目标序列捕获及平行测序在临床耳聋基因诊断中的应用

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耳聋基因检测的项目有哪些

耳聋基因检测的项目有哪些

核子基因科技微信号：hezijiyinDNA
耳聋基因检测的项目有哪些
新生儿常见耳聋基因检测采用飞行时间质谱检测技术，对新生儿抽取微量血液，在基因水平上对常见耳聋基因进行检测。
耳聋基因检测的项目有哪些
耳聋基因检测通过用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来检测离子，并测得样品的分子量，进而推知突变位点。
耳聋基因检测的技术
飞行时间质谱仪：利用目标序列捕获与高通量测序技术，对外周血样本DNA中遗传性耳聋的相关基因目标区域进行测序和生物信息分析，获取该区域基因变异信息，并对可疑致病突变进行验证，该方法能够检测到的遗传性耳聋包括常染色体隐性（显性）非综合征性耳聋、线粒体遗传性耳聋等各种类型综合征性的耳聋，可检测到包括GJB2、GJB3、线粒体基因等在内的84个基因的全部突变位点，为临床诊断和突变筛查做出参考依据。

中国人群ＭＹＯ１５Ａ_基因同义突变引起剪接异常导致的非综合征型耳聋分析

∗共同第一作者㊀㊀卢㊀宇，四川大学华西医院罕见病研究院临床遗传学部负责人㊂中华医学会医学遗传分会遗传咨询学组委员，中国生物物理学会听觉㊁语言和交流分会委员，ＣｌｉｎＧｅｎ耳聋基因突变解读专家组成员，美国耳鼻喉科学研究协会（ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈｉｎＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ＡＲＯ）会员，担任ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ㊁ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ等杂志审稿人㊂从事耳鼻咽喉头颈外科临床和研究工作近２０年，主要工作和研究专长包括耳科学㊁临床遗传咨询等㊂２０１３２０２０年全程参与设计和执行中国耳聋基因研究战略联盟（ＣｈｉｎｅｓｅＤｅａｆｎｅｓｓＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＣＤＧＣ）大型耳聋队列项目研究，带领数据分析解读团队为１万余例耳聋患者明确了致病基因㊂已参与发表中文核心期刊和ＳＣＩ论文６０余篇，曾获全国第十一次医学遗传学年会青年优秀论文奖㊂㊀㊀［摘要］㊀目的㊀对一个遗传性非综合征型耳聋家系的临床特征进行分析并鉴定其致聋基因突变，同时在大规模耳聋人群队列中对鉴定出的致病性突变致中国人群耳聋的特征进行分析㊂方法㊀完善家系成员的问卷调查㊁听力学检查㊁体格检査等临床检查，同时采集血液样本，通过耳聋相关基因的大规模平行测序（ＭＰＳ）和生物信息学分析进行致病基因鉴定㊂总结及分析鉴定出的致病性突变在中国耳聋基因研究战略联盟（ＣＤＧＣ）耳聋数据库中的检出情况㊂结果㊀在一个早发性极重度感音神经性耳聋家系中鉴定出ＭＹＯ１５Ａ基因ＮＭ＿０１６２３９４：ｃ．８１８２Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ａｒｇ２７２８Ｇｌｙ）／ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）复合杂合突变，为该家系耳聋患者的致聋原因㊂其中ＭＹＯ１５Ａ基因ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）同义突变通过改变剪接导致基因功能缺陷，其在中国广西壮族人群中次要等位基因频率为０２％（３／１４３８），在其他人群及公共数据库中均未检出㊂结论㊀研究确定了ＭＹＯ１５Ａ基因ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）在中国非综合征型耳聋患者中的致病性，该突变在中国广西壮族自治区富集明显㊂通过研究强调了在致病基因鉴定时，高频与同义突变并非过滤的绝对指标，尤其是在某些地区富集格外明显的突变，应格外注意㊂㊀㊀［关键词］㊀遗传性耳聋；㊀ＭＹＯ１５Ａ基因；㊀同义突变㊀㊀［中图分类号］㊀Ｒ７６４４３㊀［文献标识码］㊀Ａ㊀［文章编号］㊀１６７４－３８０６（２０２３）０５－０４２１－０６㊀㊀ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－３８０６．２０２３．０５．０１Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｏｎ⁃ｓｙｎｄｒｏｍｉｃｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓｃａｕｓｅｄｂｙｓｐｌｉｃｉｎｇａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｄｕｅｔｏａｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＭＹＯ１５ＡｇｅｎｅｉｎａＣｈｉｎｅｓｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ㊀ＷＡＮＧＳｉ⁃ｊｉ，ＧＵＯＹｉ⁃ｌｉａｎ，ＺＨＯＮＧＭｉｎｇ⁃ｊｕｎ，ｅｔａｌ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｔｏ⁃ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙＨｅａｄａｎｄＮｅｃｋＳｕｒｇｅｒｙ，ＷｅｓｔＣｈｉｎａＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ；ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲａｒｅＤｉｓｅａｓｅｓ，ＷｅｓｔＣｈｉｎａＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ㊀㊀［Ａｂｓｔｒａｃｔ］㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆａｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｎｏｎ⁃ｓｙｎｄｒｏｍｉｃｄｅａｆｎｅｓｓａｎｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｄｅａｆｎｅｓｓ⁃ｃａｕｓｉｎｇｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｄｅａｆｎｅｓｓｃａｕｓｅｄｂｙｏｎｅｏｆｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｉｎａｌａｒｇｅｓｃａｌｅｄｅａｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｃｏｈｏｒｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅｓｕｒｖｅｙ，ａｕｄｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｅｓｔａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｗｅｒｅｃｏｍｐｌｅｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｏｍｉｃｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｗｉｔｈｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳ）ａｎｄｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｃａｕｓａｔｉｖｅｇｅｎｅ．ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎＣｈｉｎｅｓｅＤｅａｆ⁃ｎｅｓｓＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＣＤＧＣ）ｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＴｈｅｃｏｍｐｏｕｎｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＭＹＯ１５ＡｇｅｎｅＮＭ＿０１６２３９４：ｃ．８１８２Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ａｒｇ２７２８Ｇｌｙ）／ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｔｈｅｃａｕｓｅｏｆｄｅａｆ⁃ｎｅｓｓｉｎｔｈｉｓｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｅａｒｌｙ⁃ｏｎｓｅｔｓｅｖｅｒｅｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒａｌｄｅａｆｎｅｓｓ，ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ＭＹＯ１５Ａｇｅｎｅｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｌｅｄｔｏｇｅｎｅｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙａｌｔｅｒｉｎｇｓｐｌｉｃｉｎｇ．Ｔｈｅｍｉｎｏｒａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗａｓ０２％（３／１４３８）ｉｎｔｈｅＺｈｕａｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｉｎＧｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ，ｂｕｔｗａｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｏｔｈｅｒｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｒｐｕｂｌｉｃｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＭＹＯ１５Ａｇｅｎｅｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）ｉｎｎｏｎ⁃ｓｙｎｄｒｏｍｉｃｄｅａｆｎｅｓｓｐａｔｉｅｎｔｓｉｎＣｈｉｎａｈａｓｂｅｅｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．ＴｈｉｓｍｕｔａｔｉｏｎｉｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｅｎｒｉｃｈｅｄｉｎＧｕａｎｇｘｉＺｈｕａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ，Ｃｈｉｎａ．Ｉｔｉｓｅｍｐｈａ⁃ｓｉｚｅｄｔｈａｔｈｉｇｈ⁃ｆｒｅｑｕｅｎｃｙａｎｄｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｓａｒｅｎｏｔａｂｓｏｌｕｔｅｉｎｄｉｃａｔｏｒｓｏｆｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｓｅａｓｅ⁃ｃａｕｓｉｎｇｇｅｎｅｓ，ａｎｄｅｘｔｒａｃａｒｅｓｈｏｕｌｄｂｅｔａｋｅｎｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｆｏｒｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｏｂｖｉｏｕｓｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｉｎｓｏｍｅｒｅｇｉｏｎｓ．㊀㊀［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］㊀Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｄｅａｆｎｅｓｓ；㊀ＭＹＯ１５Ａｇｅｎｅ；㊀Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎ㊀㊀耳聋是最常见的感觉系统缺陷疾病之一，受遗传㊁慢性感染㊁长期声暴露㊁耳毒性药物和衰老等多方面因素影响，其中遗传因素是早发性耳聋的主要致病原因，约占６０％［１⁃２］㊂据世界卫生组织报告，全世界有近５亿人需要听力康复，到２０５０年，将有超过７亿人，即十分之一人口发生听力损失㊂听力损失的预防㊁识别和康复为家庭和社会带来了沉重的经济和精神负担［３］㊂随着高通量ＤＮＡ测序技术在遗传性耳聋领域的不断发展和普及，大规模平行测序（ｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＭＰＳ）和全外显子组测序（ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＷＥＳ）使得４０％５０％的遗传性耳聋患者能够明确基因诊断，对于未找到遗传病因的部分患者在常染色体隐性遗传相关基因中有时仅能检测到单杂合致病性突变或者致病性无法确定的同义或错义突变［４］㊂同义突变以往常常被认为是无临床意义的核苷酸替换，尤其是人群频率较高的同义突变在突变过滤时通常会被过滤掉㊂ＭＹＯ１５Ａ基因是最常见的常染色体隐性非综合征型耳聋（ａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｎｏｎ⁃ｓｙｎｄｒｏｍｉｃｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ，ＡＲＮＳＨＬ）致病基因之一，迄今为止，该基因已鉴定出超过２００个突变与耳聋相关［５］㊂ＭＹＯ１５Ａ基因所编码的肌球蛋白ＸＶａ对维持耳蜗毛细胞内肌球蛋白组织结构及毛细胞静纤毛的长度至关重要，其功能的丧失主要导致先天性双侧重度或极重度感音神经性耳聋，部分位于Ｎ⁃端区域的突变可导致有残余听力的轻中度感音神经性耳聋［６⁃８］㊂本研究通过ＭＰＳ技术，在一个遗传性非综合征型耳聋家系中鉴定出ＭＹＯ１５Ａ：ＮＭ＿０１６２３９４：ｃ．８１８２Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ａｒｇ２７２８Ｇｌｙ）／ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）复合杂合突变㊂同时总结了在中国大型耳聋队列数据库中，ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）同义突变的基因型⁃表型特征以及在中国广西壮族人群中的等位基因频率㊂１㊀资料与方法１１㊀家系资料采集㊀该家系由华西医院罕见病研究院团队采集自广东省中山市，研究获医院伦理委员会批准［２０２１年审（１９０）号］，家系编号ＨＬ⁃００１６３１㊂参与研究的家系所有成员签署知情同意书㊂对家系成员进行问卷调查㊁听力学检查㊁体格检査等，并采集外周血５ｍｌ，提取ＤＮＡ，－８０ħ冻存待检㊂１２㊀高通量测序和数据分析１２１㊀测序及突变位点致病性分析㊀使用课题组自主研发的目标区域捕获试剂盒ＨＨＬ⁃７８５进行检测，该试剂盒覆盖目前已知耳聋致病基因及听觉相关的基因共计７８５个㊂目标区域涵盖了７８５个基因的外显子㊁外显子上下游５０ｂｐ及线粒体ＤＮＡ序列㊂以ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９为参考序列，测序下机原始序列数据应用ＢＷＡ软件进行比对和定位，以Ｐｉｃａｒｄ工具进行质控和去重操作，使用ＧＡＴＫ和ＶＥＰ工具进行突变识别和注释，次要等位基因频率（ｍｉｎｏｒａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ＭＡＦ）按＜０５％进行过滤，结合先证者及其家系成员的临床表型和遗传方式筛查候选突变，针对可疑突变位点检索遗传突变⁃临床表型相关数据库［ＣｌｉｎＶａｒ㊁ＤＶＤ㊁人类基因突变数据库（ＨＧＭＤ）］获取更详尽的位点致病信息㊂最后，参考美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会（ＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｉｃｓａｎｄｔｈｅＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＡＣＭＧ／ＡＭＰ）遗传突变分类标准与指南对突变位点进行致病性判读［９］㊂１２２㊀本研究同义突变在中国耳聋和对照人群检出情况㊀中国耳聋基因研究战略联盟（ＣｈｉｎｅｓｅＤｅａｆｎｅｓｓＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＣＤＧＣ）数据库是目前国内最大的耳聋专病队列和基因组数据库，已收集涵盖全国３１个省（自治区㊁直辖市）４１个民族的２００００余例耳聋病例，并有７０００余例听力正常的对照人群㊂总结该队列中ＭＹＯ１５Ａ：ＮＭ＿０１６２３９４：ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）鉴定为致病突变的耳聋患者的基因型⁃表型，并统计该位点在人群中的携带率㊂２㊀结果２１㊀ＨＬ⁃００１６３１家系资料及听力学特征分析结果ＨＬ⁃００１６３１家系遗传图谱（见图１ⓐ）符合常染色体隐性遗传模式，早发性耳聋患者４例，参与本研究的家系成员２例（Ⅱ⁃１㊁Ⅱ⁃３），其中先证者（Ⅱ⁃１）为６１岁中年男性，其二弟（Ⅱ⁃３）４７岁㊂２例患者均为非进展性语前聋，中山市中医院纯音测听提示双侧极重度感音神经性耳聋（见图１ⓑⓒ），其他系统未见明显异常，无长期噪声暴露史及耳毒性药物用药史㊂先证者母亲（Ⅰ⁃２）自述在７５岁左右出现进行性听力下降，检测时已８５岁，纯音测听表现为高频下降明显的重度⁃极重度听力损失，考虑为老年性聋可能（见图１ⓓ）㊂图１㊀ＨＬ⁃００１６３１家系图及纯音听阈图２２㊀致病基因鉴定结果㊀对病例Ⅱ⁃１和Ⅱ⁃３进行高通量测序分析，下机数据通过质控和去重后，使用ＧＡＴＫ和ＶＥＰ进行突变识别和注释㊂以ＭＡＦ值＜０５％进行突变位点过滤，同时过滤掉ＣｌｉｎＶａｒ数据库中良性和可能良性的突变㊂根据家系耳聋遗传模式㊁听力表型㊁ＶＥＰＩｍｐａｃｔ注释等条件对剩余位点进行筛查，同时在ＣｌｉｎＶａｒ㊁ＤＶＤ㊁ＨＧＭＤ等突变注释数据库中核查可疑候选基因突变㊂在已知耳聋基因ＭＹＯ１５Ａ中检出ＮＭ＿０１６２３９４：ｃ．８１８２Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ａｒｇ２７２８Ｇｌｙ）／ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）复合杂合突变（见图２），２个突变均为已报道的致病性突变㊂错义突变ｐ．Ａｒｇ２７２８Ｇｌｙ于２０１９年在中国台湾非综合征型耳聋家系中被首次鉴定［１０］㊂同义突变ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝首次报道于美国的１２个非综合征型耳聋家系，在２１例耳聋患者中检出该致病同义突变，其中有２０例为复合杂合突变，仅１例为纯合突变［１１］㊂ｇｎｏｍＡＤ数据库资料显示，该突变在德系犹太人人群中频率为０４％（４２／１０３６２），在东亚人群中频率为０（０／１９５３６）㊂㊀黑色代表患者中检出纯合突变，蓝色代表患者中检出复合杂合突变，紫色代表患者中既有纯合又有复合杂合突变，红色五星代表与轻⁃中度听觉表型相关突变图２㊀ＭＹＯ１５Ａ：ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）附近的截断突变位点（包括剪切位点㊁移码和无义突变）２３㊀ＭＹＯ１５Ａ：ＮＭ＿０１６２３９．４：ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）在ＣＤＧＣ数据库耳聋及人群队列中的致聋和携带情况㊀在ＣＤＧＣ耳聋队列数据库中，鉴定出ＭＹＯ１５Ａ：ＮＭ＿０１６２３９４：ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）为耳聋致病突变的患者共５例，均为复合杂合致病㊂耳聋发病及确诊在儿童时期，表现为重度⁃极重度感音神经性听力损失㊂２例患者民族不详，２例为壮族，１例为回族㊂见表１㊂在ＣＤＧＣ人群队列中，检出３例听力正常者携带此突变，均为广西壮族人，该致病突变位点在广西壮族人群中ＭＡＦ为０２％（３／１４３８）㊂表１㊀ＣＤＧＣ数据库中ＭＹＯ１５Ａｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ致耳聋患者的基因型⁃表型情况㊀样本编号染色体位置ｃＤＮＡ突变类型ｇｎｏｍＡＤ最大人群频率（％）耳聋发病年龄（岁）检测年龄（岁）耳聋程度民族ＨＬ⁃００１６３１１７：１８０６９７４８ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ同义突变０４０（学语前）６１极重度不详１７：１８０５８０２７ｃ．８１８２Ｃ＞Ｇ错义突变００２ＨＬ⁃００１６３１⁃２１７：１８０６９７４８ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ同义突变０４０（学语前）４７极重度不详１７：１８０５８０２７ｃ．８１８２Ｃ＞Ｇ错义突变００２ＨＬ⁃０００９６９１７：１８０６９７４８ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ同义突变０４０（学语前）５极重度回族１７：１８０６６６３６ｃ．９６９０＋１Ｇ＞Ａ剪切突变０００ＨＬ⁃００５２６６１７：１８０６９７４８ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ同义突变０４０２３重度壮族１７：１８０７０９７６ｃ．１００２１Ｃ＞Ｔ无义突变０００ＨＬ⁃００６２３６１７：１８０６９７４８ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ同义突变０４０（学语前）６极重度壮族１７：１８０３９１３９ｃ．４５９６＋１Ｇ＞Ａ剪切突变０００３㊀讨论３１㊀本研究通过一个中国遗传性非综合征型耳聋家系鉴定出ＭＹＯ１５Ａ基因的高频同义突变致病㊂该突变首次报道于２０２１年，为预防犹太遗传病委员会㊁费城儿童医院（ＣｈｉｌｄｒｅｎᶄｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＣＨＯＰ）㊁爱荷华大学耳鼻喉科及肾脏分子研究中心（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙａｎｄＲｅｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＯＲＬ）等５个国际前沿遗传和分子研究中心，通过多中心合作和数据共享成功鉴定为致病性突变［１１］㊂该研究最初在预防犹太遗传病委员会未明确遗传病因的德系犹太人耳聋家系中，部分家系均检出ＭＹＯ１５Ａ基因的１个致病或可能致病的单杂合突变，尚不能解释耳聋家系的致病原因㊂随着多中心数据的共享和研究的深入，发现先前在生物信息学分析中，误将ＭＹＯ１５Ａ的高频同义突变过滤掉，通过多中心数据整合㊁共分离分析和ｍｉｎｉｇｅｎｅ功能验证，证实了该同义突变的致病性㊂该同义突变在德系犹太人人群中频率高达０４％，高于ＡＣＭＧ／ＡＭＰ指南中支持良性突变的ＢＳ１阈值（０３％），且研究表明在该核苷酸水平上不具有进化保守性，故被误认为良性可能大㊂值得注意的是，ｇｎｏｍＡＤ数据库显示该位点在欧洲㊁东亚㊁南亚㊁拉丁美洲等多个地区的人群中频率为０，唯独在德系犹太人中频率较高㊂在ＣＤＧＣ数据库中，该突变在广西壮族人群中的携带率也较高，在听力正常者中检出３例携带者㊂３２㊀同义突变不会改变氨基酸序列，故大量同义突变是没有生物学意义的，尤其是人群频率较高的突变，往往会被当作良性突变而被过滤掉㊂然而，越来越多的研究表明事实并非如此，同义突变可通过多种机制引起疾病，包括影响剪切㊁ｍＲＮＡ结构和稳定性㊁翻译速率㊁蛋白构象和表达等过程［１２⁃１４］，在某些情况下，还存在多种机制共同作用诱导疾病表型的可能［１３］㊂其产生明显生物学改变的最常见的方式是干扰前体ｍＲＮＡ剪接，可通过影响剪切增强子或沉默子元件功能，或产生隐匿性供／受体，导致编码异常蛋白或产生不稳定的异常ｍＲＮＡ㊂有研究报道，剪切增强子或沉默子元件中的同义变体也可通过改变某些ｍＲＮＡ亚型的相对丰度致病，如额颞叶痴呆和家族性生长激素缺乏［１５⁃１７］㊂通过患者的新鲜组织或细胞进行逆转录ＰＣＲ可鉴定同义突变对剪切的影响，但临床样本的及时获取往往受诸多因素的影响，这也刺激了其他实验方法的发展，如ｍｉｎｉｇｅｎｅｓｐｌｉｃｉｎｇａｓｓａｙ㊂作为体内剪切试验验证的替代技术，在体内样本获取或基因表达量受限时，通过人为构建的ｍｉｎｉｇｅｎｅ重组质粒转染目的细胞，经逆转录ＰＣＲ产物测序可直观有效地验证ｍＲＮＡ的剪接形式，在诸多疾病研究领域中表现卓越［１８⁃１９］㊂３３㊀随着精准医疗时代的到来和推进，建立基因型⁃表型精细化图谱是遗传性疾病进行精准预测㊁诊断㊁评估和干预的核心㊂自１９９５年在印度尼西亚巴厘岛一村落的耳聋大家系中鉴定出ＭＹＯ１５Ａ所致的ＡＲＮＳＨＬ后，大量的研究表明该基因突变所致的耳聋表型为先天性双侧全频重度⁃极重度感音神经性聋［２０］㊂至２００７年，Ｎａｌ等［２１］首次报道了ＭＹＯ１５Ａ的Ｎ⁃末端突变可引起低频有残余听力的非重度耳聋表型㊂随着研究的深入，发现肌球蛋白ＸＶａ有２个蛋白亚型，亚型２相较亚型１缺少由２号外显子编码的Ｎ⁃末端区域㊂因此，这种耳聋表型的差异取决于蛋白亚型２是否正常㊂随后越来越多的研究证实这一论点，发生在Ｎ⁃末端区域的突变［如ＭＹＯ１５Ａ（ｐ．Ｔｙｒ２８９Ｘ）㊁（ｐ．Ｇｌｕ３９６Ａｒｇｆｓ∗３６）㊁（ｐ．Ｓｅｒ１１７６Ｖａｌｆｓ∗１４）［２２］等］仍拥有正常的亚型２，听力表型为低频区有残余听力的感音神经性聋㊂而非Ｎ⁃末端区域（如Ｍｏｔｏｒ㊁ＭｙＴＨ４１㊁ＦＥＲＭ１㊁ＳＨ３㊁ＭｙＴＨ４２㊁ＦＥＲＭ２及ＰＤＺ结构域）发生的突变导致蛋白亚型１和２均异常，听力表型多为先天性双侧重度⁃极重度感音神经性聋［２３］㊂本研究报道的ＭＹＯ１５Ａ：ＮＭ＿０１６２３９４：ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｇｌｙ３２８７＝）位于６１号外显子中段区域，编码ＦＥＲＭ２结构域㊂该突变在本研究中所致的耳聋表型为儿童时期的重度⁃极重度听力损失，Ｈｉｒｓｃｈ等［１１］在首次报道中总结，大部分患者经新生儿听力筛查，诊断为迟发性进展性耳聋，通过ｍｉｎｉｇｅｎｅ验证阐明其致病机制为该同义突变所致的整个６１号外显子跳跃，因此从本质上说它是一个剪切位点的突变㊂本研究还总结了ＦＥＲＭ２结构域附近的所有已报道的截断突变的基因型⁃表型情况，包括影响剪切突变１０个：ｃ．８９６８⁃１Ｇ＞Ｃ，ｃ．８９６８⁃１Ｇ＞Ｔ，ｃ．９０８３＋６Ｔ＞Ａ，ｃ．９２２９＋１Ｇ＞Ａ，ｃ．９２２９＋２Ｔ＞Ｃ，ｃ．９５１８⁃２Ａ＞Ｇ，ｃ．９６１１＿９６１２＋８ｄｅｌ，ｃ．９６９０＋１Ｇ＞Ａ，ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ，ｃ．９９４８Ｇ＞Ａ；移码突变４个：ｃ．９３１６ｄｕｐ，ｃ．９９５８＿９９６１ｄｅｌ，ｃ．９９９５＿１０００２ｄｕｐ，ｃ．１０５７３ｄｅｌ；无义突变４个：ｃ．９３１９Ｇ＞Ｔ，ｃ．９５１４Ｃ＞Ｔ，ｃ．９７９０Ｃ＞Ｔ，ｃ．１０４７４Ｃ＞Ｔ㊂其中以纯合突变致病为主，大部分致病位点均表现为双侧重度⁃极重度语前聋，仅２个位点表现为非重度进展性耳聋（ｃ．９７９０Ｃ＞Ｔ，ｃ．９８６１Ｃ＞Ｔ），它们分别为无义突变和影响剪切的同义突变，且均有复合杂合的致病报道㊂另外，２０１４年在巴基斯坦一ＡＲＮＳＨＬ家系中，通过ｍｉｎｉｇｅｎｅ验证后鉴定出位于６１号外显子最后一个氨基酸的同义突变ＭＹＯ１５ＡＮＭ＿０１６２３９４：ｃ．９９４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇｌｎ３３１６＝）［２４］，同样也会导致６１号外显子的跳跃，其耳聋表型为先天性重度⁃极重度耳聋㊂因此相同突变致聋的患者仍可表现为不同表型，可能为种族间不同遗传背景的基因修饰作用，也不排除与其复合杂合的另一位点功能丧失效应不同所致，可通过全基因组测序（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＷＧＳ）㊁转录组测序（ＲＮＡ⁃ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＲＮＡ⁃Ｓｅｑ）及细胞和动物实验进一步探究㊂综上，本研究确定了ＭＹＯ１５Ａ基因的一个同义突变在中国人群的致病性，可导致早发的重度⁃极重度耳聋㊂该位点在中国广西壮族及德系犹太人人群中携带率相对较高㊂对于这种在某些地区富集较明显的位点，过滤分析时应格外注意，高频与同义突变并非过滤的绝对指标㊂参考文献［１］ＡｂｏｕＴａｙｏｕｎＡＮ，ＡｌＴｕｒｋｉＳＨ，ＯｚａＡＭ，ｅｔａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓｇｅｎｅｔｅｓｔｉｎｇ：ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗｏｆｇｅｎｅｅｖｉｄｅｎｃｅｔｏｗａｒｄｍｏｒｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｎｅｘｔ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ⁃ｂａｓｅｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｔｅｓｔｉｎｇａｎｄｉｎｔｅｒ⁃ｐｒｅｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＧｅｎｅｔＭｅｄ，２０１６，１８（６）：５４５－５５３．［２］ＫｈａｌｉｌＡ，ＫａｒｒｏｕｍＳＢ，ＢａｒａｋｅＲ，ｅｔａｌ．Ｐｏｓｔ⁃ｌｉｎｇｕａｌｎｏｎ⁃ｓｙｎｄｒｏｍｉｃｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ａｐｏｌｙｇｅｎｉｃｃａｓｅｗｉｔｈ２ｂｉａｌｌｅｌｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＭＹＯ１５ＡａｎｄＭＩＴＦ［Ｊ］．ＢＭＣＭｅｄＧｅｎｅｔ，２０２０，２１（１）：１．［３］ＢｒｏｗｎＣＳ，ＥｍｍｅｔｔＳＤ，ＲｏｂｌｅｒＳＫ，ｅｔａｌ．Ｇｌｏｂａｌｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓｐｒｅ⁃ｖｅｎｔｉｏｎ［Ｊ］．ＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌＣｌｉｎＮｏｒｔｈＡｍ，２０１８，５１（３）：５７５－５９２．［４］Ｓｌｏａｎ⁃ＨｅｇｇｅｎＣＭ，ＢｉｅｒｅｒＡＯ，ＳｈｅａｒｅｒＡＥ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃｔｅｓｔｉｎｇｉｎｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ１１１９ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ［Ｊ］．ＨｕｍＧｅｎｅｔ，２０１６，１３５（４）：４４１－４５０．［５］ＡｚａｉｅｚＨ，ＢｏｏｔｈＫＴ，ＥｐｈｒａｉｍＳＳ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｌａｎｄｓｃａｐｅａｎｄｍｕｔａ⁃ｔｉｏｎａｌｓｉｇｎａｔｕｒｅｓｏｆｄｅａｆｎｅｓｓ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ，２０１８，１０３（４）：４８４－４９７．［６］ＢａｓｈｉｒＲ，ＦａｔｉｍａＡ，ＮａｚＳ．ＰｒｉｏｒｉｔｉｚｅｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｅｘｏｎｏｆＭＹＯ１５ＡｒｅｖｅａｌｓａｎｅｗｍｕｔａｔｉｏｎｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇｉｎａＰａｋｉｓｔａｎｉｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｍｏｄｅｒａｔｅｔｏｓｅｖｅｒｅｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ［Ｊ］．ＥｕｒＪＭｅｄＧｅｎｅｔ，２０１２，５５（２）：９９－１０２．［７］ＣｈａｎｇＭＹ，ＫｉｍＡＲ，ＫｉｍＮＫ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｐｌｉ⁃ｃａｔｉｏｎｓｏｆｎｏｖｅｌＭＹＯ１５Ａｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎａｎｏｎ⁃ｃｏｎｓａｎｇｕｉｎｅｏｕｓＫｏｒｅａｎｆａｍｉｌｙｂｙｔａｒｇｅｔｅｄｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌｓ，２０１５，３８（９）：７８１－７８８．［８］ＣｈａｎｇＭＹ，ＬｅｅＣ，ＨａｎＪＨ，ｅｔａｌ．ＥｘｐａｎｓｉｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＭＹＯ１５Ａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｖａｒｉａｎｔｓｔｏｉｎｃｌｕｄｅｐｏｓｔｌｉｎｇｕａｌｏｎｓｅｔｏｆｐｒｏ⁃ｇｒｅｓｓｉｖｅｐａｒｔｉａｌｄｅａｆｎｅｓｓ［Ｊ］．ＢＭＣＭｅｄＧｅｎｅｔ，２０１８，１９（１）：２９．［９］ＯｚａＡＭ，ＤｉＳｔｅｆａｎｏＭＴ，ＨｅｍｐｈｉｌｌＳＥ，ｅｔａｌ．ＥｘｐｅｒｔｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡＣＭＧ／ＡＭＰｖａｒｉａｎｔｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ［Ｊ］．ＨｕｍＭｕｔａｔ，２０１８，３９（１１）：１５９３－１６１３．［１０］ＷｕＣＣ，ＴｓａｉＣＹ，ＬｉｎＹＨ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｔｉｃｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｈｅａｒｉｎｇｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｉｎｔｈｅＴａｉｗａｎｅｓｅｐｏｐｕｌａ⁃ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ），２０１９，１０（１０）：７７２．［１１］ＨｉｒｓｃｈＹ，ＴａｎｇｓｈｅｗｉｎｓｉｒｉｋｕｌＣ，ＢｏｏｔｈＫＴ，ｅｔａｌ．ＡｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｖａｒｉａｎｔｉｎＭＹＯ１５ＡｅｎｒｉｃｈｅｄｉｎｔｈｅＡｓｈｋｅｎａｚｉＪｅｗｉｓｈｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｃａｕｓｅｓａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓｄｕｅｔｏａｂｎｏｒｍａｌｓｐｌｉｃｉｎｇ［Ｊ］．ＥｕｒＪＨｕｍＧｅｎｅｔ，２０２１，２９（６）：９８８－９９７．［１２］ＢａｌｉＶ，ＢｅｂｏｋＺ．Ｄｅｃｏｄｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｂｙｗｈｉｃｈｓｉｌｅｎｔｃｏｄｏｎｃｈａｎ⁃ｇｅｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＩｎｔＪＢｉｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０１５，６４：５８－７４．［１３］ＫａｔｎｅｎｉＵＫ，ＬｉｓｓＡ，ＨｏｌｃｏｍｂＤ，ｅｔａｌ．Ｓｐｌｉｃｉｎｇｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｃｏｎ⁃ｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｓｅｖｅｒａｌＦ９ｅｘｏｎｉｃｐｏｉｎｔｖａｒｉａｎｔｓ［Ｊ］．ＭｏｌＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃＭｅｄ，２０１９，７（８）：ｅ８４０．［１４］ＫｉｒｃｈｎｅｒＳ，ＣａｉＺ，ＲａｕｓｃｈｅｒＲ，ｅｔａｌ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｆｕｎｃ⁃ｔｉｏｎｂｙａｓｉｌｅｎｔｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｌｉｎｋｅｄｔｏｔＲＮＡａｂｕｎｄａｎｃｅ［Ｊ］．ＰＬｏＳＢｉｏｌ，２０１７，１５（５）：ｅ２０００７７９．［１５］Ｇａｗｅｄａ⁃ＷａｌｅｒｙｃｈＫ，ＭｏｈａｇｈｅｇｈｉＦ，ＺｅｋａｎｏｗｓｋｉＣ，ｅｔａｌ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎᶄｓｄｉｓｅａｓｅ⁃ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｖａｒｉａｎｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｐｒｅ⁃ｍＲＮＡｓｐｌｉｃｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓ［Ｊ］．ＮｅｕｒｏｂｉｏｌＡｇｉｎｇ，２０１６，４７：１２７－１３８．［１６］ＨｕｎｔＲＣ，ＳｉｍｈａｄｒｉＶＬ，ＩａｎｄｏｌｉＭ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｏｓｉｎｇｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｍｕｔａ⁃ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，２０１４，３０（７）：３０８－３２１．［１７］ＳｈｅｎＸ，ＳｏｎｇＳ，ＬｉＣ，ｅｔａｌ．Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｒｅｐｒｅｓｅｎｔａ⁃ｔｉｖｅｙｅａｓｔｇｅｎｅｓａｒｅｍｏｓｔｌｙｓｔｒｏｎｇｌｙｎｏｎ⁃ｎｅｕｔｒａｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０２２，６０６（７９１５）：７２５－７３１．［１８］ＧａｉｌｄｒａｔＰ，ＫｉｌｌｉａｎＡ，ＭａｒｔｉｎｓＡ，ｅｔａｌ．Ｕｓｅｏｆｓｐｌｉｃｉｎｇｒｅｐｏｒｔｅｒｍｉｎｉ⁃ｇｅｎｅａｓｓａｙｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｎｓｐｌｉｃｉｎｇｏｆｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｎｔｓ［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，２０１０，６５３：２４９－２５７．［１９］ＳａｒｋａｒＡ，ＰａｎａｔｉＫ，ＮａｒａｌａＶＲ．Ｃｏｄｅｉｎｓｉｄｅｔｈｅｃｏｄｏｎ：ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｐｌｉｃｉｎｇｍａｃｈｉｎｅｒｙａｎｄｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＭｕｔａｔＲｅｓＲｅｖＭｕｔａｔＲｅｓ，２０２２，７９０：１０８４４４．［２０］ＲｅｈｍａｎＡＵ，ＢｉｒｄＪＥ，ＦａｒｉｄｉＲ，ｅｔａｌ．ＭｕｔａｔｉｏｎａｌｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＭＹＯ１５ＡａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＤＦＮＢ３ｈｕｍａｎｄｅａｆｎｅｓｓ［Ｊ］．ＨｕｍＭｕｔａｔ，２０１６，３７（１０）：９９１－１００３．［２１］ＮａｌＮ，ＡｈｍｅｄＺＭ，ＥｒｋａｌＥ，ｅｔａｌ．ＭｕｔａｔｉｏｎａｌｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＭＹＯ１５Ａ：ｔｈｅｌａｒｇｅＮ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｆｍｙｏｓｉｎＸＶＡｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｈｅａｒｉｎｇ［Ｊ］．ＨｕｍＭｕｔａｔ，２００７，２８（１０）：１０１４－１０１９．［２２］ＬｉＷ，ＧｕｏＬ，ＬｉＹ，ｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｔｒｕｎｃａｔｉｎｇｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＭＹＯ１５Ａｃａｕｓｉｎｇｐｒｅｌｉｎｇｕａｌｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒａｌｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＰｅｄｉａｔｒＯｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ，２０１６，８１：９２－９５．［２３］ＺｈａｎｇＪ，ＧｕａｎＪ，ＷａｎｇＨ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｔｙｐｅ⁃ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＭＹＯ１５Ａｖａｒｉａｎｔｓｉｎａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｎｏｎ⁃ｓｙｎｄｒｏｍｉｃｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ［Ｊ］．ＢＭＣＭｅｄＧｅｎｅｔ，２０１９，２０（１）：６０．［２４］ＳｈａｆｉｑｕｅＳ，ＳｉｄｄｉｑｉＳ，ＳｃｈｒａｄｅｒｓＭ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆａｕｔｏ⁃ｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｎｏｎ⁃ｓｙｎｄｒｏｍｉｃｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓｉｎＰａｋｉｓｔａｎｉｆａｍｉｌｉｅｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１４，９（６）：ｅ１００１４６．［收稿日期㊀２０２３－０５－１１］［本文编辑㊀吕文娟㊀余㊀军］本文引用格式王思霁，郭亿莲，钟鸣骏，等．中国人群ＭＹＯ１５Ａ基因同义突变引起剪接异常导致的非综合征型耳聋分析［Ｊ］．中国临床新医学，２０２３，１６（５）：４２１－４２６．。

ctDNA检测技术

ctDNA检测技术循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA）来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，是循环游离DNA（circulating cell—free DNA,cfDNA）的一部分［1]。

ctDNA含有与其来源肿瘤DNA同样的基因缺陷，如点突变，重排,扩增等[2］；其在血液中的半衰期短，可实时反映肿瘤的动态变化［3];作为液体活检的一种，可克服组织活检中由于肿瘤异质性带来的缺陷，检测更全面[4]，因此ctDNA的检测可用于癌症早期诊断与癌症分期、肿瘤的疗效评估、复发监测和预后判断等［5]。

由ctDNA的质量和数量变化大，因此需要高特异性和高灵敏度的检测方法。

目前常用的方法有数字PCR （digital PCR, dPCR)、BEAMing （bead, emulsion，amplification and magnetic）、高通量测序(next generation sequencing, NGS）、ARMS等［6］.1。

数字PCR1999年V ogelstein等提出了数字PCR（digtal PCR，dPCR)的概念［7］。

数字PCR 包括两部分，即PCR 扩增和荧光信号分析。

先将是样品稀释后分配到大量微小的反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，然后分别对目标分子进行扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。

数字PCR 采用直接计数的方法进行定量分析，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，记为1,无荧光信号的则即为0，理论上，在样品中极限稀释的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA 分子的拷贝数。

但是有的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，这时需要用泊松概率分布公式进行计算[8］.不同于传统的qPCR技术,数字PCR 不受扩增曲线的循环阈值（C T）和扩增效率的影响，无需参照,准确性和重复性好，可实现绝对定量分析［9]。

耳聋基因检测方法及原理

耳聋基因检测是通过分析个体的基因组来确定与耳聋相关的遗传变异。

以下是常见的耳聋基因检测方法及其原理：
1. Sanger测序：Sanger测序是一种传统、经典的基因测序方法。

它通过将待测样本DNA片段进行扩增，然后使用DNA 聚合酶和剪切酶对扩增产物进行测序。

通过比对测序结果与参考基因组，可以鉴定个体是否携带与耳聋相关的突变。

2. 基于芯片的检测方法：这种方法使用特制的芯片或芯片阵列来同时检测多个耳聋相关基因的突变。

芯片上包含了预先设计好的探针，这些探针可以与特定的基因片段结合。

检测过程中，待测样本DNA片段与芯片上的探针发生杂交反应，通过芯片上的信号检测技术，可以确定样本中的突变情况。

3. 下一代测序（NGS）：NGS是一种高通量、高效的基因测序技术。

它通过同时测序多个DNA分子，可以快速、准确地确定个体的基因组序列。

对于耳聋基因检测，NGS可以检测多个耳聋相关基因的突变，捕捉并分析大量的遗传变异，提供更全面的基因信息。

4. RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是一种能够检测基因表达水平的方法。

在耳聋基因研究中，RT-PCR可用来
检测耳聋相关基因在耳部组织中的表达水平，以确定是否存在异常表达。

这些方法在耳聋基因检测中发挥了重要作用。

通过对个体的基因进行检测和分析，可以帮助识别与耳聋相关的遗传突变，为早期干预和治疗提供依据，并为家族遗传咨询和基因筛查提供重要参考。

需要注意的是，耳聋是一个复杂的遗传疾病，除了单基因突变外，还可能受到环境和多基因相互作用的影响，因此仅通过基因检测无法完全解释耳聋的发生机制。

基因测序技术在生物医药中的应用与前景

基因测序技术在生物医药中的应用与前景基因测序技术是一种近年来快速发展的技术手段，它以生物分子的基本单位DNA为对象，通过测序的方法获得序列信息，为生物医药领域提供了全新的研究手段和思路。

基因测序技术可应用于基因功能研究、疾病诊断、药物研发等多个方面，下面我们将详细介绍它在这些方面的应用与前景。

基因功能研究基因测序技术的一个重要应用领域就是基因功能研究。

目前，全基因组测序技术已经可以在较短的时间内获得过百万基对的DNA序列，这极大地促进了对人类基因结构和功能的认识。

通过基因测序技术，科学家可以获得人类染色体上的所有基因序列，并继续深入了解这些基因在不同情况下的活动方式和控制机制，这对于人类基因研究领域的深入发展具有重要作用。

疾病诊断基因测序技术还能够被用于疾病的诊断和治疗。

基因测序技术可以通过检测DNA序列中的缺陷或突变，来帮助医生诊断某些先天性疾病，如唐氏综合征、囊性纤维化等等。

基因测序技术还能够检测人体基因的突变状态，借此检测结果，医生能够更好地了解患者的基因背景，以更好地进行治疗决策。

药物研发在药物研发方面，基因测序技术也起到了重要作用。

通常，药物需要作用于特定的蛋白，其活性对应于某一个基因的表达情况。

基因测序技术可以帮助科学家更精确地了解有多少人在此基因上表达异常，并进而提供这些人的个体化药物研发方案。

个性化的基因信息也可用于验证药物的治疗效果，以及寻找针对某一种基因的特定疾病的药物靶点。

未来发展随着技术的快速发展，基因测序技术未来可带来更多可能性。

例如，我们可以开发更快速、更经济有效的测序技术，使得大规模地全基因组测序能够更广泛地应用于医学研究和临床诊断。

此外，随着人工智能技术的发展，可以通过对基因数据进行分析来逐渐形成个人化诊断与个体化治疗，甚至对于一些疾病可以先行治疗，实现早期预防，进而实现治愈。

总之，基因测序技术的应用前景十分广泛。

它不仅为科学家开拓了人类基因的新境界，也为医学领域提供了更加先进、更加精确的研究手段，推动了人类社会向着更加健康、更加美好的未来迈进。

基因测序技术在精准医学中的应用

基因测序技术在精准医学中的应用随着科学技术的不断发展，生命科学领域的基因测序技术也在不断地更新换代。

现在，基因测序技术已经成为了当今医学领域的一个重要工具，并成功地应用于了精准医学中。

在精准医学中，基因测序技术起到了至关重要的作用，可以对一些病因难以明确的疾病进行更加精细、个性化的诊断和治疗。

一、基因测序技术的基本原理及应用基因测序技术是指通过对某一个生物个体的DNA序列进行测定，以了解其在基因组中的位置、类型、结构等信息。

这一技术的应用非常广泛，除了可以应用于疾病基因的筛选、药物研发、基因人工合成、生态保育、食品安全等领域之外，它还可以被用于精准医学的研究和应用中。

精准医学是指基于个体的病因学、生物学、医学等信息，在预防、诊断、治疗等方面实现更加精准的医疗模式。

基因测序技术的应用在精准医学中可以帮助医生更好地了解患者的基因信息，从而对疾病的诊断、治疗进行更加精细、准确的选择。

在实际应用中，基因测序技术通常包括基因组测序、转录组测序、表观组学测序等不同方面。

二、基因测序技术在癌症治疗中的应用癌症是当前全球最普遍的疾病之一，而且越来越多的人面临着癌症的风险。

基因测序技术在癌症治疗中作为一种精准医学的手段，得到了广泛的应用。

通过基因测序技术可以更好地诊断和治疗癌症，也可以帮助预测病变存在的风险。

例如，基因测序技术可以用于识别癌症的驱动基因和靶向蛋白，从而精准地选择治疗方案。

此外，基因测序技术还可以帮助医生了解患者的个体化药物代谢情况，进而提高药物疗效和减少不良反应。

三、基因测序技术在遗传病治疗中的应用遗传病是由于基因突变引起的疾病，通常是由于一位或多位基因的异常导致的。

这些基因的异常在很多情况下会遗传给后代，并引起一系列的身体问题。

基因测序技术可以对一些遗传病进行基因检测，进而帮助医生了解患者的基因突变情况，从而更好地诊断和治疗。

基因测序技术还可以利用基因编辑技术进行基因改良，以纠正突变的基因，并达到治疗目的。

临床应用中的基因测序技术的应用

临床应用中的基因测序技术的应用基因测序技术已在临床应用中扮演着重要的角色。

通过快速、准确地分析个体的基因组信息，基因测序技术为医学诊断、个体化治疗和疾病预防提供了新的手段。

本文将探讨基因测序技术在临床应用中的应用，并分析其对医学领域的影响。

一、个体化医学与基因测序技术在传统医学模式下，往往采用一种标准化的治疗方案，没有针对个体差异进行精细化调整。

而基因测序技术的出现，使得个体化医学成为现实。

通过对个体基因组的测序和分析，医生可以了解患者的基因变异情况，从而根据患者的个体差异制定更合理的治疗方案。

例如，在肿瘤治疗中，基因测序技术可以帮助确定患者的突变基因，从而选择对这些基因突变敏感的药物进行治疗，提高治疗效果。

二、疾病风险评估与基因测序技术基因测序技术可以帮助评估个体某些疾病的患病风险。

通过分析患者基因组中与特定疾病相关的变异位点，可以预测个体是否存在遗传性疾病的风险。

例如，通过测序BRCA1和BRCA2基因，可以预测患者是否患有乳腺癌和卵巢癌的遗传风险。

这种风险评估可以帮助医生和患者制定个性化的预防和监测计划，提前采取措施降低患病风险。

三、药物反应与基因测序技术个体对药物的反应存在很大的差异，有些人对某些药物具有良好的疗效，而有些人则出现严重的不良反应。

基因测序技术可以帮助医生预测患者对某些药物的反应情况。

通过分析与药物代谢和作用机制相关的基因位点，医生可以确定患者是否存在药物代谢异常，从而调整药物的剂量或者选择其他更合适的药物，提高药物疗效，减少不良反应。

四、基因测序技术的挑战与未来发展尽管基因测序技术在临床应用中取得了很大的进展，但仍面临一些挑战。

首先，基因测序的成本较高，限制了其在大规模应用中的推广。

其次，基因测序结果的解读和应用也需要专业的临床知识和经验，对医生的要求较高。

此外，基因测序技术还面临隐私保护和伦理审查等问题。

然而，随着技术的不断进步和成本的降低，基因测序技术在临床应用中的前景仍然广阔。

基因测序技术在医学领域中的应用案例分析

基因测序技术在医学领域中的应用案例分析作为生物医学领域的重要工具，基因测序技术已经在医学研究和临床实践中发挥了重要作用。

通过测序技术，科学家们可以对个体的基因组进行全面、快速的检测和分析，这有助于我们深入了解基因与疾病之间的关系，从而实现个性化医疗和精准治疗。

本文将分析几个基因测序技术在医学领域中的应用案例，以展示它们的巨大潜力。

首先，基因测序技术在癌症研究与治疗中起到了至关重要的作用。

通过对癌细胞样本的基因组进行测序，科学家们可以鉴定出驱动癌症发生和发展的突变基因，从而为癌症的早期诊断和个性化治疗提供依据。

例如，美国国立卫生研究院（NIH）的一个研究团队使用基因测序技术解析了肺癌患者的基因组，发现其中一种突变与一种药物的有效治疗相关。

这项研究为癌症患者提供了个性化治疗的可能性，有望提高治疗效果和生存率。

此外，基因测序技术也在罕见疾病的诊断中起到了重要作用。

许多罕见疾病是由基因突变引起的，而传统的诊断方法常常无法准确识别这些突变。

通过基因测序技术，医生们可以快速地鉴定出疾病相关的突变基因，从而提高罕见疾病的早期诊断和治疗效果。

以近年来频繁出现的克隆细胞疾病为例，这些疾病由于突变导致细胞克隆扩张，给患者带来了严重的健康问题。

通过基因测序技术，科学家们可以检测和追踪克隆细胞的突变，进一步理解疾病的病因和进展，并探索潜在的治疗方法。

基因测序技术也带来了遗传病的筛查和预测的突破。

许多遗传病是由基因突变引起的，通过测序技术，我们可以准确识别携带这些突变的个体。

例如，随着人们对染色体异常的更深入理解，基因测序技术已经被广泛应用于胎儿遗传性疾病的诊断和筛查。

通过对胎儿DNA进行全基因组测序，医生们可以及早发现胎儿患有的遗传疾病，为家庭提供选择性的产前咨询和治疗方案，从而减少患儿的痛苦和家庭的负担。

除了个性化医疗和遗传病筛查，基因测序技术还为药物研发提供了新的途径。

通过了解药物与基因之间的相互作用，科学家们可以更好地预测和优化药物的疗效和毒副反应。

第一代测序技术

序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序（DNA
nanoball sequencing）等。

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation

上述方法有一个共同点，那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增
产物都是在空间上聚集的：原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中在平板的某处，在微乳液PCR法（emulsion PCR）中所有的
产物都集中在微珠的表面。真正的测序反应本身和传统测序法一样，
是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成（图6）。本文讨论的所有测序仪都是使用合成测序法（sequencing by
sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得
对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。
实验过程

1.样本准备（sampon) 3.测序反应(sequencing reaction) 4.数据分析(data analysis)

微电极检测PH值的改变，转换成相应的碱基信号，最后得到DNA序列
Roche 454 的测序原理

鸟枪法建库基于油包水PCR的微珠模板扩增微珠加上测序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微传感器的测序芯片在测序芯片表面，分次分别流过４种dNTP，微珠表面的核酸进行边合成边测序的反应。每次发生聚合反应，释放出焦磷酸焦磷酸被焦磷酸酶水解，释放出光子光通过光纤被传递到光探头光信号被转换成碱基信息，得到DNA序列。

单基因遗传病分子诊断的新策略和新方法

《中国产前诊断杂志（电子版）》　２０１６年第８卷第３期·专家笔谈· 单基因遗传病分子诊断的新策略和新方法王蕾　贺静　朱宝生（云南省第一人民医院遗传诊断中心、云南省出生缺陷与遗传病重点实验室，云南昆明　６５００３２）【摘要】　单基因遗传病具有复杂的表型异质性及遗传异质性，基因突变可涉及点突变、片段缺失／重复、整个基因的缺失／重复、以及动态突变等众多类别。

分子诊断技术使得单基因遗传病可在分子水平乃至单个碱基发生变异的情况下做出准确诊断，然而其可靠性问题成为备受瞩目的技术难点。

针对不同遗传病使用不同的解决方案，是目前单基因遗传病分子诊断的主流思想。

基因诊断相关人员不仅要了解遗传疾病致病基因及其突变特点，还要熟知各种检测技术的特点，合理选择。

【关键词】　单基因遗传病；分子诊断；杂交；扩增；测序【中图分类号】　Ｒ７１４．５５【文献标识码】　Ａ犱狅犻：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐｄ．２０１６．０３．００２基金项目：国家自然科学基金（８１２６０４１５）、云南省卫生领军人才项目（Ｌ２０１２０１）通信作者：朱宝生，Ｅｍａｉｌ：ｂｓｚｈｕ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ单基因遗传病（ｍｏｎｏｇｅｎｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）是由位于同源染色体上的一对等位基因之一或者二者发生突变，导致蛋白结构信息错误或基因表达控制异常而出现的身体结构发育异常和／或生理功能异常，该类疾病一般符合孟德尔遗传方式，所以，又称为孟德尔遗传病（ｍｅｎｄｅｌｉａｎｉｎｈｅｒｉｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ）［１］。

大多数单基因遗传病是罕见病，其中每一种在全球人口中的平均发生率在１／１００００～１／１０００００［２］，多则在数千个新生儿中出现一例，少则数十万新生儿中出现一例；但对局部地区或者来自某些地区的特定人群而言，某些单基因遗传病的平均发生率可能高达１％～２％，如在东南亚和云南南部的某些少数民族中，地中海贫血和葡萄糖６磷酸脱氢酶缺乏症的发生率就高达２％以上［３］。

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Ｓｙ ‘ ＴＡＮＧＷｅ７ＧＡ０Ｘｕｅ＾，ＷＡＮＧＧｔｍｉｉａｎ。．ＨＵＡＮＧＳｈａｓｈａ
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ｐａｒａｌｌｅｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＭＰＳ）技术，对遗传性耳聋患者进行分子病因学研究，探索低成本、多基因、多样本的耳聋基因检测在临床应用的可行性。方法利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ￣Ｊ序平台对来自解放军总医院聋病分子诊断中心８８例（来自６１个家系）具有明确家族史且常见耳聋基因检测阴性的耳聋患者，以及８例阳性对照患者进行４２种基因的目标序列捕获、Ｂａｒｃｏｄｅ和ＭＰＳ，并对测序结果进行生物信息学分析。结果利用上述方法在８８个个体中大于一人人组家系中发现了１０个家系８个基因（ＴＥＣＴＡ、ＤＦＮＡ５、ＣＤＨ２３、ＵＳＨＩＣ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＥＹＡ４）１４个位点的致病性突变。准确验证了８个阳性对照。大于一人人组家系的致病基因检出率明显高于单人人组家系。结论高通量测序的发展为遗传性耳聋的诊断带来了巨大的机遇。目标序列捕获、Ｂａｒｃｏｄｅ、ＭＰＳ的结合进一步提高了测序的准确性、降低了测序成本，同时生物信息学的进步，将促进低成本、多基因、多样本的临床耳聋基因检测成为可能。
ＫＡＮＧＤｏｎｇｙａｎｇＬＩＮＸｉ．ＤＡＩＰｕ
ＪＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ＨｅａｄａｎｄＮｅｃｋＳｕｒｇｅｒｙ，ＰＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ，１００８５３２ＤｅｐａｒｔｅｎｍｔｆＯｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ＨａｉｎａｎＢｒａｎｃｈｏｆＰＬＡｅｎＧｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓａｎｙａ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ，５７２０１３３ＤｅｐａｒｔｅｎｍｔｆＯｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ＥｍｏｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｆＭｅｏｄｉｃｉｎｅ，Ａｔｌａｎｔａ，ｅｏＧｒｇｉａ４ＤｅｐａｒｔｅｎｍｔｆＯｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｉｌｆｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｆＰｏＬＡｅｎＧｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ，１０００４８５ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｒｔｉｌｌｅｒｙｅｎＧｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅ￣ｉｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ．１０００８８
【关键词】遗传性耳聋；目标序列捕获；生物编码；平行测序；生物信息学【中图分类号】Ｒ７６４．０４；Ｒ７６４．４３【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７２ — ２９２２（２０１４）０１ — ０５
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｔｏｌｏｇｙＶｏ１．１２，Ｎｏ．１，２０１４
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耳聋基因诊断专辑
目标序列捕获及平行测序在临床耳聋基因诊断中的应用
苏钰汤文学代志瑶高雪王国建，黄莎莎康东洋林曦戴朴１，２
１解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科（北京１００８５３）
２解放军总医院海南分院耳鼻咽喉头颈外科（海南５７２０００）３美国Ｅｍｏｒｙ大学耳鼻咽喉科（亚特兰大）４解放军总医院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科（北京１０００４８）５解放军二炮总医院耳鼻咽喉科（北京１０００８８）【摘要】目的利用目标序列捕获（Ｔａｒｇｅｔｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｃａｐｔｕｒｅ）、生物编码（Ｂａｒｃｏｄｅ）及大规模平行测序（Ｍａｓｓｉｖｅｌｖ