去除选择标记基因的Cre_lox重组系统在植物中的应用
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在病毒感染性疾病治疗中的应用
基因敲除技术能够消除病毒复制所需的宿主细胞内基因从而阻止病毒的复制和感染。
基因敲除技术可以用于开发新型抗病毒药物通过抑制病毒复制或干扰病毒生命周期的关键环节 来治疗病毒感染。
基因敲除技术可以用于基因治疗通过将正常基因导入宿主细胞替代缺陷基因恢复细胞功能达到 治疗目的。
CRISPR-Cs9与病毒载体的联用
Cre-loxP技术用于控制基 因表达
CRISPR-Cs9技术用于编 辑基因
病毒载体在基因敲除中的重 要作用
Cre-loxP、CRISPR-Cs9 技术与病毒载体的联用原理
三者联用的优势与挑战
优势：Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体在基因敲除中的联用可以实现高效、精准 的基因敲除有助于研究基因功能和疾病治疗。
基因敲除技术简介 Cre-loxP系统在基因敲除中的应用 CRISPR-Cs9系统在基因敲除中的应用 病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在癌症治疗中的应用
基因敲除技术能够精准地编辑人类基因为癌症治疗提供了新的手段。
通过敲除致癌基因或激活抑癌基因基因敲除技术可以有效抑制癌症细胞的生长和扩散。 基因敲除技术在癌症治疗中具有个体化、精准化的特点可以降低治疗副作用和提高治疗 效果。 目前基因敲除技术在癌症治疗领域仍处于研究阶段但已取得了一定的成果和进展。
基因敲除技术还可以用于疫苗开发通过消除病毒基因中的关键位点降低病毒的毒力或致癌性从 而开发出更安全、更有效的疫苗。
06
未来展望与研究方向
Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体联用技术的发展 前景
技术改进：随着 基因编辑技术的 不断进步CreloxP、 CRISPR-Cs9与 病毒载体的联用 技术将得到进一 步优化提高敲除 效率和应用范围。
关于生物防治的论文
昆虫杆状病毒的研究与应用现状摘要：杆状病毒是节肢动物的专性病原物，多见于昆虫纲的鳞翅目昆虫。
在昆虫杆状病毒中昆虫杆状病毒表达载体系统的建立和发展，被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。
文章重点介绍了昆虫杆状病毒表达载体系统的研究和在基础研究领域，农、林业的应用现状。
关键词：昆虫杆状病毒表达载体系统，基础研究，农、林业昆虫杆状病毒包含核型多角体病毒和颗粒体病毒两大类，是昆虫专一性病原物，对目标害虫致病性强，不产生抗药性，田间释放安全、环保。
同时由于病毒粒子被抗逆性很强的蛋白（多角体蛋白或颗粒体蛋白）所包裹，在环境中较为稳定，制成农药制剂后，货架寿命相对较长，使用方便，具有很强的商品属性。
其中，昆虫杆状病毒表达载体系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工，并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品。
早在上世纪70年代，昆虫杆状病毒就被美国食品与药品管理局和世界卫生组织推荐为安全的生物杀虫剂用于害虫的防治。
当前，环境保护和食品安全问题日益受到关注，如何解决植物保护和环境污染、农药残留之间的矛盾，是植保工作者必须面对的课题。
昆虫杆状病毒杀虫剂作为生物农药中的重要成员，应该为此做出贡献。
我国昆虫病毒杀虫剂的产业化开发已有30年的历史，有过骄人的成绩，然而同其它产业化成功的生物农药相比（如Bt、井冈霉素、阿维菌素等），无论在生产规模、质量标准、市场份额、社会影响等诸多方面，都存在巨大的差距。
一、昆虫杆状病毒的研究昆虫杆状病毒是最大的环状单一双链DNA病毒，其基因组在90～230 kb之间，具有编码上百种蛋白质的能力。
该病毒基因组可在昆虫细胞核内进行复制和转录，其巨大的DNA复制后组装在杆状的核衣壳内。
由于昆虫杆状病毒DNA具有大量的非复制必需区，能容许基因缺失或替换，且其较大的柔软性，能容纳大片段外源DNA的插入，这为昆虫杆状病毒的重组提供了广阔发展空间。
在昆虫杆状病毒的研究中，杆状病毒表达载体系统是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理Cre-loxp系统是一种常用的基因敲除技术，用于特定区域的基因敲除。
该系统是通过两种转基因技术相互配合实现的，即Cre重组酶和loxp位点。
Cre重组酶是一种由细菌噬菌体产生的酶，能够识别和剪切含有loxp位点的DNA序列，从而实现特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统的原理如下：1. Cre重组酶的表达：首先，使用基因工程技术将Cre酶的编码基因嵌入到转基因小鼠的基因组中，使其能够在特定的组织或细胞类型中产生。
通过引入特定的启动子或组织特异性表达的促进子，可以实现Cre重组酶在目标组织或细胞中的表达。
2. 基因敲除载体：在目标基因的启动子或内含子区域，插入一对loxp位点。
loxp位点是一种特殊的DNA序列，约有34个碱基对，呈倒向重复，用于诱导Cre重组酶的作用。
3. Cre重组酶的介导：一旦Cre重组酶在目标组织或细胞中表达，它能够识别和结合含有loxp位点的DNA序列，并结合在loxp位点上。
Cre重组酶在loxp位点间发生酶活性，通过识别和切割这两个loxp位点间的DNA链，将目标基因位点裂解。
4. 基因敲除效应：一旦目标基因位点被裂解，无法继续正常转录和翻译，从而导致目标基因的敲除。
这样，就实现了在特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统具有以下特点和优点：1. 灵活性：Cre-loxp系统可以在不同的组织或细胞类型中实现基因敲除，由于Cre重组酶的表达是由特定启动子或组织特异性表达的促进子控制的，因此可以实现组织或细胞特定的基因敲除。
2. 高效性：Cre重组酶的催化作用很高效，能够在较短的时间内进行特定区域的基因敲除。
3. 精确性：Cre重组酶只能识别和剪切含有完整loxp位点序列的DNA链，因此能够实现精确的目标基因敲除，而不会对其他基因产生影响。
4. 可逆性：如果需要在特定的时期或特定的组织中恢复目标基因的表达，只需停止Cre重组酶的表达即可。
基因打靶 cre-loxp重组酶系统
基因打靶基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念：1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。
3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。
ES 623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。
建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
Cre-loxp系统
Cre-loxp系统Cre-lox系统介绍及使⽤汇总由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率⾼的优点，如今已经成为体内外遗传操作的强有⼒⼯具。
利⽤Cre-lox系统，可以在特定细胞、组织或整个⽣物体，甚⾄在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和⼈类疾病动物模型的建⽴都具有深刻影响。
1.什么是Cre-lox系统？从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分：(1)Cre重组酶环化重组酶（Cre,cyclizationrecombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之⼀，能催化两个DNA 识别位点之间的位点特异性重组。
Cre重组酶来源于P1噬菌体，由343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。
除Cre以外，此类重组酶还有Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。
(2)Lox位点Cre重组酶识别的回⽂DNA位点，也叫loxP(locusofX-overP1)位点，长34bp，其特征结构为ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。
两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发⽣位置，这也决定了loxP的⽅向。
N表⽰可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的Lox位点，除了野⽣型loxP，常见的还有Lox2272，Lox511，Lox5171等等，这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别，但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发⽣重组。
在同⼀个DNA分⼦上，根据Lox位点的位置与⽅向，可能会发⽣3种不同的重组事件：（1）切除：当两个Lox位点在同⼀染⾊体上且⽅向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列（也叫Lox侧翼序列，Flox序列）。
（2）反转：当两个Lox位点位于同⼀染⾊体上且⽅向相反时，两个Lox位点之间的序列发⽣序列反转，即颠倒。
（3）易位：如果两个Lox位点位于不同的染⾊体上且⽅向相同，则易位事件将导致DNA ⽚段的交换。
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍基因敲除小鼠是我们研究基因功能必不可少的利器，主要分为全身性基因敲除和条件性基因敲除。
然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，例如：不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能；全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。
因此，条件性基因敲除小鼠虽然有周期长、费用高、需要配合特定工具鼠使用等劣势，但仍获得了越来越多的选择与喜爱。
今天，就和大家一起来了解下条件性基因敲除方法必用的Cre-loxP重组系统以及应用Cre-loxP进行条件性基因敲除的原则。
概述Cre-loxP重组系统，即对一段特定的DNA序列进行定位并用Cre 重组酶对其进行剪接，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。
其中Cre蛋白，最初由“导致重组（Cause recombination）”命名，也有文献命名为“环化重组酶（Cyclizationrecombinase）”。
Cre重组酶（CyclizationRecombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。
它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除loxP片段间的基因。
loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌体基因组中34bp的特殊位点序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。
其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向，间隔区中的“N”代表这个碱基是可变的：发展历史1985年，R H Hoess, K AbremskiCre-Lox首次发表了大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统的断裂和交换机制文章。
1987年，Brian Sauer博士把大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统在酿酒酵母中即真核系统中进行了功能表达，提出了Cre介导的位点特异性重组可能是调节真核生物基因组重排的有用工具的预想。
植物无标记转化的诱导表达Cre_loxP重组系统的构建A
收稿日期:2007212207基金项目:国家自然科学基金项目(30460081);新疆维吾尔自治区高等学校科研计划资助项目(X J E DU2005S15)作者简介:段小瑜(19822),女,中山大学博士研究生,专业方向为植物基因工程;e 2mail :dxyu324@ 。
通讯作者:马兵钢(19722),男,副教授,博士,从事园艺生物技术的研究;e 2mail :mbg agr @ 。
第26卷 第1期2008年2月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University (Natural Science )V ol.26 N o.1Feb.2008文章编号:100727383(2008)0120030205植物无标记转化的诱导表达Cre/loxP重组系统的构建段小瑜,张录霞,马 超,郝青楠,马兵钢(石河子大学农学院,新疆石河子832003)摘要:应用Cre/loxP 系统位点专一性重组的特点构建诱导表达的定位重组系统,用以特异性的敲除转基因植物的标记基因。
为了获得诱导表达启动子,从大豆基因组DNA 中用pfu 酶克隆热激蛋白启动子gmhsp 17.5c ,将其克隆到pUC1182Hinc Ⅱ载体并测序。
结果表明,508nt 的gmhsp 17.5c 与已报道序列(G enBank ,AF544399)比较,核苷酸的同源性为99.8%。
利用该诱导启动子分别构建了含gmhsp 17.5c 2cre 基因组件和gmhsp 17.5c 2gus 基因组的诱导型植物表达载体pC23HC 和pC23HG 。
此外1个含有loxP 2gus 2loxP 组件的组成型植物表达载体pC23LG 被构建。
通过对3个植物表达载体做多重酶切及亚克隆后测序分析表明载体pC23HC 全长10947bp ,载体pC23HG 全长11396bp ,载体pC23LG 全长11900bp ,符合预期设计。
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生物工程学报 C hin J Biotech 2009, October 25; 25(10): 1459-1463 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ © 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM , All rights reservedReceived : July 18, 2009; Accepted: August 26, 2009Supported by : National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA100503), the Special Program for Research of Transgenic Plants (No. 2008ZX08010-002)Corresponding author : Xiaokun Li. Tel: +86-431-84533348; E-mail: xiaokunli@国家高技术研究发展计划(863计划) (No. 2007AA100503), 国家转基因生物新品种培育重大专项(No. 2008ZX08010-002)资助。
去除选择标记基因的Cre/lox 重组系统在植物中的应用刘秀明1, 孟欣欣1, 李海燕1,2, 杨晶1, 付宏歧1, 李校堃1,31 吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心, 长春 1301182 吉林农业大学生命科学学院, 长春 1301183 温州医学院, 温州 325035摘 要: 获得无选择标记基因的转基因植物越来越受到研究者的重视。
目前, 应用得较广泛的去除选择标记基因的方法有共转化法和位点特异性重组法, 其中位点特异性重组系统中Cre/lox 重组系统研究最多。
以下介绍了Cre/lox 位点特异性重组系统的原理、特点及其近几年在植物中的应用, 针对本实验室在这一领域的研究情况, 重点阐述了Cre/lox 系统的应用前景。
随着植物反应器研究领域的不断壮大, 去除筛选标记基因是植物反应器研究的必然趋势。
关键词: 无选择标记基因, Cre/lox 重组系统, 转基因植物Application of the self excision Cre/lox system in plantsXiuming Liu 1, Xinxin Meng 1, Haiyan Li 1,2, Jing Yang 1, Hongqi Fu 1, and Xiaokun Li 1,31 Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development , Jilin Agricultural University , Changchun 130118, China2 College of Life Sciences , Jilin Agricultural University , Changchun 130118, China3 School of Pharmaceutical Sciences , Wenzhou Medical College , Wenzhou 325035, ChinaAbstract: Marker-free plants have been public concern. Co-transformation and site-specific recombination system are more important methods in self-gene excision. We reviewed the Cre/lox site-specific system and its applications in plants, also, we discussed perspectives of the system in according with our experience.Keywords : marker-free gene, Cre/lox site-specific recombination system, transgenic plant近年来, 随着植物反应器的研究领域的壮大, 利用基因工程手段在植物中导入目的基因加工和生产蛋白的研究越来越多, 这就引起了转基因植物的安全生产问题。
在利用植物反应器生产药用蛋白及疫苗的研究中, 常用的植物表达载体均含有选择标记基因和目的基因, 借助选择标记基因来筛选和检测转化后的植株。
而当目的基因被转入植株中后, 选择标记基因的存在对蛋白的提取、纯化及生产却带来了隐患, 人们担心利用植物作为生物反应器生产蛋白会带来非目的产品的基因工程产物, 同时它也引起了消费者和环境学家对生态环境和食品安全性问题的关注和担忧[1]。
因此, 构建无选择标记基因1460 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech October 25, 2009 Vol.25 No.10的植物表达载体或消除转化后植物中的标记基因就显得至关重要。
所谓获得无选择标记基因的植物是指直接构建不含有选择标记基因的表达载体, 或者构建含有标记基因的载体, 然后经过后代的基因重组与分离剔除标记基因。
目前, 已经在番茄[1]、马铃薯[2]、烟 草[3]、油菜[4]、玉米[5]、大豆[6]、小麦[7]等多种植物中获得了无选择标记基因的植株。
1 无选择标记基因的应用概述在植物作为生物反应器的研究过程中, 主要用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因作为标记基因来筛选含有目的基因的植物。
但是, 一旦目的基因被验证已转入到植物中去, 筛选标记基因的存在就显得没有意义了, 甚至会产生副作用。
因此, 无论是含有抗性基因的转基因植物品种改良还是应用在植物反应器中所引入的抗性基因都引起了人们对食品和生物的安全性的怀疑, 特别是在利用植物生产药用蛋白的研究中, 引入的抗性基因可能会影响到目标蛋白的结构和功能, 对投入到田间释放和临床生产中的植物及蛋白更会产生威胁。
因此, 去除植物中的选择标记基因是今后植物反应器研究领域的必然趋势。
去除植物中选择标记基因的方法主要有共转化法、转座子技术、位点特异性重组法及直接构建不含有选择标记基因和载体骨架的载体[8]。
共转化法是指将目的基因和选择标记基因分别构建到不同载体或同一载体的不同区域, 将多种载体同时转化同一受体植物, 进而筛选出共转化植株的方法[9]。
转座子技术是利用基因组中一段可移动的DNA 序列, 通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。
位点特异性重组系统主要包括Cre/lox [10]、FLP/frt [11]、R/RS [12-13]。
在这些方法中, 应用最多最广泛的是共转化法和Cre/lox 位点特异性重组系统。
2 Cre/lox 位点特异性重组系统2.1 原理Cre/lox 重组系统主要通过Cre 重组酶对lox 序列进行切割和重新连接, 介导lox 序列发生特异性重组。
Cre 重组酶通过一定的途径被激活后, 即可通过诱导型启动子诱导, 专一性地识别34 bp 的lox 位点, 进而同向lox 位点之间的全部DNA 序列会由于发生重组而被剔除。
通常情况下, 在构建表达载体时, 将目的基因以外的其他基因(筛选标记基因和报告基因)定位在同向的2个lox 位点之间, 通过Cre 重组酶的引入剔除lox 位点之间的基因。
利用位点特异性重组系统培育无选择标记基因植株的一般步骤是先获得含有目的基因的抗性植株, 二次转化导入重组酶基因实现筛选标记基因的删除和重组酶的分离。
2.2 特点Cre/lox 重组系统的特点: 1)在不同物种中的重组功能稳定; 2)不需要任何辅助因子, 仅需要Cre 和lox 的识别位点; 3)lox 位点是Cre 酶的专一识别位点, 导入Cre 重组酶后会使lox 位点间的全部序列剔除掉。
基于以上特性, Cre/lox 重组系统已被成功应用于烟草、番茄、大豆、马铃薯、水稻等多种植物的无筛选标记基因的研究中。
3 Cre/lox 重组系统在植物中的应用多数研究表明, Cre 重组酶需要通过不同的诱导启动子启动而发挥作用, 常用的诱导方法有热激诱导、组织特异性启动子及化学方法等, 不同的研究方法已经被应用到不同植物中。
对于报告基因的启动表达, 应用最多的是CaMV 35S 启动子, 一般放于lox 位点前[14-16]。
将Cre/lox 重组系统应用在烟草上的技术已经成熟, 无论是质体转化还是核转化均有报道。
Lutz KA 等[17]利用Cre/loxP 位点特异性重组系统获得了无标记基因的转化烟草。
用基因枪法转化烟草的叶片, 通过将来自核基因的Cre 蛋白定向到质体中, 达到选择标记基因的自动消除。
Chakraborti D 等[18]也在烟草中进一步证实了利用Cre/lox 位点特异重组系统在转化植株后代中去除标记基因的有效性和可行性。
作者分别用含有lox 位点和Cre 基因的双元载体转化烟草, 通过T0代植株的杂交, 在T1代植株中获得了19.2%的选择标记基因的消除效率。
宋刘秀明等: 去除选择标记基因的Cre/lox 重组系统在植物中的应用1461洪元等[19]利用Cre/lox 位点特异性重组系统转化烟草, 导入Cre 重组酶基因后剔除了筛选标记基因, 通过植株开花后自交又使重组酶发生分离而获得无选择标记基因的植株。
3.1 Cre 重组酶的热激诱导热激诱导是一种诱导Cre 基因产生重组酶的常用方法, 利用热诱导可以消除lox 位点间的选择标记基因, 再通过后代的PCR 筛选产生无选择标记基因的植物。
Cuellar W 等[20]将Cre/lox 重组系统应用到马铃薯上, 构建了新型植物转化载体pCIP54/55, 即是通过热诱导技术最终消除了Cre 及2个lox 位点之间的npt Ⅱ基因, 消除效率达到了4.7%。
段小瑜 等[21]利用来自大豆基因组 DNA 中的热激蛋白启动子gmhsp17.5 c, 目的是通过热诱导来启动Cre 基因的表达, 构建了一套组成型植物无标记转化的诱导表达Cre/lox 重组系统。
3.2 应用组织特异性启动子启动Cre 基因表达在Cre/loxP 位点特异性重组系统中发展较快的是在构建表达载体时加入组织特异性启动子, 这在转基因后代中可以特异地删除标记基因。