β-葡萄糖醛酸糖苷酶GUS组织化学染色检测转基因植物
实验八GUS组织化学定位
报告基因GUS的表达的检测
材料：拟南芥AK12-pro 试剂： GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚 铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc， 再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备 用。 组织化学染色检测 -- GUS染色 1. 取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml 1mol/L GUS染色液； 2. 用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心 管中； 3. 37℃浸泡2-5h（或过夜）；（晚上继续下面的脱色和照相步骤） 4. 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色； 肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现 蓝色。
实验报告
转基因作物的检测
新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter GUS NOS-ter LB
p动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
考核
成绩计算方法（百分制）：
期末考试: 50分（考试内容包括平时操作和涉及实
验的理论基础）
平时成绩: 50分 (共5份实验报告,每份10分)
基 因 工 程 的 基 本 路 线
质粒DNA提 取和酶切
PCR
连接
转化
• 基因的组织特异性表达
原 理
GUS基因就是转β-葡萄糖醛酸酶基因 ，它存在于 E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯 类物质为底物，其分解产物呈蓝色。 由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背 景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的 研究中（作为报告基因）。根据gus基因检测所用 的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学 法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检 测法最高），其中最为常用的是组织化学法。
GUS报告基因范文
GUS报告基因范文GUS报告基因是一种用于筛选转基因植物的报告基因。
它在植物细胞内表达的酵素β-葡萄糖苷酶（β-Glucuronidase，GUS），能够将葡萄糖醛酸（X-Gluc）转化为蓝色产物。
通过观察和分析植物组织的GUS活性，可以判断是否发生了基因转化。
下面将详细介绍GUS报告基因的特点、应用以及实验方法。
1.GUS报告基因的特点（1）GUS基因来自于大肠杆菌，它很少在真核生物中表达，因此不会对植物正常生长发育产生影响。
（2）GUS基因编码的酵素活性能够方便、快速地用染色剂标记出来，实验结果直观可见。
（3）转GUS基因的步骤相对简单，转化率较高，且不需要使用昂贵的设备。
2.GUS报告基因的应用（1）植物转基因筛选：通过观察和分析转基因植物的GUS活性，可以确定哪些植株成功地转化了外源基因。
（2）基因调控研究：GUS报告基因可以用来研究目的基因的表达调控机制，例如在转基因植物中瞬时表达GUS基因，观察其在各种组织和发育阶段的表达情况，可以推测目的基因的启动子活性。
（3）信号传导途径研究：通过构建GUS基因的操纵，可以研究植物信号传导途径中特定基因的表达情况，进而了解信号传导途径的效率和调节机制。
3.实验方法以下是GUS报告基因实验的一般步骤：（1）构建GUS载体：将GUS基因与适合的植物表达载体进行连接，形成GUS转化载体。
（2）遗传转化：将GUS转化载体导入要进行转基因植物研究的植物细胞中，使用适当的生物技术方法（如冲击法、农杆菌介导法）实现遗传转化。
（3）植物筛选：选择经过转化的植株进行分析，通常可以通过PCR、Southern blot、Western blot等技术检测GUS基因的存在。
（4）组织切片染色：收集不同部位的植物组织，例如叶片、根、花等，制作切片。
使用X-Gluc作为底物加入切片中，观察蓝色染色产物的形成。
（5）定量分析：通过测定GUS活性，使用亲合素、含有底物的液体培养基等方法，可以 quantitatively 地测定GUS酶活性。
实验五、GUS染色检测基因瞬时表达
问题解决能力
实验态度转变
在实验过程中遇到问题时，我学会了独立 思考和团队协作，积极寻找解决方案。
通过认真对待每一个细节，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ培养了严谨 的实验态度和科学精神。
gus染色检测基因瞬时表达的未来发展方向
应用拓展
除了基础研究，gus染色检测基因瞬时表 达在医学诊断和治疗等领域也有广阔的应
用前景。
A 技术优化
01
02
03
研究基因功能
通过瞬时表达技术可以快 速检测特定基因的功能， 了解其在细胞中的作用。
药物筛选
利用瞬时表达技术筛选对 特定基因有调控作用的候 选药物。
基因治疗
瞬时表达技术可用于基因 治疗的研究，为疾病治疗 提供新思路。
02 实验原理
gus染色检测基因瞬时表达的生物学基础
基因瞬时表达
基因瞬时表达是指通过转录和翻译在 短时间内产生大量蛋白质的过程。在 植物和某些微生物中，瞬时表达常用 于研究基因的功能和表达调控。
学习gus染色检测基因瞬时表达的方法
准备实验材料
X-Gluc、缓冲液、DNA转染试 剂、细胞培养板等。
GUS染色
将转染后的细胞用X-Gluc染色 ，观察蓝色产物。
转染DNA
将目的DNA与转染试剂混合， 加入细胞培养板中，使DNA瞬 时表达。
结果分析
根据蓝色产物的多少判断GUS 基因的瞬时表达量。
掌握gus染色检测基因瞬时表达的应用
显色反应
在适宜的温度和pH条件下，GUS酶 催化底物水解，产生蓝色产物。
结果观察
通过观察蓝色产物的生成情况，判断 目的基因是否成功瞬时表达。
03 实验步骤
准备实验材料和试剂
准备所需的gus基因瞬时表 达载体。
烟草转基因及gus染色的方法
转基因烟草的方法 1.接种单菌落于加有KAN,RIF和STR的3ML液体YEB培养基中，28度培养2天，转接与20ML YEB液体培养基中，28度继续培养至OD600=0.6-0.8。
2.菌液经4000RPM离心10分钟，倒掉上清液，用MS液体培养基重悬菌体，调OD600=0.6-0.8 3.取无菌烟草叶片，去除边缘，主叶脉，剪成大小约1CM*1CM的小块，浸泡在菌体悬浮液中，2-3分钟，期间不断轻轻摇晃。
4.取出叶片，用灭菌滤纸吸取表面菌液，将叶片至于共培养培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L）28度黑暗共培养2-3天。
5.将共培养后的叶片在无菌水和加入羧苄青霉素的无菌水中清洗一遍，灭菌滤纸吸取多余水分，然后转到分化选择培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L，潮霉素10-60MG/L,CARB 500MG/L）25度光照培养，每两周更换一次培养基，直至分化出愈伤组织，进而分化出不定芽。
6.将长至2CM以上的不定芽切下并转移到生根培养基上（1/2MS+NAA 0.1MG/L，潮霉素20-100MG/L,CARB 500MG/L）诱导生根。
7.将一次生根的再生苗切取根尖，接种到新的生根培养基上，诱导生根，不能生根的芽丢掉。
叶盘法转基因烟草技术一．实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。
农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。
这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。
GUS染色
一、原理Gus (b-glucuronidase)基因作为一种报告基因，在植物遗传转化研究中有广泛的用途。
Gu s基因来自于大肠杆菌，编码b－葡聚糖苷酶（一种水解酶），可催化底物5－溴－4－氯－3－吲哚葡聚糖醛酸苷（5－bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，缩写为X－Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。
二、目的了解转基因植物中基因表达的器官、组织和细胞的特异性，掌握Gus报告基因表达的组织化学定位的方法。
三、材料与试剂1、转基因植物的组织、器官、种胚或幼苗。
t2、同种非转化植物的组织、器官、种胚或幼苗。
3、50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。
4、染色液：100mM K3[Fe(CN)6], 100mM K4[Fe(CN)6] 10mM Na2EDTA, 0.001% (v/v) triton X-100, 20%甲醇，0.5mg/ml X-Gluc, 磷酸缓冲液(50mM, pH 7.0)。
5、70％乙醇。
四、操作步骤1、将准备好的材料冲洗干净，用吸水纸吸干，浸在上述染色液中37℃恒温条件下保温过夜。
2、转入70％乙醇中脱色2－3次，去除叶绿素，至阴性对照材料呈白色时为止。
3、肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为Gus基因表达的位点。
4、83％、95％、100％乙醇中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
5、常规石蜡切片法切片，番红染色。
6、显微镜下观察、拍照。
五、说明1、要设立严格的阴性对照，即用同样的未转化的材料按相同的方法同时进行染色。
如阴性对照显示兰色，其原因可能是：A）材料和试剂被细菌感染；B）保温时间过长。
2、染色液中的甲醇可抑制细菌生长，长时间染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素，短时间染色也可以不加。
3、叶绿体含量高的材料染色后要进行脱色。
转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测
转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测一、实验目的1、掌握基因GUS的表达的检测方法2、了解GUS基因的应用二、实验原理GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。
β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。
由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。
根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。
组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。
将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。
因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。
三、实验材料、试剂拟南芥AK12-pro、GUS工作液四、实验步骤1、取2支1.5ml离心管，各加入0.3ml 1mol/L GUS染色液；2、用镊子夹取转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中；3、37℃浸泡过夜。
4、倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；肉眼下观察染色情况；拍照。
如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色。
五、实验结果从上述照片中科一看出，将野生型和转基因型拟南芥用含有底物的缓冲液浸泡，转β-葡糖醛酸酶基因将X-Gluc 水解生成蓝色产物，说明组织细胞被转入了GUS 基因，并表达出GUS ，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus 活性，图中拉瑟比较深，说明Gus 活性相对较高。
gus报告基因
gus报告基因GUS报告基因。
GUS报告基因是一种用于植物基因表达研究的重要工具。
它是由β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）基因构建而成，可以被广泛地应用于植物遗传转化和表达分析中。
GUS报告基因的研究对于理解植物基因表达及其调控机制具有重要意义。
首先，GUS报告基因可以用于植物遗传转化的研究。
通过将GUS报告基因导入植物细胞，可以观察到该基因在植物体内的表达情况。
这对于研究外源基因在植物中的表达特点以及转基因植物的遗传稳定性具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究，可以更好地了解植物转基因技术的应用前景及其潜在风险。
其次，GUS报告基因也可以用于植物基因表达分析。
通过将GUS报告基因与目标基因进行融合，可以观察到目标基因在植物体内的表达情况。
这对于研究目标基因在不同组织和发育阶段的表达模式，以及其受到外界环境因素影响的调控机制具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究，可以更好地了解植物基因表达调控的分子机制及其在植物生长发育过程中的作用。
此外，GUS报告基因还可以用于植物转基因技术的研究与应用。
通过对GUS报告基因的表达情况进行定量和定位分析，可以更好地评估转基因植物的表达效率和稳定性。
这对于改良转基因植物的遗传背景和表达性能具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究，可以更好地指导植物转基因技术的开发和应用，为农业生产和生物技术研究提供有力支持。
综上所述，GUS报告基因在植物基因表达研究中具有重要的应用价值。
通过对GUS报告基因的研究，可以更好地理解植物基因表达及其调控机制，促进植物遗传转化和基因功能研究的进展，为植物生物技术的发展和应用提供重要支持。
因此，对GUS报告基因的深入研究具有重要的理论和实际意义，值得进一步深入探讨和应用。
GUS染色液配制
GUS染色液配制2篇【文章一】GUS染色液配制原理及方法GUS染色液是一种用于检测植物细胞中β-葡萄糖苷酸酯酶（GUS）活性的染色液。
本篇将介绍GUS染色液配制的原理及方法。
一、原理GUS染色液配制的原理是基于GUS酶催化水合酶活性，使含有1-甲基-β-吡喃糖苷（X-Gluc）的染色底物在酶的作用下发生蓝色沉淀反应。
该底物被GUS酶水解后可产生自由的5,5’-二溴-4,4’-二氯-3’-靛酚（X）和5-溴-4-氯-3-（2,6-二甲基-4-氧代酰基苯氨基）苯甲醇（Gal）。
这两种产物在碱性条件下进行聚合反应，生成可见的蓝色沉淀。
二、方法1. 准备所需材料：pH 5.0缓冲液、10% Triton X-100、X-Gluc染色底物（20mg/ml），甲醇，硫酸铵，硼酸，氢氧化钠，孵育液。
2. 配制pH 5.0的缓冲液：取适量的硼酸和氢氧化钠，配制一定浓度的缓冲液，并将溶液调至pH值为5.0。
3. 配制10%的Triton X-100：取适量的Triton X-100，加入适量蒸馏水溶解，使其浓度为10%。
4. 配制X-Gluc染色底物溶液：取适量X-Gluc，加入适量甲醇溶解，制成浓度为20mg/ml的X-Gluc溶液。
5. 配制孵育液：将硫酸铵和甲醇按一定比例混合，制成适量的孵育液。
配制步骤：1. 取适量的pH 5.0缓冲液，加入10% Triton X-100，并充分混合。
2. 加入适量的X-Gluc染色底物溶液，再次充分混合。
3. 加入适量的甲醇和孵育液，并充分混合。
4. 将配制好的GUS染色液过滤，以去除杂质颗粒，得到高纯度的染色液。
5. 将GUS染色液储存于4℃的冰箱中，避光保存。
三、注意事项1. 在配制GUS染色液时，应注意避免阳光直射和长时间的暴露。
2. 染色底物X-Gluc是一种易燃物质，使用时应注意安全操作。
3. 配制过程中的工具和容器应干净无杂质，以防止污染。
4. 孵育液的制备要按照所需配比进行，过量或不足都会影响染色效果。
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也存在一些缺点：1）虽然非致死检测的研究取得了一些进展，但
这一检测对于活体组织仍然不太合适；2）由于酶和产物非常稳定， 因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；3）
在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象，
但是这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾 或者二者都加来使这种渗漏减至最少；4）同所有的组织化学方法
β -葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS） 组织化学染色检测转基因植物
实验目的
学习转GUS基因的植物组织化学染 色方法，掌握染色的原理。
实验原理
β -葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）基因是植物转基因中常用
的一个报告基因。GUS基因是从大肠杆菌中分离出来的，在 GUS基因附近插入启动子区就产生了转录融合基因或翻译融 合基因。在稳定转化的植物中，利用一个简单的组织化学检 测就可以精确地分析GUS融合基因的时空表达模式。用X-
5．70% 乙醇
实验步骤
1．将阴性对照材料和转GUS基因或带有可表达的GUS基 因的烟草叶片切成小块，浸入盛有 100 μ l 染色液的 0.5ml的离心管中。 2．抽真空后37℃温育4-16h。
3．叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性 材料呈白色。
4．肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为 GUS表达位点。
gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸）作为底物可以精确地进
行活体GUS活性的定位。这一反应分两步进行：首先是切割 葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧 基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。
用GUS进行这些实验有如下优点：1）大多数植物组织中GUS活
性的本底低；2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累； 3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然，
0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、1mmol/L EDTA
3．X-gluc母液：称取10mg X-gluc，溶于100μ l的N，N-二甲基甲酰胺
（DMF，C3H7NO），得到80㎎/ ml 的 X-gluc母液，-20℃保存。
4．X-gluc反应液：取6.5μ l X-gluc母液于500μ l buffer中
5．组织可在70%乙醇中保存数日。
一样，其检测结果不是定量的。
用于GUS染色的植物材料的制备方法因涉及的 特定组织和器官的不同而异。例如拟南芥的根、花
Байду номын сангаас
和叶片可以不做任何处理直接染色。但是像烟草和
马铃薯这些植物的茎和叶在染色前必须切成薄片。 有时特别是当操作大的组织样品时真空渗入法会有 所帮助。
实验材料和试剂
实验材料：转GUS基因的烟草叶片 试剂：
1．50mmol/l 磷酸钠缓冲液
A液：称NaH2PO4.2H2O 3.12g，定容100 ml 水中。 B液：称 Na2HPO4.12 H2O 7.17g，定容100 ml 水中。 取39 ml A液、61ml B液混匀
2．缓冲液：50mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、