应的mRNA序列，为后续的翻译打下基础。
而翻译则是将翻译RNA （tRNA）和核糖体结合，将mRNA的密码子转化成氨基酸序列，最终形成蛋白质。
在这个过程中，外源基因所编码的蛋白质需要能够正确地折叠和组装。
三、外源基因的应用外源基因的应用非常广泛。
在医学领域，外源基因的导入和表达技术已经成为了基因治疗的基础。
通过将正常的基因序列导入到受损或异常的细胞中，可以纠正基因缺陷，并且达到治疗某些遗传病的目的。
同时，外源基因导入技术也可以用于生产重组蛋白，如人类重组胰岛素、重组干扰素、重组免疫球蛋白等，这些蛋白对于多种疾病的治疗都有重要的作用。
在植物和动物育种领域，利用外源基因导入和表达技术也可以获得一些长期以来难以获得的农作物，如对抗虫害、抗病性更强的水稻、高营养价值的谷物等。
此外，外源基因导入技术还可以用于菌类的生产和制药领域。
第七章-外源基因的表达
2021/4/9
1
第一节 外源基因在原核细胞中的表达
1.原核生物基因表达的特点
与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点： （1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 （2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。 （3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是 连续进行的。 （4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细 胞的转录后加工系统。 2（0215/4）/9 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对 2
202菌中的表达部位
（1）不同表达部位
克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有 的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是 以分泌到细胞外的方式表达。
■细胞质中表达
大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式 存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集 折叠而成的晶体结构。
（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3
➢具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启 动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列 组成。
➢紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很
2容021易/4/9把目的基因定位在启动子和S-D序列之后。
的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控 制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读 框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外 源基因的表达产物对宿主菌的伤害。
3.原核生物基因表达的调控序列
外源基因的导入和表达机制
外源基因的导入和表达机制随着生物技术的飞速发展，外源基因的导入和表达成为了基因工程领域中的重要课题。
其涉及到基因治疗、转基因作物、药物生产等许多领域。
在导入和表达外源基因的过程中，要考虑到基因的适应性、表达的稳定性、特异性以及对宿主生物的影响等多个方面。
本文将探讨外源基因的导入和表达机制，包括基本原理、工具和技术以及存在的问题和挑战。
基本原理导入和表达外源基因的基本原理是将外源DNA序列引入到宿主细胞中，使其被转录和翻译成蛋白质。
具体而言，一般有两种方式：直接转染和向宿主基因组中嵌入外源基因，后者也称为基因整合。
直接转染是将外源DNA序列直接引入到细胞外，在细胞膜相关的受体介导下，外源DNA序列被进入到细胞质中。
直接转染的DNA所携带的信息将指导它在宿主细胞内的表达。
基因整合是将外源DNA序列整合到宿主细胞染色体上，使其成为宿主细胞的一部分。
基本原理是将外源DNA构建为一个适合于整合的载体，然后具体通过发生基因重组或嵌入基因导入宿主细胞的染色体中。
被整合的外源脱氧核糖核酸(DNA)序列将被遵循宿主细胞一样转录并翻译成蛋白质。
工具和技术导入和表达外源基因要解决的核心问题就是如何将外源DNA 送入宿主细胞。
为此，研究者现有许多的工具和技术可供选择。
电穿孔是将宿主细胞暴露在高电场的冲击下，使细胞膜通透性增强，外源DNA得以进入的技术。
这种技术既可以使用简单的电刺激来进行，也可以通过利用特殊设备专门进行。
这种技术在大多数细胞类型中都是有效的。
群粒化法是利用氟化物和离子溶液百炼生化学反应，在其中产生群粒化团块，通过进一步化学反应打开细胞膜，使外源DNA进入细胞内部。
这种技术适用于一些难以被电穿孔的细胞类型。
病毒载体是将外源DNA序列植入病毒中，通过感染宿主细胞扩增表达，使表达的目标基因在细胞内获得较高的表达水平。
存在的问题和挑战虽然外源基因的导入和表达在许多方面得到了极大的改进，但仍然存在着一些问题和挑战。
外源基因的表达
•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
外源基因的表达
小节
外源基因的转录系统
蛋白质的翻译系统
基因表达载体
复制子 选择标记
*
4.3.1 重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因
4.3 宿主菌
1
大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统
2
大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子。
3
大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。
*
终止子
2.4 衰减子 转录终止的位置 分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。 调节转录的起始和终止. Trp操纵子
1
2
第三节 外源基因表达系统
3.1 定义 外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。
*
3.2 种类
*
起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。 GUG、UUG：有极少数生物利用。
翻译起始密码子
③翻译终止密码子
翻译终止密码子：能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。 在大肠杆菌中，新合成的多肽链的释放由RF1和RF2两个释放因子所调控。 RF1识别终止密码UAA和UAG， RF2识别终止密码UAA和UGA 由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。 通常将几个终止密码串连在一起，以保证翻译的有效终止。
启动子和终止子：因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。
1
2
*
①启动子
外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。
外源基因的原核表达
10.04.2021
41
常见的大肠杆菌表达系统
• PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启 动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和 PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或 溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产
物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在
细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之 间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞
与起始密码ATG之间的距离及碱基 的种类；防止核糖体结合位点附近 序列转录后形成发卡结构。
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表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标
基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之 间的距离和碱基组成处于一个适当的范围 内。
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核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻
1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
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外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
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尽量提高核糖体结合位点本身和附近 的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5’ 端形成的 “茎环” 结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意 的事项。
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。
以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。
质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。
2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。
这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。
3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。
选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。
4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。
这一步通常涉及DNA 连接酶。
5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。
质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。
6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。
这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。
7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。
8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。
这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。
9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。
这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。
整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。
这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。
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芽胞杆菌表达系统
蛋白水解： 蛋白水解： 芽胞杆菌分泌胞外蛋白酶， 芽胞杆菌分泌胞外蛋白酶，至少七种 ——碱性蛋白酶（arpE） 碱性蛋白酶（ 碱性蛋白酶 arpE） 中性蛋白酶（ nprB） 中性蛋白酶（nprE 和nprB） 金属蛋白酶（mpr） 金属蛋白酶（mpr） 丝蛋白酶（epr\bpf\vpr） 丝蛋白酶（epr\bpf\vpr） 其中，aprE和nprE最普遍 最普遍。 其中，aprE和nprE最普遍。
芽胞杆菌表达系统
特点： 特点： 非致病性 遗传学研究 分泌胞外蛋白 生产商业酶
芽胞杆菌表达系统
宿主菌： 宿主菌： 枯草杆菌、嗜碱芽胞杆菌、淀粉芽胞杆菌、 枯草杆菌、嗜碱芽胞杆菌、淀粉芽胞杆菌、 短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、 短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、嗜热脂肪芽 胞杆菌、耐碱的芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等。 胞杆菌、耐碱的芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等。
芽胞杆菌表达系统
蛋白折叠： 蛋白折叠： 枯草芽孢杆菌 内陪伴分子（intracellular molecular chaperones） ） 外陪伴分子（extracytoplasmic molecular chaperones） ） PrsA 变型菌株：WB600蛋白缺陷型 变型菌株：WB600蛋白缺陷型 WB600[pEPP]型含有 型含有PrsA WB600[pEPP]型含有PrsA WB600BHM[pEPP]型有内外陪伴分子 型有内外陪伴 WB600BHM[pEPP]型有内外陪伴分子 发现二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白还原酶——保护巯基 发现二硫键异构酶、硫氧化还原蛋白还原酶 保护巯基
表达系统概述
表达系统分类 表达系统分类 原核表达系统 大肠杆菌表达系统 芽胞杆菌表达系统 链霉菌表达系统 真核表达系统 酵母表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 植物细胞表达系统
表达系统概述
研究表达体系意义： 研究表达体系意义： 意义 高效、稳定、准确表达外源基因 高效、稳定、准确表达外源基因 需考虑： 基因来源 产物类型 需考虑： 科研背景 应用背景
包涵体
其他表达系统及对比
酵母表达系统： 酵母表达系统： 特点：含有真核体系共有的翻译后修饰，生长快、 特点：含有真核体系共有的翻译后修饰，生长快、 方便简单成本低，外源蛋白易分离。 方便简单成本低，外源蛋白易分离。 宿主菌：毕赤酵母、酿酒酵母 宿主菌：毕赤酵母、
三种表达系统的对比
特有优点 芽胞杆菌表达系统 无毒（ 1. 无毒（除炭疽芽胞杆 蜡样芽胞杆菌） 菌、蜡样芽胞杆菌） 2. 分泌胞外蛋白 遗传学背景最全 1．无毒 2．真核修饰 缺点 1.分泌蛋白酶 1.分泌蛋白酶 2.质粒稳定性差 2.质粒稳定性差 3.无真核修饰 3.无真核修饰 1．易形成包涵体 易形成包涵体 2．无真核修饰 产乙醇
其他表达系统及对比
大肠杆菌表达系统： 大肠杆菌表达系统：
特点：遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期 特点：遗传背景清楚、目的基因表达水平高、 抗污染能力强等。 短、抗污染能力强等。 表达载体：需含有启动子（ 启动子 启动子、 启动子 启动子trp启动 表达载体：需含有启动子（lac启动子、tac启动子 启动 ）、核糖体结合位点 核糖体结合位点（ ）、转录终止子 子）、核糖体结合位点（RBS）、转录终止子 ）、 回文结构）。 （回文结构）。 提高外源基因表达水平：提高翻译水平、生长与表达分开、 提高外源基因表达水平：提高翻译水平、生长与表达分开、 提高表达蛋白稳定性
差异？？？ 差异？？？
载体： 载体： 质粒、整合质粒、 质粒、整合质粒、噬菌体Leabharlann 各种胞内外反应对外源表达的影响
芽胞杆菌表达系统
芽胞杆菌表达系统
转录
蛋白折叠
跨膜
信号肽加工
蛋白水解
芽胞杆菌表达系统
转录： 转录： RNA聚合酶 核心酶、 亚基） 聚合酶（ RNA聚合酶（核心酶、σ亚基） 强启动子（Pamy－ 强启动子（Pamy－α-淀粉酶启动子、Ptms－ 淀粉酶启动子、Ptms－ 强营养启动子、P43－σA和 强营养启动子、P43－σA和σB 识别的启动子） 识别的启动子） P43〉Ptms〉Pamy P43〉Ptms〉
外源基因的微生物表达系统 外源基因的微生物表达系统
——芽胞杆菌表达系统 芽胞杆菌表达系统
主要内容
表达系统概述 芽胞杆菌表达系统
其他表达系统及对比
表达系统概述
基因的外源表达 将外源基因与表达载体连接， 基因的外源表达——将外源基因与表达载体连接， 外源表达 将外源基因与表达载体连接 导入到受体细胞中，高效生产有价值的基因产物。 导入到受体细胞中，高效生产有价值的基因产物。 这一过程包括外源基因的复制、转录、翻译、 这一过程包括外源基因的复制、转录、翻译、加 分离纯化等。 工、分离纯化等。 表达系统——重组表达载体 外源基因的表达系统 重组表达载体 外源基因的表达系统 受体细胞
芽胞杆菌表达系统
跨膜： 跨膜： 定位——前体蛋白与陪伴分子、信号肽结 前体蛋白与陪伴分子、 定位 前体蛋白与陪伴分子 合，定位在质膜上 转移——膜蛋白 转移 膜蛋白 能量 释放——信号肽酶 释放 信号肽酶
芽胞杆菌表达系统
信号肽加工： 信号肽加工： 信号肽分类——TypeⅠ、TypeⅡ TypeⅠ、 信号肽分类 TypeⅠ 信号肽酶—— 七种（SipS、SipT） 七种（SipS、SipT） 信号肽酶 SPases） （SPases）
大肠杆菌表达系统 酵母表达系统
共同点：发酵周期短、 共同点：发酵周期短、遗传学研究全面
Thank you for your attention!
芽胞杆菌表达系统
蛋白酶缺陷型菌株： 蛋白酶缺陷型菌株： WB600存在vpr（丝蛋白酶） WB600存在vpr 丝蛋白酶） 存在vpr（ WB700全部缺陷 WB700全部缺陷 WB800去除内源蛋白酶的影响 WB800去除内源蛋白酶的影响
芽胞杆菌表达系统
注意： 注意： 胞外蛋白酶——缺陷型菌株 胞外蛋白酶 缺陷型菌株 质粒稳定性——质粒构建 质粒构建 质粒稳定性