肠道病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则
附件4
肠道病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对肠道病毒核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。
本指导原则是针对肠道病毒核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、范围
（一）肠道病毒简介
肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，能引起人类致病的肠道病毒有多种，包括人肠道病毒A、B、C、D组，有100多个血清型。人类肠道病毒主要包括：脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组（Coxsackievirus A，CA）、柯萨奇病毒B组（Coxsackievirus B，CB）、人肠道致细胞病变孤儿病毒（简称埃可病毒）（Echovirus ECHO）、新肠道病毒等。新肠道病毒为1969年后陆续分离到的，例如新型肠道病毒71型（EV71）等。近年来，鼻病毒（Rhinovirus）被划入肠道病毒属，鼻病毒包括A、B、C组，已经先后分离得到140多个血清型。
肠道病毒为球形，直径28～30nm，核衣壳二十面体立体对称，无包膜。病毒衣壳由60个相同的壳粒组成，排列为12个五聚体，每个壳粒由VP1、VP2、VP3和VP4四种蛋白组成。
肠道病毒基因组为单股正链RNA，全长约为7.2～8.4kb，基因组分为三部分，两端为保守的非编码区，在肠道病毒中同源性非常显著，其中5’端非编码区常作为肠道病毒通用检测试剂检测的靶基因。中间为连续开放读码框，包含结构蛋白编码区和非结构蛋白编码区，结构蛋白编码区依次编码VP4、VP2、VP3和VP1共４个衣壳蛋白。衣壳蛋白不仅含有抗原决定位点，而且还有决定病毒组织嗜性的受体识别位点，介导病毒与细胞的吸附和进入。非结构蛋白编码区主要负责编码与病毒基因组复制以及病毒颗粒包装等有关的蛋白及酶，它们在RNA复制、细胞器修饰，细胞裂解及形态形成中发挥各自不同的功能。
（二）肠道病毒致病性
肠道病毒在肠道中增殖，但通常不引起肠道疾病。90%以上肠道病毒感染为隐性感染，或仅出现轻微的上呼吸道感染或流感样症状。不同肠道病毒可以引起相同的临床症状，同一种病毒可引起几种不同的临床疾病。
肠道病毒的传染源为患者和无症状的病毒携带者。传播途径主要是粪-口途径，也可通过呼吸道传播，夏秋季是一年之中的主要流行期。肠道病毒以上呼吸道、咽喉和肠道为侵入门户，先在局部黏膜和咽、扁
桃体等淋巴组织和肠道集合淋巴结中初步增殖，然后释放入血，形成第一次病毒血症。扩散至带有受体的靶组织，再次增殖后，引起第二次病毒血症和临床症状。脊髓灰质炎病毒识别的受体为免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子，只有很少的组织表达这种受体，如脊髓前角质细胞、被根神经节细胞、运动神经元、骨骼肌细胞和淋巴细胞等，柯萨奇病毒和埃可病毒识别的受体在组织和细胞中分布广泛，包括中枢神经系统、心、肺、胰、黏膜、皮肤和其他系统等，因而引起的疾病谱复杂，大多数肠道病毒为杀细胞病毒、直接对靶细胞产生裂解性感染。各年龄段人群均可感染肠道病毒。
肠道病毒所致的主要疾病有：
1.手足口病：由肠道病毒感染而引起，以发热，咽喉痛，全身不适，手、足、口腔等部位皮疹或疱疹为主要特征的常见传染病，大多数手足口病患者症状轻微，并且具有自限性，但有相当一部分患者有致死性心肺功能疾病和神经系统并发症，个别重症患者病情进展迅速，甚至可导致死亡。我国手足口病疫情尤为严峻，其已成为严重影响我国居民生命和健康的公共卫生问题。
手足口病致病病原体传染源为患者或隐性感染者，主要的传播途径为粪-口传播，也可经接触患者的疱疹液传播，接触病人和携带者的粪便、唾液和疱疹液污染的日常生活用品均可传播此病原体，近年来的报道显示，该病原体也可垂直传播，导致新生儿重症感染。人对肠道病毒普遍易感，不同年龄组均可感染发病，以5岁以下儿童为主，尤以3岁以下儿童发病率最高，该病流行无明显的地区性，全年均可发生，一般5—7月为发病高峰。该病的潜伏期一般为2—10天，平均潜伏期为3—5天，感染者发病前的数天即可从其咽拭子样本和粪便样本中检出病毒，病程为7天左右，咽部排毒可持续在发病后1—2周，而粪便排毒可持续至发病后3—5周。
引起手足口病的肠道病毒包括柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、7、9、10、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型及埃可病毒等，其中以EV71和CA16型较为常见。
2.无菌性脑膜炎：肠道病毒感染引起的一种疾病，常表现为短暂发热、头痛等，偶尔有肌肉酸痛，或伴有皮疹，重者出现颈项强直、嗜睡、昏迷、意识障碍、脑膜刺激征等症状。目前发现肠道病毒中有60多个血清型能引起无菌性脑膜炎，包括脊髓灰质炎病毒所有型别、柯萨奇病毒A组中的大多数型别、柯萨奇病毒B组的1—6型、埃可病毒大多数型别和肠道病毒71型等。
3.脊髓灰质炎：是由脊髓灰质炎病毒感染而引起的疾病，其中85%由Ⅰ型脊髓灰质炎病毒引起，在我国曾有由Ⅱ、Ⅲ型病毒感染而发病的病例。病毒侵犯脊髓前角运动神经细胞，导致弛缓性肢体麻痹，多见于儿童，故亦称小儿麻痹症。
4.疱疹性咽峡炎：主要由柯萨奇病毒A组某些血清型引起，典型的症状是在软腭、悬雍垂周围出现水泡性溃疡损伤。
5.流行性胸痛：常由柯萨奇病毒B组引起，症状为突发性发热和单侧胸痛。
6.心肌炎和心包炎：主要由柯萨奇病毒B组引起。在婴儿室可引起暴发性流行，死亡率高。散发流行于成人和儿童。
7.眼病：由柯萨奇病毒A组24v型引起急性结膜炎和EV-D-70型引起的急性出血性结膜炎。
此外，肠道病毒感染可能还与病毒感染后疲劳综合征、糖尿病相关。
（三）本指导原则适用范围
1.本指导原则适用于利用荧光探针聚合酶链式反应（Real-time PCR）或其他类分子生物学方法，以特定
的肠道病毒基因序列为检测目标，对来源于人体样本中的肠道病毒核酸进行体外定性检测，临床用于辅助诊断手足口病等肠道病毒感染相关性疾病。涉及其他临床用途的肠道病毒核酸检测试剂可参考本指导原则。手足口病致病病原体中未包含鼻病毒，因此，鼻病毒不在本指南的讨论范围内。
2.临床用于检测手足口病致病病原体的检测试剂，适用样本类型应为鼻咽拭子、咽拭子、粪便/肛拭子、疱疹液、脑脊液（仅限出现神经系统症状的病例）、血液等。
3.本指导原则适用于肠道病毒通用核酸检测试剂、单一病毒种检测试剂及单一病毒血清型检测试剂。通用检测试剂所检病毒型别应至少包括柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、7、9、10、12、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型及埃可病毒等；针对柯萨奇病毒核酸检测试剂所检病毒型别应至少包括上述A组与B组中的血清型；针对柯萨奇A组或B组核酸检测试剂所检病毒型别应至少包括上述该组所列血清型。针对埃可病毒核酸检测试剂所检病毒型别应至少涵盖埃可病毒3、6、11、14、16、19、25、30等血清型。
二、注册申报资料要求
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他等内容，其中，与预期用途相关的临床适应症应重点描述申报产品所检测的肠道病毒型别与临床适应症的相关性及相关肠道病毒在我国的流行特征；产品描述应明确申报产品所有可检出的肠道病毒型别、尚未验证的肠道病毒型别；同类产品在国内外批准上市的情况，应着重从所检病毒型别、不同型别检测的最低检测限及不同型别间的交叉反应等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。综述资料的撰写应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。
（二）主要原材料研究资料
此类产品的主要原材料包括引物、探针、DNA聚合酶、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶（如适用）、核酸分离/纯化组分（如有）、试剂盒质控品及企业参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备及质量标准等的研究资料、质控品的确认试验资料；生产企业还应提供企业参考品的原材料选择、来源、质量指标、参考品的制备及阴阳性的确认过程等。
1.引物和探针：包括申报产品检测靶序列的引物和探针以及内对照的引物和探针。应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。针对检测靶序列的引物和探针，建议设计两套或多套引物、探针以供筛选，针对所有预期适用的肠道病毒型别进行检出准确性和特异性（如交叉反应）的评价，可采用扩增靶序列与所有型别肠道病毒基因组比对研究的方法，最终确认最佳组合，并提交筛选的研究数据。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度检查、浓度检查及功能性实验等。
2.酶：需要的酶主要包括逆转录酶、DNA聚合酶，其质量标准如下：
2.1逆转录酶应包括核酸逆转录活性、无核酸内切酶活性等。
2.2 DNA聚合酶应包括DNA聚合酶活性、无核酸内切酶活性、热启动能力、热稳定性等。
2.3如申报产品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，应对其酶活性及热稳定性等质量控制标准进行规定。
3.dNTP：质量标准应至少包括纯度检查及功能性实验等。
4.核酸分离/纯化组分（如有）的原理介绍、主要组成、主要原材料的质量控制标准及相关验证资料。
5.试剂盒质控品
试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒质控品来实现，针对阳性质控品和阴性质控品申请人应明确质控品的来源、质量标准、质控品阴阳性的确认方法及相关验证资料。申报产品的质控体系应考虑以下几个方面：
5.1阳性质控品中应含有天然的或人工合成的包含试剂盒所检测靶序列的RNA，至少应包含临床较常见的血清型。质控品应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平行提取等步骤。企业应对质控品的检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求。
5.2阴性质控品应不含试剂盒所检测靶序列的RNA，质控品应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平行提取等步骤，以对可能存在的交叉污染产生的假阳性结果进行质量控制。
5.3内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。对内对照的检测结果（如Ct值）亦应做出明确的范围要求。
6.企业参考品：应详细说明有关企业参考品的原料选择、制备、阴阳性确认等试验。
企业参考品的核酸性质应与产品预期检测的靶物质一致。鉴于肠道病毒为RNA病毒，企业参考品可采用灭活病毒、含有肠道病毒基因组的装甲病毒（或假病毒）、人工克隆或合成的肠道病毒基因组RNA。具体要求如下：
6.1阳性参考品和阴性参考品
阳性参考品应包含本指南范围中规定申报产品至少应检出的肠道病毒血清型，例如，肠道病毒通用型检测试剂阳性参考品应至少包含柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、7、9、10、12、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型及埃可病毒等，其他单一病毒种及单一病毒血清型检测试剂阳性参考品应包含该类产品至少应检出的血清型。阴性参考品应考虑检测特异性的评价，应纳入不在试剂盒检测范围内的其他肠道病毒血清型样品（如有）和其他病原体样品。
6.2检测限参考品
申请人应明确检测限参考品中病毒核酸浓度的确定方法，明确检测限参考品中病毒核酸浓度的确定依据，检测限参考品中肠道病毒核酸浓度应为申报产品检测限浓度或略高于检测限浓度，检测限参考品应包含申报产品至少应检出的肠道病毒血清型。
6.3精密度参考品
可不包含所有涉及的肠道病毒血清型，但应选择多个临床较常见的型别，针对所选型别应分别至少设置一个弱阳性水平。
若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定，并提交生产工艺验证报告；如主要原材料购自其他供应商，则需针对供应商的选择提供评价数据，并提供供应商出具的质量标准、出厂检定报告以及申请人对该原材料进行的质量检验资料。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料
1.介绍产品主要生产工艺，可以图表方式表示，并说明主要生产工艺的确定依据。
2.反应原理介绍。
3.详述样本采集、样本处理方式的选择和设置，提供相关的研究资料。
4.确定最佳反应体系的研究资料，包括样本用量、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。
5.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。
6.如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。
（四）分析性能评估资料
申请人应提交产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能评价的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、试验方法、可接受标准、试验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点、适用仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。
针对不同的样本类型，申请人应分别完成性能评估，包括阴阳性符合率、最低检测限、精密度、分析特异性等。
分析性能评价的试验方法可以参考国际或国内有关体外诊断试剂性能评估的指导原则进行。对于此类产品，性能评估中所用样品（除非特别说明）可参考上述企业参考品的制备要求。各项性能评价应符合以下要求。
1.核酸分离/纯化性能
在进行靶核酸检测前，应有适当的核酸分离/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。无论检测试剂是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使用的核酸分离/纯化试剂的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，提供详细的验证资料。
2.申请人应明确申报产品所能检出所有肠道病毒血清型及不能检出的血清型。建议申请人采用申报产品对目前已知所有肠道病毒血清型样本进行检测，以验证申报产品所检血清型范围，用于验证的样本可以为临床收集样本、病毒基因组或人工构建假病毒。
3.阳性/阴性参考品符合率
阳性参考品的检测旨在验证试剂盒检测范围内的各肠道病毒血清型均可以在适当的浓度被检测到，阳性参考品检测结果应为阳性。阴性参考品旨在评价试剂特异性，阴性参考品检测结果应为阴性。
4.最低检测限
申报产品最低检测限的性能评估资料应包含最低检测限的确定及验证过程。
4.1应针对申报产品所能检出的CA16、CA6、EV71等常见肠道病毒血清型分别进行确定，建议采用培养后病毒原液进行梯度稀释，配制系列稀释的样品进行最低检测限的评价，系列稀释度应能够覆盖大部分检出概率区间（0～100%），可通过概率计算或其他适当方法进行测算选取适当检出率水平的浓度作为最低检测限确定的标准，如95%（n≥20）的阳性检出率水平。病毒原液浓度测定建议采用空斑试验，浓度水平采用空斑形成单位（PFU）为计量单位。
4.2应选择申报产品最低检测限或接近最低检测限的病毒水平对申报产品最低检测限进行验证，验证最低检测限的样本应至少包含申报产品所能检出的CA16、CA6、EV71等常见肠道病毒血清型，应至少选择多个病毒株进行验证。企业应能够提供用于最低检测限验证的各个病毒株的来源、型别及浓度水平（PFU）
确认试验等信息。
4.3申请人应明确申报产品最低可检出的肠道病毒基因拷贝数水平，同时提供确定过程及相关实验数据，本项研究应针对不同血清型分别确认，所用样本血清型应包括申报产品最低检测限参考品设置的血清型。
4.4申报产品检测企业最低检测限参考品，检测结果应满足相应要求。
5.分析特异性
5.1交叉反应
申请人应针对可能出现在检测样本中的病原体进行交叉反应验证，用于交叉反应验证的样品，除肠道病毒外，其他病原体应尽量采用灭活病原体培养物或临床样本。建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证，申请人应详细说明交叉反应样本来源、病原体鉴定和滴度确定的方法和结果。病原体种类主要考虑以下几方面：试剂盒检测范围以外的其他肠道病毒血清型、样本中可能出现的其他病原体。建议对以下病原体进行交叉反应验证：诺如病毒、单纯疱疹病毒1/2型、肠道腺病毒、水痘-带状疱疹病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、星状病毒、EB病毒、风疹病毒、麻疹病毒、甲型流感病毒、副流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、戊肝病毒、B族链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺菌、弧菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、草绿色链球菌、奈瑟菌属、黏液罗氏菌、变形杆菌等。
5.2干扰试验
应根据所采集样本类型，针对可能存在的干扰情况进行验证。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价，并针对有代表性的肠道病毒血清型，至少在病毒临界阳性水平进行干扰试验验证。干扰物质的选取应至少包括：血红蛋白、黄疸（仅限血液样本）、脂血（仅限血液样本）、白细胞、粘蛋白、常见病毒治疗药物、抗生素、微生态制剂、粪便中未消化的食物纤维等。
6.精密度
企业应对申报产品精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。因模拟样本并不能体现临床样本可能带来的所有变异因素，因此精密度评价中所用样本应至少包含精密度参考品及若干临床样本，且精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求：
6.1对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除检测试剂（包括核酸分离/纯化组分）本身的影响外，还应对分析仪、操作者、试验地点、检测批次等要素进行相关的验证。
6.2设定合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。
6.3用于精密度评价的临床样本均应至少包含3个水平：阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品，并根据产品特性设定适当的精密度要求，临床样本精密度评价中的每一次检测均应从核酸提取开始。
（五）阳性判断值确定资料
对于此类试剂，阳性判断值即为能够获得理想的临床灵敏度和临床特异性的临界值（Cutoff），对于荧光探针PCR方法即为Ct值的确定资料。建议采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式进行相关研究。申请人可选取适当的临床样本进行试验以确定阳性判断值。
（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实
时稳定性（有效期）、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
考虑到病毒RNA极易被降解的特性，企业也应对样本稳定性进行研究，主要包括冷藏和冷冻两种条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内，每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析验证，从而确认不同类型样本的效期稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。
对于样本提取后不能立即进行检测的，应明确核酸储存条件、储存时间等，同时应提供相应的核酸稳定性研究资料。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
（七）临床试验
临床试验的开展、方案的制定以及报告的撰写等均应符合相关法规及《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求。
1.研究方法
对于已有同类产品上市的试剂的临床研究，选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。另外，申请人还应选择不少于30例核酸检测阳性的新鲜采集样本进行考核试剂与肠道病毒感染检测的“金标准”方法—病毒分离培养鉴定方法或其他证明肠道病毒感染的方法进行比较研究。如医院无病毒培养条件，可由该医院委托其他具有相应条件的机构进行。
对于无法选择参比试剂的新型肠道病毒核酸检测试剂，其临床研究应选择病毒分离培养鉴定和/或病毒核酸序列测定方法作为参比方法。用于核酸序列测定的引物序列应不同于考核试剂中用于检测目的基因的引物序列。
临床试验中如涉及核酸序列测定方法，则建议对扩增子进行双向测序。应在临床研究报告中对选用的测序方法做详细介绍，并提供以下关于测序试验的详细信息及资料：
1.1测序方法原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。
1.2测序方法所用引物相关信息，如基因区段选择、分子量、纯度、功能性试验等资料。
1.3对所选测序方法的分析性能进行合理验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与拟申报产品的相关性能进行适当比对分析。
1.4测序方法应建立合理的阳性质控品和阴性质控品对临床样本的检测结果进行质量控制。
1.5提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。
2.临床试验病例数
申报产品临床试验总病例数应不低于500例。入组样本的血清型应满足如下要求，肠道病毒通用型检测试剂阳性样本应至少包含柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、10、12、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型及埃可病毒等，其他单一病毒种及单一病毒血清型检测试剂阳性样本应包含该类产品至少应检出的血清型；上述血清型中常见血清型应包括该型别中不同的基因型，常见血清型阳性病例数单独统计应满足统计学要求。单一病毒血清型检测试剂，临床试验中其检测的血清型应包括该型别中不同的基因型，
阳性病例数应满足统计学要求。
另外，对于已被批准上市的肠道病毒核酸（通用型）检测试剂，如果在其注册证有效期内出现了新型肠道病毒的暴发流行，如有需要，生产企业应迅速针对新型肠道病毒开展临床比对研究，可以采用病毒检测的“金标准”方法或当时卫生行政部门认可的针对该新型肠道病毒血清型的诊断标准作为参比方法进行临床比对研究，分别对采集自新型肠道病毒感染（阳性病例不少于30例）、其他常见的肠道病毒及非肠道病毒感染但具有相应症状的患者的新鲜样本进行比对实验研究，总例数不少于200例，如临床试验研究结果可以证明其对新型肠道病毒的检测能力，申请人应考虑产品预期用途发生的改变，同时提出变更申请，并按相关法规要求提交分析性能评估和临床试验研究等资料。
3.临床研究单位的选择
应选择不少于3家（含3家）临床试验机构，按照相关法规、指导原则的要求开展临床试验。临床试验机构的选择应尽量考虑拟申报产品的特点和预期用途，综合流行病学背景，受试者的选择具有一定的地域代表性。且临床试验机构应具有分子生物学方法检测的优势，实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节，熟悉评价方案。
4.病例选择及样本类型
临床试验应选择具有相应肠道病毒感染症状/体征或有密切接触史的人群作为研究对象。申请人在建立病例纳入标准时，应考虑到试剂所适用的各年龄段人群的差异。临床试验入组病例应与产品预期用途中适用人群一致。
临床试验中所涉及的样本类型应为实际临床检测中常用的样本类型。如申报产品所适用的样本类型同时包含鼻咽拭子、咽拭子、粪便/肛拭子、疱疹液、脑脊液或血液等多个样本类型，应针对不同样本类型分别进行临床试验。
5.伦理学要求
临床试验必须符合赫尔辛基宣言的伦理学准则，必须获得临床试验机构伦理委员会的同意。研究者应考虑临床试验用样本的获得和试验结果对受试者的风险性，应提交伦理委员会的审查意见。
6.临床试验方案
临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各研究单位选用的参比试剂及所用机型应一致，以便进行合理的统计学分析。另外，考核试剂的样本类型不应超越参比试剂对样本类型的检测要求，如果选择了参比试剂适用样本类型以外的样本，则应选择病毒分离培养鉴定或其他合理方法对额外的样本类型进行验证。
7.统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、阴性/阳性符合率等。对于本类产品对比实验的等效性研究，常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行
四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。
在数据收集过程中，对于两种试剂检测结果不一致的样本，应采用“金标准”方法或临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。
8.质量控制
临床试验开始前，应进行临床试验的预试验，以熟悉并掌握相关试验方法的操作、仪器、技术性能等，最大限度控制试验误差。整个试验过程都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
9.临床试验总结报告撰写
根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。
9.1临床试验总体设计及方案描述
9.1.1临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。
9.1.2病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准、样本编盲和揭盲的操作流程等。
9.1.3样本类型，样本的收集、处理及保存等。
9.1.4统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
9.2具体的临床试验情况
9.2.1临床试验所用体外诊断试剂及仪器的名称、批号、机型等信息。
9.2.2对各研究单位的病例数、年龄分布情况、不同血清型分布情况进行综合，建议以列表或图示方式列出各年龄组和各种血清型的样本例数。
9.2.3质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行情况。
9.2.4具体试验过程，样本收集、样本保存、样本检测、结果处理、结果不一致样本的确认等。
9.3统计学分析
9.3.1数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。
9.3.2结果的一致性分析
计算阳性符合率、阴性符合率、总体符合率，采用适当的统计学方法，如四格表卡方检验或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性。
9.4讨论和结论
对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。
（八）产品技术要求
申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下，根据申请人产品研制、临床评价等结果，依据国家标准、行业标准及有关文献，按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的有关要求，编写产品技术要求。
肠道病毒核酸检测试剂的产品性能指标应主要包括：物理性状、阴/阳性参考品符合率、精密度、最低检测限等。阳性参考品主要考察对试剂盒适用范围内不同血清型肠道病毒的检测能力，阴性参考品则重点对申报试剂的分析特异性进行验证。
如果申报试剂已有适用的国家标准品、参考品发布，则申请人应在产品技术要求中提出检测要求。
按照《办法》的规定，此类产品为第三类体外诊断试剂，申请人应按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的要求，以附录形式明确主要原材料、生产工艺及半成品要求，附录的编制应符合相关编写规范的要求。
（九）产品注册检验报告
根据《办法》的要求，首次申请注册的第三类体外诊断试剂产品应在具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构进行连续3个生产批次样品的注册检验。对于已经有国家标准品、参考品的检测项目，在注册检验时应采用相应的国家标准品、参考品进行注册检验，对于目前尚无国家标准品的、参考品的项目，生产企业应建立自己的参考品体系并提供相应的企业参考品。
（十）产品说明书
说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、检验方法、检验结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求，进口体外诊断试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书中相关技术内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。
结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对肠道病毒核酸检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。
1.【预期用途】
1.1试剂盒用于定性检测人鼻咽拭子、咽拭子、粪便/肛拭子、疱疹液、脑脊液或其他样本的肠道病毒核酸，适用样本类型应结合实际的临床研究完成情况进行确认。
1.2明确肠道病毒核酸试剂的临床意义，主要用于对肠道病毒感染引起的手足口病等的辅助诊断，以便于临床医生结合病人的其他检查结果进行更加准确的疾病判断和科学的患者管理，应对肠道病毒感染引起的相应临床症状进行描述。
1.3简单介绍待测目标的特征，如病毒种系渊源、生物学性状、宿主特性、致病性、感染后临床表现、待测靶基因特征等。
1.4待测人群特征介绍：具有肠道病毒感染症状的患者、相关的密切接触者、地域要求或年龄限制（如有）等，待测人群应与申报产品临床试验中入组人群一致。
1.5应明确申报产品所能检测病毒血清型及经过临床验证的血清型。
1.6应强调实验操作人员应接受过基因扩增或分子生物学方法检测的专业培训，具备相关的实验操作资格，实验室应具备合理的生物安全防备设施及防护程序。
2.【检验原理】
详细说明试剂盒技术原理，及核酸分离/纯化方法、原理。说明检测的靶基因座位、序列长度等；介绍引物及探针设计、不同样品反应体系（管）组合、对照品（质控品）设置及荧光信号标记等。如添加了相关的防污染组分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也应对其作用机理作适当介绍。
3.【主要组成成分】
详细说明试剂盒内各组分的名称、数量、成分、浓度等信息，如含有生物源性物质，应说明其生物学来源、活性及其他特性；说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。
试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，应列出相关试剂的生产企业、产品名称、货号以及医疗器械注册证号/备案号（如有）等详细信息。当试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分时，应在此注明经验证后推荐配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的如上信息。
4.【储存条件及有效期】
试剂盒的效期稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、冻融次数要求等，应与相应的稳定性研究结论一致。
5.【适用仪器】
所有适用的仪器型号，提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。
6.【样本要求】
明确适用的样本类型。并详细描述样本采集及预处理要求、运输要求、保存条件及期限等。特别是样本采集所需设备及保存液，需特别明确供应商、货号及注册证号/备案号（如有）。有关描述均应建立在相关性能评价及稳定性研究的基础上。
样本的取材及处理方式等若有通用的技术规范或指南，则应遵循，并在此处引用。
7.【检验方法】
详细说明实验操作的各个步骤，包括：
7.1试剂配制方法、注意事项。
7.2核酸分离/纯化的条件、步骤及注意事项。对照品（质控品）参与样本核酸的平行提取的要求等。
7.3扩增反应前准备：各组分加样体积、顺序、相关注意事项等。
7.4逆转录过程的温度和时间设置、PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置及相关注意事项。
7.5仪器设置：特殊参数，待测基因、内标的荧光通道选择等。
7.6质量控制：说明对照品（质控品）的检测要求。
8.【阳性判断值】
简要总结阳性判断值研究方法及结论。
9.【检验结果的解释】
结合对照品（质控品）以及样本管中靶基因和内标的检测结果，对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述。检验结果的解释应以阳性判断值的研究结论为依据。如有适用的临床诊疗或筛查指南，则应在此项下引用，相应检验结果的解释应符合相关指南的要求。
10.【检验方法的局限性】
应至少包括如下描述：
10.1本试剂检测结果应结合患者临床症状及其他相关医学检查结果进行综合分析，不得单独作为患者管理的依据。
10.2针对肠道病毒通用型检测试剂，未包含在申报产品检测型别范围内的肠道病毒血清型。
10.3不合理的样本采集、转运及处理以及不当的实验操作和实验环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。
10.4针对肠道病毒通用型核酸检测试剂，应明确申报产品所检病毒血清型中经过临床验证的型别，明确其余型别未经临床验证。
10.5申报产品应明确不同病程不同阶段样本的阳性率不一致。
10.6取标本期间，接种减毒活疫苗的患者可能会导致检测试剂检测结果呈阳性。
11.【产品性能指标】
详述以下性能指标：
11.1对相应国家标准品、参考品（如有）检测的符合情况。
11.2最低检测限：依据分析性能评估资料，说明产品最低检限，并简单介绍最低检测限的确定方法。
11.3企业内部阳性/阴性参考品符合率，阳性/阴性参考品的组成、来源、浓度梯度设置以及评价标准等信息。
11.4精密度：建议详细描述针对不同肠道病毒基因型，采用不同来源的样本（如人工模拟样本和临床样本）在各个浓度水平进行的精密度评价结果，可采用列表形式描述。
11.5分析特异性：建议以列表方式说明验证的其他肠道病毒血清型、相关病原体等的交叉反应性及其验证浓度水平。总结潜在干扰物质的评价浓度水平及干扰情况。
11.6简要描述临床试验的基本信息、试验方法和结论。
12.【注意事项】
应至少包括以下内容：
12.1如该产品含有人源或动物源性物质，应给出生物安全性的警告。
12.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号或现行有效版本）等有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。
12.3强调产品性能仅针对声称的适用样本类型及【样本要求】项下说明的样本采集和处理方法（包括样本采集液等）进行了验证，其他样本类型或样本采集、处理方法不能保证产品性能。
三、名词解释
1.PCR-荧光探针法
在PCR过程中利用荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，并通过对荧光的采集和分析以达到对原始模板量进行分析的PCR。
四、起草单位
国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心。
肠道病毒
肠道病毒（enterovirus） 1.肠道病毒： （1）属于小RNA病毒科中的肠道病毒属成员，由粪-口途径传播。 （2）虽然感染胃肠道，但却很少引起胃肠道疾病，其靶器官以神经系统、肌肉和其他系统为主，引起脊髓灰质炎、脑膜炎、脑膜脑炎、心肌炎、心周炎、手足口病等疾病。 （3）一种病毒血清型可引起几种不同的疾病综合征，而几种不同的血清型又可引起同一种疾病。 2. 肠道病毒种类与分型 （1）脊髓灰质炎病毒(poliovirus)：分1、2、3三型 （2）柯萨奇病毒(coxsackie virus) ：分A、B两组；（A组：包括A1~A22、A24型；B组：包括B1~B6型；） （3）埃可病毒(ECHO virus)：包括1~9、11~27、29~33型 （4）新型肠道病毒：包括68、69、70、71型 3. 脊髓灰质炎病毒：①是引起脊髓灰质炎的病原体； ②脊髓灰质炎又称为小儿麻痹症，是一种危害中枢神经系统的传染病。（1）临床意义： ①传播途径：经粪-口途径感染，潜伏期2~10天 ②传染源：患者及无症状隐性感染者 ③临床表现：无症状感染、顿挫型脊髓灰质炎、无麻痹性脊髓灰质炎、麻痹型脊髓灰质炎1~2% （2）致病机制： （3）生物学特性： ①病毒近似球形，直径27～30nm，核心为单正链RNA，约7.2～8.5kb，核衣壳呈20面体立体对称，无包膜。 ②衣壳含4种蛋白（VP1～VP4），VP1、VP2和VP3暴露在病毒体表面，是抗体结合位点；VP4在核心内部与RNA结合。 （4）培养特性：
①细胞：人胚肾、人胚肺、猴肾细胞、Hela、HEp-2、Vero等 ②最适温度：36～37℃CPE：培养3～5天出现 ③抵抗力较强 （5）微生物学检验： 1.标本采集与处理标本：粪便、发病早期的咽部分泌物等 2.病毒分离与鉴定：人或猴肾原代细胞、Hela、V ero等细胞24～48小时可出现典型CPE 3.抗原检测：ELISA法 4.核酸检测：用RT-PCR等方法 5.抗体检测：单份血清检测IgM，双份血清检测抗体效价升高4倍 （6）减毒活疫苗：①剂型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型；②用法：口服（温水）； ③机理：产生分泌型IgA，阻止病毒入血； 4. 柯萨奇病毒（Coxsackievirus）：柯萨奇病毒是1948年在美国纽约州柯萨奇镇，从一名疑似脊髓灰质炎患者粪便中用接种乳鼠的方法首次分离出的，因而得名。 （1）分类：根据对乳鼠引起的病理变化分为： A组：可使乳鼠产生广泛性骨骼肌炎，引起驰缓性麻痹。包括23个血清型 B组：可引起乳鼠局灶性肌炎及痉挛性麻痹，并常有棕色脂肪坏死、脑炎和心肌炎。包括6个血清型 （2）临床意义： A. 传染源：患者或无症状带毒者 B. 传播途径：主要经粪一口途径，亦可由呼吸道传播。 C. 所致疾病：因其可侵犯呼吸道、胃肠道、肌肉、皮肤、心脏或中枢神经系统等多种组织器官，导致临床表现多样化。较重要的有：类脊髓灰质炎麻痹、无菌性脑膜炎、出疹性发热病、急性心肌炎和心包炎、流行性肌痛、疱疹性咽峡炎。 （3）生物学特性 A. 病毒呈球形，直径为17～30nm B. 核心为线状单正链RNA，基因组长约7.5kb C. 核衣壳呈20面体立体对称，无包膜 D. 抗原性复杂，不仅型别多，而且型内还有抗原变异。 （4）微生物学检验：检查程序与脊髓灰质炎病毒基本相同。但应注意下列问题： ①必须采用乳鼠接种法分离病毒，以免丢掉那些在细胞培养上不能增殖的病毒； ②由于人群中常有柯萨奇病毒携带者，因而从咽部或粪便取材分离出的病毒，不一定是病原因子；只有取病人双份血清做中和试验，测出特异性抗体有4倍或4倍以上增高时，才能确定病因关系。若从CSF、心包液或疱疹液分离出病毒，则可直接做出诊断； ③由于病毒型别多，很难用检测患者血清中特异性抗体的方法来判断是由哪一型病毒引起的疾病。因而血清学诊断法只适用于集体发病者。以分离株病毒为抗原，对流行区的病人或隐性感染者进行检测。 5. 埃可病毒（ECHOV）：埃可病毒是1951年脊髓灰质炎流行期间从患者粪便中分离出的能使培养细胞发生病变的非脊髓灰质炎病毒。因当时不了解其与疾病关系，故命名为人类肠道细胞病变孤儿病毒(ECHOV)简称之为埃可病毒（ECHOV）。 （1）临床意义： ①ECHOV对人的致病性与柯萨奇病毒类似,一岁以下婴儿由ECHOV引起的中枢神经系统感染，常导致神经后遗症和智力障碍，在基本消灭了脊髓灰质炎的国家已引起重视。 ②ECHOV生物学特性和微生物学检验方法与柯萨奇病毒相似。 6. 新型肠道病毒：1969年以后分离出的肠道病毒新血清型，不再将其归属于柯萨奇病毒和
核酸检测试剂生产及质量控制技术指导原则复习进程
核酸检测试剂生产及质量控制 技术指导原则（征求意见稿） 核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段，从而筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的扩增反应（TMA）等。核酸检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域。为规范核酸检测试剂的生产及质量控制，特制定本技术指导原则，并将根据核酸检测技术的发展状况适时进行修改。 一、基本要求 1、核酸类检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。 2、核酸类检测试剂的生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、环境、设施和仪器设备等条件，建立专用实验室，配备满足核酸提取和扩增检测以及操作人员防护所需的设备。实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染。 3、核酸类检测试剂的生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，建立相应的质量管理体系，并应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。
4、核酸类检测试剂的生产单位应当对试剂的使用范围作出明确规定，并经国家药品管理部门批准。引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂须设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。 5、核酸类检测试剂的原材料应制订相关质量标准，应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅料质控标准》的要求。使用未列入上述标准的化学试剂，应不低于分析纯。 二、原材料 应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等的相关研究资料。如果主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。 核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无DNase和RNase污染。 1、dNTP 脱氧三磷酸核苷，核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、d GTP、dCTP和dTTP。应为HPLC纯、PCR级，无DNase和RNase 污染。-20℃保存。 2、引物 由一定数量的核苷酸构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
核酸检测基本 知识
核酸检测基本知识 1.什么是核酸检测 核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。 核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息 和传递遗传信息。 2.核酸的分类 核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 3.核酸的组成
DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。 4.核酸的功能 在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的 作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物 合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列 重大生命现象中起决定性的作用。 DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如 下： DNA与RNA的比较DNA RNA 主要存在部位细胞核细胞质 基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、T A、G、C、U 五碳糖种类脱氧核糖核糖 核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链 5.检测方法 核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检 测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生
物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核 酸检测。 目前主要使用的方法有以下几种： a.核酸序列依赖性扩增法 NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性 核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。 整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA 杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量 扩增。 b.转录介导的扩增技术 TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。 c.连接酶酶促链式反应(LCR) LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种
核酸类检测试剂的原材料生产工艺和半成品
附件 3 核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则 一、前言 本指导原则主要针对核酸扩增类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。 本指导原则系对核酸扩增法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于核酸扩增法检测试剂的注册技术审查，其他类核酸检测试剂可参照相关内容。 三、基本要求 （一）基本原则 1.核酸扩增类检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。 2．试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和仪器设备以及适宜的生产环境，配备满足核酸提取和扩增检测以及操作人员防护所需的设备。建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以
最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染。生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。 3.试剂生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，建立相应的质量管理体系，并应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。 4.核酸扩增类检测试剂的引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂需设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。 5.企业使用新型原材料时，应提供与通行原材料比对研究结果及相关资料。使用未列入上述标准的化学试剂，应不低于分析纯。 （二）原材料应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等的相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；如主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。主要原材料（包括生产工艺）或其供应商发生变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶DNase）和核糖核酸酶RNase）污染。 1.脱氧三磷酸核苷（dNTP） 核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。应为高效液相色谱HPLC）纯、PCR级，无DNase和RNase污染。一20C保存。 2.引物 由一定数量的dNTP 构成的特定序列，通常采用脱氧核糖核酸 （DNA ）合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。 冻干粉，序列正确，合成量应达到试剂生产要求。纯度应达到电泳级
核酸检测测试题及答案
新冠病毒核酸检测培训测试 单选题:1. 根据目前掌握的新型冠状病毒生物学特点、流行病学特征、致病性、临床表现等信息，该病原体暂按照病原微生物危害程度分类中（）类病原微生物进行管理？ A. 第一 B. 第二 C. 第三 D. 第四 单选题:2. 可以进行新型冠状病毒检测标本采集人员为? A. 经过生物安全培训，培训合格且具备采样技能的人员 B. 医生 C. 研究所科研人员 D. 实验室管理人员 单选题:3. 新型冠状病毒检测标本首选? A. 呼吸道标本 B. 便标本 C. 尿液 D. 结膜拭子标本 单选题:4. 新型冠状病毒感染的特异性检测不包括? A. 核酸检测 B. 病毒分离 C. 抗体检测 D. 生化检测 单选题:5. 抗体检测最好选用? A. 发病早期血清 B. 空腹血 C. 恢复期血清 D. 发病早期、恢复期双份血清 单选题:6. 新型冠状病毒核酸检测技术不包括? A. 高通量测序 B. 荧光RT-PCR C. 数字PCR技术 D. 病毒分离 单选题:7. 以下哪个条件不能确认新型冠状病毒感染? D
A. 同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性 B. 两种标本实时荧光RT-PCR检测同时出现单靶标（ORF1ab或N）阳性 C. 同种类型标本两次采样检测重复出现单个靶标阳性（ORF1ab或N） D. 单种标本单次单靶标阳性（ORF1ab或N） 单选题:8. 可在BSL-2级实验室开展的新型冠状病毒相关实验活动不包括? A. 病毒分离 B. 标本分装 C. 标本灭活 D. 核酸检测 单选题:9. 新型冠状病毒感染动物实验可以在（）实验室开展? A. BSL-1 B. BSL-2 C. BSL-3 D. ABSL-3 单选题:10. 鼻拭子采集的关键点是什么？ A. 鼻拭子：待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周 B. 鼻拭子：沿下鼻道的底部向后缓慢深入，待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转三周 C. 鼻拭子：沿上鼻道的底部向后缓慢深入，待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时即可 D. 鼻拭子：沿中鼻道的底部向后缓慢深入，待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转三周 单选题:11. 咽拭子采集部位的关键点是什么？ A. 咽拭子：两侧咽扁桃体和咽后壁上下擦拭至少30秒 B. 咽拭子：两侧咽扁桃体稍微用力来回转动擦拭，然后在咽后壁上下擦拭至少30秒 C. 咽拭子：两侧咽扁桃体稍微用力擦拭，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次 D. 咽拭子：两侧咽扁桃体来回转动擦拭，然后再在咽后壁上下擦拭至少1次 单选题:12. 实验室戴手套的注意事项？ A. 两层普通手套 B. 两层能盖过袖口的手套，每次戴手套前要做充气检查 C. 长袖筒一次性医用橡胶手套两层，手套袖筒必须覆盖住防护服袖口，用充气方法检查手套是否破损 D. 两层手套，用充气方法检查手套是否破损 单选题:13. 采集新冠病毒呼吸道标本时戴什么级别的口罩？ A. N95及以上口罩 B. N99口罩 C. 医用外科口罩
常见实验方法的写作套路核酸检测篇9-Digital PCR
编号：2-9 主题：digital PCR 概述： Digital PCR（dPCR)即数字PCR，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可以直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。由于数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，因此特别适用于依靠Real-time PCR的Ct值不能很好分辨的应用领域，例如：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。目的： 对DNA分子的个数进行绝对定量。 原理： 其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。 步骤： 1.分离并纯化基因组DNA； 2.计划数字PCR实验，确定样品的最佳稀释度，以获得数字PCR答案；
3.上样，将DNA样品与TaqMan Assay以及OpenArray数字PCR预混液上样到OpenArray 384孔板； 4.循环和成像，利用OpenArray AccuFill 系统将反应上样到OpenArray平板。将OpenArray平板插入OpenArray箱中，装满浸液，并用封箱胶水密封。利用OpenArray? 实时定量PCR系统开展读取。 5.快速轻松地获取和分析数据。 流程图：
肠道病毒标本的采集运送保存和实验室检测指南
肠道病毒标本的采集运送保存和实验室检测指南 为及时、科学地采集和运送手足口病标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，特制定本指南。 一、采样液 1．pH7.4～7.6 HANK氏平衡盐（含0.5%的牛血清白蛋白）。 2．pH7.4～7.6的Eagle’s MEM培养液（含0.5%的牛血清白蛋白）。 二、标本种类及采集 1．咽拭子：用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的采样管中。 2．患者粪便：采集5～10g粪便置于15ml空采样管中。 3．血清标本：须采集急性期、恢复期双份血清。用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml 无菌螺口塑料管中。 标本采集好后，应在采样管上做好标记，并注明标本的种类，同时及时填写采样表，要求信息完整。 三、标本保存及运送 标本应在冷藏的条件下尽快进行送实验室检测，24小时内能检测的标本可置于4℃保存，24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存。如无－70℃保存条件，则于－20℃冰箱暂存。血清可在4℃存放3天、-20℃以下长期保存。标本运送期间应避免反复冻融。 四、标本的实验室检测 1．核酸检测：方法包括RT-PCR和Real-Time RT-PCR，首先使用肠道病毒
通用引物进行快速筛查，得到阳性结果后使用EV71、CoxA16等引物和探针进行分型。 2．病毒分离及鉴定：采用RD、Hep2和Vero细胞进行病毒的分离，第一代7日内仍然为阴性的标本需继续盲传一代。病毒鉴定采用中和试验（NT）和间接免疫荧光法（IFA）。 3．血清学检测：采用组合血清进行血清中和试验，双份血清具4倍增长才具有诊断意义。
新冠病毒核酸检测技术人员培训-答案449
1.新型冠状病毒感染的重症病例优先采集： A:上呼吸道标本 B:下呼吸道标本 C:尿标本 D:全血标本 E:血清标本 2.新型冠状病毒采集的血液标本应尽量釆集发病后（）内的急性期抗凝血： A:3天 B:5天 C:7天 D:10天 E:14天 3.新型冠状病毒感染用于病毒分离和核酸检测的标本24小时内无法检测的标本则应置于（）或以下保存： A:-30℃ B:-40℃ C:-50℃ D:-60℃ E:-70℃ 4.新型冠状病毒血清标本可在4℃存放： A:3天 B:5天 C:7天
D:10天 E:14天 5.新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于：A:A类 B:B类 C:C类 D:D类 E:E类 1.新型冠状病毒属于 A:α属 B:β属 C:γ属 D:δ属 E:以上都不是 2.下列哪种消毒剂不能有效灭活病毒 A:乙醚 B:75%乙醇 C:氯己定 D:过氧乙酸 E:氯仿 3.关于新型冠状病毒标本的包装，下列说法正确的是 A:标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装
B:所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧C:容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期 D:将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本 E:以上都正确 4.关于新型冠状病毒的标本保存，下列说法不正确的是 A:能在24小时内检测的标本可置于4℃保存 B:24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存 C:血清可在4℃存放3天，-20℃以下可长期保存 D:应设立专库或专柜单独保存标本 E:标本运送期间可反复冻融 5.2019新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装对应的联合国编号为 A:UN2814 B:UN1602 C:UN3373 D:UN9284 E:UN1605 1.设计有缓冲间的实验室是 A:BSL-1实验室 B:普通型BSL-2实验室 C:加强型BSL-2实验室 D:所有级别的实验室
核酸检测技术的应用
核酸检测技术的应用 规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别实行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本实行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling实行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求实行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 其中112394人份采用单人份核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数78例，不合格率为2.8‰.两者不合格 率比较，有显著性差异（P<0.05）。 类，一类为NAT反应性而ELISA无反应性，即为单独NAT不合格结果, 此类不合格的检出即为NAT在血液筛查中所发挥的检测效能。另一类 为NAT反应性ELISA亦为反应性。303616份标本中全血标本和单采血
肠道病毒的分类与检测
肠道病毒的分类与检测 摘要 肠道病毒可引发多种感染，并且发病以综合症出现，一种综合症可有不同病毒所引起，同一种病毒可以导致不同综合症是肠道病毒感染的普遍现象。目前除脊髓灰质炎外，尚无疫苗可供预防，是当前严重影响人类健康的重要病原之一。肠道病毒主要经粪一口或呼吸道传播，所以对肠道病毒感染作出准确、及时的诊断是非常必要的。肠道病毒（Enterovirus）是小RNA病毒科，有67个血清型。人类肠道病毒包括：脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus）、埃可病毒（Echo）、甲型肝炎病毒以及新型病毒。目前常用的检测肠道病毒的方法有病毒分离培养、血清学鉴定、分子生物学方法，近年来，一些新型方法也使得肠道病毒的检测快速化与准确化。 关键词肠道病毒/诊断/分类 1 肠道病毒形态特点 肠道病毒是球形、无包膜、核衣壳20面体立体对称。肠病毒属病毒粒子在酸性pH 下稳定，在病毒制品中可观察到空衣壳，有时可观察到少量（1%）的重颗粒。基因组编码单一的VPg蛋白，但不编码L蛋白。不同肠道病毒及肠道病毒与鼻病毒间整个核苷酸序列一致性大于50%，一种肠道病毒不同株之间整个核苷酸序列的一致性大于75%。病毒主要在肠道细胞中复制，也能在神经、肌肉和其它一些组织中复制。大多数病毒感染无明显症状，病毒感染的临床症状包括轻微脑膜炎、脑炎、肌炎、心肌炎和结缔组织炎。耐酸和脂溶剂，不易被胃酸和胆汁灭活，在污水和粪便中活数月。 2肠道病毒的分类 2.1脊髓灰质炎病毒
此病症的典型临床经过六个阶段（潜伏期、前驱期、瘫痪前期、瘫痪期、恢复期和残留麻痹）。感染期间患者表现为低热及咽痛、咳嗽、腹泻、不安、嗜睡、多汗、脑膜刺激症、肌肉疼痛、皮肤感觉过敏，突发急性弛缓性麻痹等症状，最后多遗留下终生残疾。脊髓灰质炎病毒通过患者的粪便或口腔分泌物传染。人类是脊髓灰质炎病毒的唯一宿主，长期携带病毒的情况（例如无症状，但仍持续排出病毒长达6个月以上）很罕见。服用脊髓灰质炎疫苗（现在我国使用I、II、III型混合糖丸疫苗，是由减毒的脊髓灰质炎病毒制成的）是预防本病的主要措施。消灭脊髓灰质炎最根本的手段是提高人群免疫水平，断绝脊髓灰质炎野毒株在人群中的传播。 脊髓灰质炎病毒分为三个血清型；两种不同抗原：D抗原和C抗原。D（dense，致密）抗原：具有病毒RNA，为完整的病毒颗粒，又称N（native）抗原；C（coreless，无核心）抗原：不含RNA，是D颗粒经56 ℃灭活，RNA释放后形成的无核酸空心衣壳，故又称H（heated）抗原；不同型别病毒C抗原可发生交叉反应，但D抗原无交叉反应； 传播方式主要是粪-口传播，所致疾病是脊髓灰质炎。中毒机理：粪－口途径传播为主—上呼吸道，咽喉，肠道为侵入门户—先在局部粘膜和淋巴结中增殖—入血，形成第一次病毒血症—带有受体的靶组织（脊髓前角细胞、背根神经节细胞、运动神经细胞等）—在靶细胞中再次增殖后形成第二次病毒血症及临床症状。 检测方法第一是微生物学检查，检测方法：病毒分离检查：取咽漱液、粪便等样本，细胞培养出现CPE；血清学诊断：中和试验；病毒核酸测定。第二是防治:口服减毒活疫苗或者注射灭活疫苗. 2.2 柯萨奇病毒 柯萨奇病毒[2]对乳鼠的敏感性很高，根据它们感染乳鼠产生的病灶，柯萨奇病毒可以分为a、b两组。a组有23型病毒，b组有6型病毒。A组病毒：诱发新生乳鼠弥漫性骨胳肌炎，导致驰缓性麻痹。B组病毒：诱发新生乳鼠局灶性骨胳肌炎，导致痉挛性麻痹。通过型特异性抗原，经中和试验。Elisa方法等可以对各型进行鉴定。所有的b组及a组的第9型有共同的组特异性抗原，在b组内病毒之间有交叉反应，但是a组病毒没有共同的组特异性抗原。a组某些型别的型特异性抗原可在37℃引起人类O型红细胞凝集反应。 柯萨奇病毒A型感染潜伏期1-3天，上呼吸道感染，起病急，流涕、咳嗽、咽痛、
YY-T1182-2010核酸扩增检测用试剂(盒)
YY/T 1182-2010 核酸扩增检测用试剂（盒） 1围 本标准规定了核酸扩增检测试剂（盒）【以下简称“试剂（盒）”】的术语和定义、命名和分类、技术要求、试验方法、标识、标签和说明书、包装、运输和贮存等。 本标准适用于核酸扩增检测试剂（盒）的质量控制。核酸扩增检测试剂（盒）应包括核酸提取、核酸扩增及产物分析试剂组份，如核酸扩增检测试剂（盒）不含有核酸提取组份，应由生产企业说明或指定提取试剂（盒）。 本标准不适用于基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突变检测用试剂（盒）及血源筛查的试剂（盒）。 2规性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 21415-2008 体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性 3术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1 聚合酶链反应polymerase chain reaction,PCR 聚合酶链反应或多聚酶链反应是一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。 3.2 PCR杂交（膜上、板上）PCR hybridization 具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）可以通过氢键的方式，按碱基互补配对原则相结合，探针结合于特定核酸序列或PCR产物的杂交过程可以在液相中进行，也可以将其中一个固定在固相载体上进行。 3.3 PCR 电泳 PCR electrophoresis 根据PCR产物分子质量和所带电荷的不同在电场中进行分离的技术。 3.4实时荧光PCR real-time polymerase chain reaction,PCR
核酸检测技术的应用
核酸检测技术的应用 1资料与方法 1.1检测方法及判定规则305912份全血标本和单采血小板标本进行常规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别进行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本进行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling进行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求进行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1单检模式及混检模式下的NAT结果303616人份标本进行核酸检测，其中112394人份采用单人份核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 2.2全血标本和单采血小板标本ELISA检测结果305912份全血标本和单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-
植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
肠道病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则
附件4 肠道病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对肠道病毒核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是针对肠道病毒核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 （一）肠道病毒简介 肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，能引起人类致病的肠道病毒有多种，包括人肠道病毒A、B、C、D组，有100多个血清型。人类肠道病毒主要包括：脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组（Coxsackievirus A，CA）、柯萨奇病毒B组（Coxsackievirus B，CB）、人肠道致细胞病变孤儿病毒（简称埃可病毒）（Echovirus ECHO）、新肠道病毒等。新肠道病毒为1969年后陆续分离到的，例如新型肠道病毒71型（EV71）等。近年来，鼻病毒（Rhinovirus）被划入肠道病毒属，鼻病毒包括A、B、C组，已经先后分离得到140多个血清型。 肠道病毒为球形，直径28～30nm，核衣壳二十面体立体对称，无包膜。病毒衣壳由60个相同的壳粒组成，排列为12个五聚体，每个壳粒由VP1、VP2、VP3和VP4四种蛋白组成。 肠道病毒基因组为单股正链RNA，全长约为7.2～8.4kb，基因组分为三部分，两端为保守的非编码区，在肠道病毒中同源性非常显著，其中5’端非编码区常作为肠道病毒通用检测试剂检测的靶基因。中间为连续开放读码框，包含结构蛋白编码区和非结构蛋白编码区，结构蛋白编码区依次编码VP4、VP2、VP3和VP1共４个衣壳蛋白。衣壳蛋白不仅含有抗原决定位点，而且还有决定病毒组织嗜性的受体识别位点，介导病毒与细胞的吸附和进入。非结构蛋白编码区主要负责编码与病毒基因组复制以及病毒颗粒包装等有关的蛋白及酶，它们在RNA复制、细胞器修饰，细胞裂解及形态形成中发挥各自不同的功能。 （二）肠道病毒致病性 肠道病毒在肠道中增殖，但通常不引起肠道疾病。90%以上肠道病毒感染为隐性感染，或仅出现轻微的上呼吸道感染或流感样症状。不同肠道病毒可以引起相同的临床症状，同一种病毒可引起几种不同的临床疾病。 肠道病毒的传染源为患者和无症状的病毒携带者。传播途径主要是粪-口途径，也可通过呼吸道传播，夏秋季是一年之中的主要流行期。肠道病毒以上呼吸道、咽喉和肠道为侵入门户，先在局部黏膜和咽、扁
核酸检测试剂生产及质量控制技术指导原则
附件3： 体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则 ——核酸检测试剂生产及质量控制技术指导原则 核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段，从而筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的扩增反应（TMA）等。核酸检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域。为规范核酸检测试剂的生产及质量控制，特制定本技术指导原则。国家药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。 一、基本要求 （一）核酸类检测试剂生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。 （二）核酸类检测试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境（实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染），获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围作出明确规定，并经国家药品管理部门批准。
（三）核酸类检测试剂在研制时，应当遵循科学、规范的原则，引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂须设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。 （四）核酸类检测试剂生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 （五）生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。 二、原材料 应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等的相关研究资料。如果主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检验报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。如果主要原材料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无DNase和RNase污染。 1．dNTPs 脱氧三磷酸核苷，核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。应为HPLC纯、PCR级，无DNase和RNase污染。-20℃保存。 2．引物 由一定数量的核苷酸构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人
新冠病毒核酸检测技术人员培训答案(干货)
新冠病毒核酸检测技术人员培训 答案 1.新型冠状病毒感染的重症病 例优先采集： A:上呼吸道标本 B：下呼吸道标本 C：尿标本 D：全血标本 E：血清标本 2。新型冠状病毒采集的血液标本应尽量釆集发病后 （）内的急性期抗凝血： Ａ:3天 B：5天 C:7天 Ｄ:1０天 E:14天 3．新型冠状病毒感染用于病毒分离和核酸检测的标本２4小时内无法检测的标本则应置于（）或以下保存： A:－3０℃ B:—４0℃ C:－５0℃ D：—60℃ E：—70℃ ４．新型冠状病毒血清标本可在4℃存放: A：3天
B:５天 C:７天 Ｄ：1０天 E：1４天 5。新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于： A：A类 B：B类 Ｃ:Ｃ类 D：Ｄ类 Ｅ:E类 1。新型冠状病毒属于 A:α属 B:β属 C:γ属 D：δ属 E：以上都不是 2.下列哪种消毒剂不能有效灭活病毒 A:乙醚 B:75％乙醇 C:氯己定 Ｄ：过氧乙酸 E：氯仿 3。关于新型冠状病毒标本的包装，下列说法正确的是Ａ：标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装 B：所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧 Ｃ：容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期
Ｄ:将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本 Ｅ:以上都正确 ４。关于新型冠状病毒的标本保存，下列说法不正确的是 A：能在24小时内检测的标本可置于4℃保存 B:2４小时内无法检测的标本则应置于—70℃或以下保存 C：血清可在4℃存放３天，-20℃以下可长期保存 D：应设立专库或专柜单独保存标本 E：标本运送期间可反复冻融 5.２019新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装对应的联合国编号为 A：ＵN2814 B：UＮ１602 Ｃ:UＮ3373 D:ＵN9284 E:ＵN１60５ 1.设计有缓冲间的实验室是 A：BＳＬ-1实验室 B:普通型BSL—2实验室 C：加强型BSL-2实验室 D：所有级别的实验室 2.BSL－3实验室辅助工作区应至少包括 Ａ:监控室、清洁衣物更换间和淋浴间 B:监控室、清洁衣物更换间和防护服更换间 C：监控室、清洁衣物更换间和缓冲间 Ｄ：监控室、防护服更换间和缓冲间 3。工作人员应穿着配有生命支持系统的正压防护服的实验室是 A：普通型BSL-2实验室