肠道病毒TaqMan荧光定量RT_PCR法快速检测
3基金项目:浙江省科委重点项目(2001136) 作者单位:浙江省疾病预防控制中心,杭州310009 作者简介:严菊英(1960-),女,浙江杭州人,副主任技师,大专,主
要从事病毒分子生物学研究。
文章编号:100120580(2007)0720818203 中图分类号:Q 93914 文献标志码:A
【论 著】
肠道病毒T aqMan 荧光定量RT 2PCR 法快速检测3
严菊英,卢亦愚,徐昌平,史雯,龚黎明,葛琼
摘 要:目的 建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT -PCR 方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验
室应急检测。方法 根据G enBank 登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan 探针;对荧光RT -PCR 反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果 该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定(TCID 50);可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h 左右。结论 所建立的TaqMan 荧光定量RT 2PCR 是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。
关键词:荧光定量RT 2PCR ;TaqMan 探针;肠道病毒;临床标本
R apid detection of enterovirus with T aqMan real 2time RT 2PCR YA N J u 2ying ,L U Yi 2yu ,XU Chang 2ping ,et al.Insti 2tute of V irology ,Zhejiang Provincial Center f or Disease Cont rol and Prevention (Hangz hou 310009,China )
Abstract :Objective T o establish a specific ,sensitive and rapid method for detecting enterovirus nucleic acid with quantitative real 2time RT 2PCR and laboratory diagnosis for rapid response of enterovirus outbreaks.Methods Based on the alignment result of enterovirus sequences downloaded from G enBank ,the conserved region was used for the design of primers and T aqMan probe.The re 2action conditions were optimized using different concentrations of primers and probe.S pecificity and sensitivity evaluations of the T aq 2Man real 2time RT 2PCR were als o https://www.360docs.net/doc/f212760899.html,boratory diagnoses of s ome clinical specimens from suspected cases of enterovirus infec 2tion were conducted using the real 2time RT 2PCR method.R esults The real 2time RT 2PCR was proved to be a high specificity method which could detect enteroviruses such as poliovirus ,coxsackie virus ,EHCO virus and s o on.Cross 2reactivity with mumps ,measles ,rubella or Japanese encephalitis virus was not observed.The sensitivity for detection was 0.1TCID 50.The detection of en 2teroviruses could be performed using nucleic acid directly extracted from cerebrospinal fluid ,herpes fluid or stool samples of suspected cases.The time duration was about 3h from the viral RNA extraction to the completion of detection.C onclusion The established T aqMan quantitative real 2time RT 2PCR was a specific and sensitive method for rapid detection of enteroviruses.It could be used for early laboratory diagnosis in response to enterovirus epidemics.
K ey w ords :real 2time RT 2PCR ;TaqMan probe ;enterovirus ;clinical samples
肠道病毒(EV )属于小RNA 病毒科,根据血清学可以分为脊灰病毒、柯萨奇、埃可病毒和肠道病毒68～71型,共67个血清型。肠道病毒可引发众多疾病,并可暴发流行,导致死亡,严重危害人类健康。浙江省近几年由肠道病毒引起的无菌性脑
炎〔1,2〕、手足口病〔3〕、急性出血性结膜炎和新生儿急性心肌炎
等暴发疫情频频发生。为了迅速查明病因,及时采取控制措施,亟需进行实验室快速诊断,但肠道病毒传统的检测方法是病毒分离和中和法定型,不仅繁琐费时,而且无法对所有的血清型进行鉴定,更不能对一些抗原变异株或新型别毒株进行鉴定。本研究建立的肠道病毒荧光定量RT 2PCR 方法,为肠道病毒实验室应急检测提供了有效的分子生物学检测手段。
1 材料与方法
111 病毒标准株与临床标本 脊髓灰质炎病毒Sabin Ⅰ～Ⅲ型
疫苗株(北京生物制品研究所);柯萨奇、埃可和肠道病毒70～71型等标准株(中国医学科学院);麻疹、风疹、腮腺炎、乙型脑炎等毒株(中国疾病预防控制中心)。临床样本来源于浙江省近几年各地报告的疑似肠道病毒感染疫情如无菌性脑炎、手足口病、疑似脊髓灰质炎和急性出血性结膜炎等患者的脑脊液、疱疹液、粪便和眼拭子等,样本采集后常规送至实验室。
112 引物与探针 从G enBank 上下载不同年份和地区的肠道病毒基因序列,用生物学软件进行同源性比较,在5′非编码保守区设计特异性引物和TaqMan 探针,序列为EV 2F :5′2
CTGYR GCGG AACCG ACTAC 23′;
EV 2R :
5′2A TTGTCAC 2
CA TAA GCA GCCA 23′;EV 2Probe :5′FAM 2TTGGGTGTCCGT 2GTTT 2M G B 23′。引物和探针委托上海基康生物工程有限公
司合成。
113 病毒定量标准与病毒RNA 的提取 以Sabin Ⅲ型疫苗
株为标准毒株,用人横纹肌瘤细胞(RD )进行病毒效价滴定
(107,5TCID 50/ml )后作为参考株,将其稀释TCID 50分别为1000,100,10,1,011,0101于每个反应管。病毒RNA 的提取
按试剂盒说明书(德国Q IA GEN 公司的RNeasy Mini K it )。
114 荧光RT -PCR 反应体系和条件的优化 试验在以相
同浓度阳性核酸为模板的反应体系中,引物浓度从100～900μmol/μl ,探针浓度从50～300μmol/μl ,采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度,在60℃进行单点荧光检测,根据荧光RT -PCR 反应的最低荧光阈值(Ct 值)和最高荧光强度增加值
(△Rn )选择最佳引物和探针浓度。试剂盒采用(A K ARA 公
司)荧光RT -PCR K it ,按试剂盒说明书操作。
115 RT 2PCR 反应 肠道病毒RT -PCR 通用引物参照文
献〔4〕
,EV1:5′2AAG CACTTCTGTTTCCC 23′
(166-182),EV2:5′2ATTCAGGGG CCGG AGG A 23′
(4472463),扩增片断297bp 。采用RT 2PCR 试剂盒(美国Roche 公司)进行扩增,反应体系为
20μl 。其中5×RT 2PCR 缓冲液4μl ,4种脱氧核苷酸(dNTP )混
合物(10mm ol/L )116μl 二硫疏糖醇(DTT )(100mm ol/L )110μl ,
RNase 抑制剂(5u/μl )014μl ,20μm ol/L 上游引物与下游引物各015μl ,T aq 酶和逆转录酶混合物(5u/μl )014μl ,模板RNA 10μl ,最后用焦碳酸二乙脂(DEPC )水补足至20μl 。反应条件
为50℃30min ,94℃2min 进行逆转录和变性,然后94℃30s ,
55℃30s ,68℃1min 进行扩增,35个循环后转入68℃7min ,
取8μl 产物电泳后判断有无特异性条带。
116 荧光RT 2PCR 特异性、敏感性和重复性试验 选择肠道
病毒:脊髓灰质炎病毒Ⅰ～Ⅲ型,柯萨奇病毒A16,A24,B1,B3,
B5,埃可病毒7,20,30型和肠道病毒71型,以及选择容易引起
脑炎等症状的非肠道病毒,麻疹、风疹、腮腺炎、乙脑、
登革热病毒等,对上述2组病毒分别提取核酸,用肠道病毒荧光RT 2PCR 方法进行检测,验证方法的特异性。对已标定TCID 50的肠道病毒Sab in Ⅲ型(107,5TCID 50/ml )稀释后分别提取RNA ,平行进行荧光RT 2PCR 与RT 2PCR 反应,比较其灵敏度。此外,对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测,得到的Ct 值采用
stata 810软件计算标准差,验证方法的重复性。
117 统计分析 荧光RT 2PCR 法的Ct 值采用Stata 810软
件计算其 x ±s 。
2 结 果
211 荧光RT 2PCR 反应体系及条件 采用一步法荧光RT 2PCR 试剂盒,总反应体系为25μl 。矩阵法优选后引物最佳浓
度均为0164μmol/L ,探针最佳浓度为0130μmol/L ,模板RNA 10μ1,最后用DEPC 水补至25μl 。用MJ Research Op 2
tion 2荧光检测系统或Roche Lightcycle 荧光检测系统进行检
测,反应参数为:45℃30min 逆转录,94℃变性2min ,以93℃
15s ,60℃1min 扩增40个循环,在60℃进行单点荧光检测,
可获得最低Ct 值和最高荧光强度。
212 特异性试验 本研究建立的荧光RT 2PCR 方法对肠道
病毒具有较好的特异性,可检测PVl -3,Cox A16、A24、Bl 、
B3、B5,ECH07、20、30,EV70～71型等不同群的肠道病毒,而
与腮腺炎、乙脑、登革热、麻疹、风疹病毒等均无交叉反应。213 敏感性试验(图1) 对肠道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株,采用RD 细胞进行病毒效价测定(107,5TCID 50/ml ),然后稀释成
1000,100,10,1,0.1,0.01TCID 50,提取病毒RNA ,分别用荧
光RT -PCR 与常规RT -PCR 方法进行检测,结果荧光RT
-PCR 方法检测敏感性达到0.1TCID 50,比常规RT -PCR
方法的灵敏度1.0TCID 50高10倍左右。
A ～E :1000,100,10,1,0.1TCID 50
图1 荧光PT -PCR 法检测肠道病毒的灵敏度
214 重复性试验(表1) 肠道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株按10
倍梯度稀释成4个不同的浓度,对每一个浓度的样本作5个
重复检测,结果不同核酸浓度各自的检测Ct 值标准差在
0123～0165之间,具有较好的重复性。
表1 荧光RT -PCR 法检测肠道病毒核酸的重复性试验
病毒稀释度
Ct 值1
23 x ±s
10-321.22621.14721.19221.188±0.039610-424.31924.38024.37624.358±0.034110-527.56328.40028.06528.009±0.421310-6
33.472
32.640
32.471
32.861±0.5358
215 样本的检测 从浙江省各地报告的病毒性脑炎、手足口
病、急性出血性结膜炎和急性心肌炎等等疑似肠道病毒感染疫情患者的脑脊液23份、粪便20份、疱疹液8份和眼拭子7份等临床样本中直接提取病毒RNA ,用建立的荧光RT -PCR 方法检测肠道病毒核酸。结果显示,58份样本中肠道病毒核酸阳性的有32份。同时对上述样本采用RD 和Hep -2细胞进行肠道病毒分离,结果病毒分离阳性的24份,其余8份荧光
RT 2PCR 方法阳性而病毒分离阴性的样本,采用肠道病毒通用
引物直接从样本中提取病毒核酸后进行1次或2次RT 2PCR 扩增相应片段、测序和BLAST 比对,最终确定为肠道病毒。
3 讨 论
肠道病毒是最常见感染人类的病毒,可导致多种疾病,临床表现多样,近几年由肠道病毒引起的暴发疫情时有发生〔1-3,5〕
。对该类疫情尽早作出实验室确诊是及时采取防控
措施与对症治疗的关键。
近几年发展起来的以特异性荧光探针为特点的荧光定量
PCR 技术,实行完全闭管式操作,不仅能大大减少扩增产物
污染的机会,而且较常规RT 2PCR 技术,无诊从敏感性、特异性与速度上都更具有优势,当然它对引物和探针的设计也提
出了更高的要求〔
6-8〕
。我们从美国的NCBI 与日本的DDBJ
基因库上下载了近20年来世界各地的肠道病毒株,对其进行了同源性比较,在肠道病毒5′端非编码区设计若干对引物与
Taqman 探针,对该区域进行特异性扩增,从中筛选出最佳的
引物和探针,并对荧光RT -PC 方法进行优化,验证其敏感性、特异性和重复性。经肠道病毒标准株与临床样本的检测比较,该方法具有高特异性,能检测脊髓灰质炎病毒Ⅰ～Ⅲ型、柯萨奇病毒Bl 、B3、B5,埃可病毒7、20、30型及新型肠道病毒70～71型等多个血清型别的肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙脑、登革热病毒均无交叉反应,而且比常规RT 2PCR 和病毒分离法更敏感、快速和简便。通常肠道病毒的RT 2
PCR 检测敏感度在110TCID 50左右,从病毒核酸提取、RT 2PCR 反应与电泳,整个过程大约需6～7h 左右,而采用本方
法从核酸提取至完成检测,仅需3h 左右,能同时完成多个疑似患者临床样本的高通量检测,敏感度达011TCID 50,比普通
PCR 的灵敏度高10倍左右,可直接从无菌性脑炎、手足口
病、急性出血性结膜炎患者的脑脊液、粪便、疱疹液和眼拭子等临床样本中检测肠道病毒核酸,而且核酸阳性的样本被肠道病毒分离和基因测序的结果得到进一步的证实。我们用建
立的新方法,对近几年我省疑似肠道病毒感染引起的应急疫情进行实验室早期快速诊断,获得了令人满意的结果。
参考文献
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-37.
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收稿日期:2006210228(蔡天德编辑 孔繁学校对)
3基金项目:湖北省科技攻关项目(2003AA301C22) 作者单位:华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境医学研究
所,武汉430030
作者简介:舒柏华(1957-),男,湖北黄冈人,教授,硕士,研究方
向:生物医学检测技术。
文章编号:100120580(2007)0720820202 中图分类号:Q 632 文献标志码:A
【实验研究】
PCR 产物生物发光分析技术研究3
舒柏华,王胜利,何丽芸,徐顺清
摘 要:目的 基于水母发光蛋白生物发光分析技术建立一种PCR 产物定量检测技术。方法 利用RT -PCR 对
CK 19-mRNA 进行放大,PCR 引物的5’端用生物素标记,然后用交联了地高辛寡核苷酸探针与目标生物素化的DNA 模板杂交。杂交复合物与包被在微孔板上的链亲合素结合,加入标记了水母发光蛋白的地高辛抗体与地高辛特异结合,再加入钙离子激发水母发光蛋白发光,发光强度正比于CK 19-mRNA 的量。结果 探测灵敏度可达22am ol/L 的RT -PCR 产物。结论 该定量检测技术是一种灵敏的、可靠的、非放射性的微量CK 19-mRNA 定量方法。
关键词:CK19-mRNA :逆转录聚合酶链反应;生物发光
Development of a method for qu antitative determining PCR products by bioluminescent assay S HU B ai 2hua ,W A N G S heng 2li ,HE L i 2yun ,et al.Institute of Environmental Medicine ,School of Public Health ,Tongji Medical College ,Huaz hong U niversity of Science and Technology (W uhan 430030,China )
Abstract :Objective A bioluminescence -based immunoassay was established for the quantitation of PCR products.Methods It amplified CK19-mRNA by using RT -PCR.The primer in the PCR reaction was labeled with a 5’biotin molecule.A digoxigenin -conjugated oligonucleotide probe was hybridized to the target biotin -labeled DNA template.The hybridized duplex was captured onto a streptavidin -coated microtiter plate.Digoxigenin reacts with digoxigenin -specific an 2tibodies conjugated with the photoprotein aequorin added.The amount of s pecific DNA captured onto the plate was quantitat 2ed by triggering the bioluminescence reaction through the addition of calcium ions.R esults This technique detected as low as 22amol/L of amplified CK19-mRNA products.Conclusion This technique is a sensitive ,reliable and non -radioactive method for quantitative detection of trace CK19-mRNA.
K ey w ords :CK19-mRNA ;reverse trascriptase -polymerase chain reaction ;bioluminecence
目前,聚合酶链反应(PCR )产物通常采用目测、吸光度测量、放射自显影或液体闪烁计数技术来定量。这些技术均为半定量分析,较繁琐,有的要用到放射性物质。近年来,基于杂交分析技术已建立了荧光、比色、化学发光、电化学发光定量方法。比色免疫分析和化学发光分析的稳定性较差,其他分析技术均需利用磁珠,这大大地增加了分析测试的成本〔1-4〕。本研究利用水母发光蛋白建立的CK19-mRNA 逆转录PCR 产物定量检测方法,所需仪器简单易得,可方便地
对微弱生物发光强度进行测量〔5〕
。该方法具有灵敏度高、简便、非放射性等优点。1 材料与方法111 引物、探针及标准品的制备 采用PCR 扩增特异性CK 19片段(754bp ),PCR 反应上游引物系列:5′-TCCCGC 2G ACTACA GCCACTACTACACG ACC -3′;下游引物系列:5′
-CGCG ACTTG A TGTCCA TG A GCCGCTGGTAC -3′,探针
系列:5′-GGTCGTGTA GTA GTGGCTGTA GTCGCG O G A -3′;以上序列的5′-端均生物素化,探针5′-端标记了地高辛,引物和探针由我们和上海博亚生物技术有限公司共同设计,由该公司合成和修饰。
利用本室保存的含CK19全编码序列的cDNA 质粒,按常规CaCl 2方法制备J M109(本室保存)感受态细胞,在氨苄青霉素(50μg/ml )平板上筛选阳性转化菌。挑取单个克隆,用含氨苄青霉素(50μg/ml )的培养基扩增。采用超纯质粒DNA 纯化试剂盒(维特杰公司生产)抽提细菌质粒。用荧光法进行定量,根据分子量计算cDNA 的摩尔浓度和拷贝浓度。最终制备成60fmol/μl 标准原液,-80℃
冻存。112 包被微孔板 按Xiao L H 提供的方法包被微孔板〔6〕
;每孔加入100μl 用磷酸盐缓冲液(PBS )0101mol/L ,p H 712,稀释的浓度为2mg/ml 生物素化的牛血清白蛋白(美国Sigma 公司)4℃过夜。用洗液(含0105%Tween 20的PBS )洗3次,再加入链亲合素(美国Promegal 公司)饱和液100μl ,37℃温育1h 。饱和液中含有10μg/μl 链亲合素、015%明胶和0115%
实时荧光定量PCR原理和实验
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
肠道病毒等检测临床意义
肠道病毒71型/柯萨奇病毒A16型/ 通用性肠道病毒RNA联合检测临床意义 手足口病是一种由数种肠道病毒引起的传染病，主要侵犯5岁以下的宝宝。手足口病常常表现为: 患儿口腔内颊部、舌、软腭、硬腭、口唇内侧、手足心、肘、膝、臀部和前阴等部位，出现小米粒或绿豆大小、周围发红的灰白色小疱疹或红色丘疹。疹子"四不像":不像蚊虫咬、不像药物疹、不像口唇牙龈疱疹、不像水痘。口腔内的疱疹破溃后即出现溃疡，常常流口水，不能吃东西。临床上不痒、不痛、不结痂、不结疤。患儿尿黄。重疹患儿可伴发热、流涕、咳嗽等症状。手足口病一般一周内可康复，但如果此前疱疹破溃，极容易传染。手足口病具有流行强度大、传染性很强、传播途径复杂特点。病毒可以通过唾液飞沫或带有病毒之苍蝇叮爬过的食物，经鼻腔、口腔传染给健康儿童，也可因直接接触而传染。 手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年新西兰首次报道该病。1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出手足口病命名。早期发现的手足口病的病原体主要为Cox A16型，1969年EV71在美国被首次确认。此后EV71感染与Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。 20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行，1975年保加利亚报告病例750例，其中149人致瘫，44人死亡。1994年英国发生一起由Cox A16引起的手足口病暴发，患者大多为1-4岁婴幼儿，大部分病人症状较轻。英国1963年以来的流行病学数据显示，手足口病流行的间隔期为2-3年。20世纪90年代后期，EV71开始东亚地区流行。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4-8月共有2628人发病，4-6月有29例病人死亡。日本是手足口病发病较多的国家，历史上有过多次大规模流行，1969~1970年的流行以CoxA16感染为主，1973和1978年的2次流行则由EV71引起，1997~2000年手足口病在日本再度活跃，EV71、CoxA16病毒均有分离。20世纪90年代后期，EV71开始肆虐东亚地区。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4~8月共有2628例发病，仅4~6月就有29例病人死亡，死者平均年龄1.5岁。1998年我国台湾省发生EV71引起的手足
肠道病毒
肠道病毒（enterovirus） 1.肠道病毒： （1）属于小RNA病毒科中的肠道病毒属成员，由粪-口途径传播。 （2）虽然感染胃肠道，但却很少引起胃肠道疾病，其靶器官以神经系统、肌肉和其他系统为主，引起脊髓灰质炎、脑膜炎、脑膜脑炎、心肌炎、心周炎、手足口病等疾病。 （3）一种病毒血清型可引起几种不同的疾病综合征，而几种不同的血清型又可引起同一种疾病。 2. 肠道病毒种类与分型 （1）脊髓灰质炎病毒(poliovirus)：分1、2、3三型 （2）柯萨奇病毒(coxsackie virus) ：分A、B两组；（A组：包括A1~A22、A24型；B组：包括B1~B6型；） （3）埃可病毒(ECHO virus)：包括1~9、11~27、29~33型 （4）新型肠道病毒：包括68、69、70、71型 3. 脊髓灰质炎病毒：①是引起脊髓灰质炎的病原体； ②脊髓灰质炎又称为小儿麻痹症，是一种危害中枢神经系统的传染病。（1）临床意义： ①传播途径：经粪-口途径感染，潜伏期2~10天 ②传染源：患者及无症状隐性感染者 ③临床表现：无症状感染、顿挫型脊髓灰质炎、无麻痹性脊髓灰质炎、麻痹型脊髓灰质炎1~2% （2）致病机制： （3）生物学特性： ①病毒近似球形，直径27～30nm，核心为单正链RNA，约7.2～8.5kb，核衣壳呈20面体立体对称，无包膜。 ②衣壳含4种蛋白（VP1～VP4），VP1、VP2和VP3暴露在病毒体表面，是抗体结合位点；VP4在核心内部与RNA结合。 （4）培养特性：
①细胞：人胚肾、人胚肺、猴肾细胞、Hela、HEp-2、Vero等 ②最适温度：36～37℃CPE：培养3～5天出现 ③抵抗力较强 （5）微生物学检验： 1.标本采集与处理标本：粪便、发病早期的咽部分泌物等 2.病毒分离与鉴定：人或猴肾原代细胞、Hela、V ero等细胞24～48小时可出现典型CPE 3.抗原检测：ELISA法 4.核酸检测：用RT-PCR等方法 5.抗体检测：单份血清检测IgM，双份血清检测抗体效价升高4倍 （6）减毒活疫苗：①剂型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型；②用法：口服（温水）； ③机理：产生分泌型IgA，阻止病毒入血； 4. 柯萨奇病毒（Coxsackievirus）：柯萨奇病毒是1948年在美国纽约州柯萨奇镇，从一名疑似脊髓灰质炎患者粪便中用接种乳鼠的方法首次分离出的，因而得名。 （1）分类：根据对乳鼠引起的病理变化分为： A组：可使乳鼠产生广泛性骨骼肌炎，引起驰缓性麻痹。包括23个血清型 B组：可引起乳鼠局灶性肌炎及痉挛性麻痹，并常有棕色脂肪坏死、脑炎和心肌炎。包括6个血清型 （2）临床意义： A. 传染源：患者或无症状带毒者 B. 传播途径：主要经粪一口途径，亦可由呼吸道传播。 C. 所致疾病：因其可侵犯呼吸道、胃肠道、肌肉、皮肤、心脏或中枢神经系统等多种组织器官，导致临床表现多样化。较重要的有：类脊髓灰质炎麻痹、无菌性脑膜炎、出疹性发热病、急性心肌炎和心包炎、流行性肌痛、疱疹性咽峡炎。 （3）生物学特性 A. 病毒呈球形，直径为17～30nm B. 核心为线状单正链RNA，基因组长约7.5kb C. 核衣壳呈20面体立体对称，无包膜 D. 抗原性复杂，不仅型别多，而且型内还有抗原变异。 （4）微生物学检验：检查程序与脊髓灰质炎病毒基本相同。但应注意下列问题： ①必须采用乳鼠接种法分离病毒，以免丢掉那些在细胞培养上不能增殖的病毒； ②由于人群中常有柯萨奇病毒携带者，因而从咽部或粪便取材分离出的病毒，不一定是病原因子；只有取病人双份血清做中和试验，测出特异性抗体有4倍或4倍以上增高时，才能确定病因关系。若从CSF、心包液或疱疹液分离出病毒，则可直接做出诊断； ③由于病毒型别多，很难用检测患者血清中特异性抗体的方法来判断是由哪一型病毒引起的疾病。因而血清学诊断法只适用于集体发病者。以分离株病毒为抗原，对流行区的病人或隐性感染者进行检测。 5. 埃可病毒（ECHOV）：埃可病毒是1951年脊髓灰质炎流行期间从患者粪便中分离出的能使培养细胞发生病变的非脊髓灰质炎病毒。因当时不了解其与疾病关系，故命名为人类肠道细胞病变孤儿病毒(ECHOV)简称之为埃可病毒（ECHOV）。 （1）临床意义： ①ECHOV对人的致病性与柯萨奇病毒类似,一岁以下婴儿由ECHOV引起的中枢神经系统感染，常导致神经后遗症和智力障碍，在基本消灭了脊髓灰质炎的国家已引起重视。 ②ECHOV生物学特性和微生物学检验方法与柯萨奇病毒相似。 6. 新型肠道病毒：1969年以后分离出的肠道病毒新血清型，不再将其归属于柯萨奇病毒和
荧光比率探针及其应用研究进展
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
【定量数据分析】荧光定量PCR_完整版
08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
2008 年螺旋课堂的课程计划！
2007 年已悄然逝去，2008 年已向我们扑面而来。08 年是共和国发展的关键 一年，也是螺旋网抓住机遇，加快发展的关键一年。今年螺旋网将为各位螺友提 供大量的关于生命科学的讨论主题，让各位螺友对生命科学的灵感相互碰撞，达 到共鸣。还有螺旋网将联合一批一线生命科学人员为您的研究保驾护航。同时还 将为大家提供各种资源包括各类电子书、生命科学研究进展、生物软件等。 为此，螺旋课堂 08 年的课程将围绕着最新的研究方法、研究进展进行课程 设置。具体安排如下： 第一期：荧光定量 PCR 技术 第二期：原位杂交技术 第三期：引物的设计原理及方法 第四期：BAC 库的构建技术 第五期：手把手教你进行序列分析
..................... 除以上技术外，欢迎大家点播！
以上讲座的具体时间详见论坛通知!
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肠道病毒标本的采集运送保存和实验室检测指南
肠道病毒标本的采集运送保存和实验室检测指南 为及时、科学地采集和运送手足口病标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，特制定本指南。 一、采样液 1．pH7.4～7.6 HANK氏平衡盐（含0.5%的牛血清白蛋白）。 2．pH7.4～7.6的Eagle’s MEM培养液（含0.5%的牛血清白蛋白）。 二、标本种类及采集 1．咽拭子：用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的采样管中。 2．患者粪便：采集5～10g粪便置于15ml空采样管中。 3．血清标本：须采集急性期、恢复期双份血清。用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml 无菌螺口塑料管中。 标本采集好后，应在采样管上做好标记，并注明标本的种类，同时及时填写采样表，要求信息完整。 三、标本保存及运送 标本应在冷藏的条件下尽快进行送实验室检测，24小时内能检测的标本可置于4℃保存，24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存。如无－70℃保存条件，则于－20℃冰箱暂存。血清可在4℃存放3天、-20℃以下长期保存。标本运送期间应避免反复冻融。 四、标本的实验室检测 1．核酸检测：方法包括RT-PCR和Real-Time RT-PCR，首先使用肠道病毒
通用引物进行快速筛查，得到阳性结果后使用EV71、CoxA16等引物和探针进行分型。 2．病毒分离及鉴定：采用RD、Hep2和Vero细胞进行病毒的分离，第一代7日内仍然为阴性的标本需继续盲传一代。病毒鉴定采用中和试验（NT）和间接免疫荧光法（IFA）。 3．血清学检测：采用组合血清进行血清中和试验，双份血清具4倍增长才具有诊断意义。
实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
肠道病毒的分类与检测
肠道病毒的分类与检测 摘要 肠道病毒可引发多种感染，并且发病以综合症出现，一种综合症可有不同病毒所引起，同一种病毒可以导致不同综合症是肠道病毒感染的普遍现象。目前除脊髓灰质炎外，尚无疫苗可供预防，是当前严重影响人类健康的重要病原之一。肠道病毒主要经粪一口或呼吸道传播，所以对肠道病毒感染作出准确、及时的诊断是非常必要的。肠道病毒（Enterovirus）是小RNA病毒科，有67个血清型。人类肠道病毒包括：脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus）、埃可病毒（Echo）、甲型肝炎病毒以及新型病毒。目前常用的检测肠道病毒的方法有病毒分离培养、血清学鉴定、分子生物学方法，近年来，一些新型方法也使得肠道病毒的检测快速化与准确化。 关键词肠道病毒/诊断/分类 1 肠道病毒形态特点 肠道病毒是球形、无包膜、核衣壳20面体立体对称。肠病毒属病毒粒子在酸性pH 下稳定，在病毒制品中可观察到空衣壳，有时可观察到少量（1%）的重颗粒。基因组编码单一的VPg蛋白，但不编码L蛋白。不同肠道病毒及肠道病毒与鼻病毒间整个核苷酸序列一致性大于50%，一种肠道病毒不同株之间整个核苷酸序列的一致性大于75%。病毒主要在肠道细胞中复制，也能在神经、肌肉和其它一些组织中复制。大多数病毒感染无明显症状，病毒感染的临床症状包括轻微脑膜炎、脑炎、肌炎、心肌炎和结缔组织炎。耐酸和脂溶剂，不易被胃酸和胆汁灭活，在污水和粪便中活数月。 2肠道病毒的分类 2.1脊髓灰质炎病毒
此病症的典型临床经过六个阶段（潜伏期、前驱期、瘫痪前期、瘫痪期、恢复期和残留麻痹）。感染期间患者表现为低热及咽痛、咳嗽、腹泻、不安、嗜睡、多汗、脑膜刺激症、肌肉疼痛、皮肤感觉过敏，突发急性弛缓性麻痹等症状，最后多遗留下终生残疾。脊髓灰质炎病毒通过患者的粪便或口腔分泌物传染。人类是脊髓灰质炎病毒的唯一宿主，长期携带病毒的情况（例如无症状，但仍持续排出病毒长达6个月以上）很罕见。服用脊髓灰质炎疫苗（现在我国使用I、II、III型混合糖丸疫苗，是由减毒的脊髓灰质炎病毒制成的）是预防本病的主要措施。消灭脊髓灰质炎最根本的手段是提高人群免疫水平，断绝脊髓灰质炎野毒株在人群中的传播。 脊髓灰质炎病毒分为三个血清型；两种不同抗原：D抗原和C抗原。D（dense，致密）抗原：具有病毒RNA，为完整的病毒颗粒，又称N（native）抗原；C（coreless，无核心）抗原：不含RNA，是D颗粒经56 ℃灭活，RNA释放后形成的无核酸空心衣壳，故又称H（heated）抗原；不同型别病毒C抗原可发生交叉反应，但D抗原无交叉反应； 传播方式主要是粪-口传播，所致疾病是脊髓灰质炎。中毒机理：粪－口途径传播为主—上呼吸道，咽喉，肠道为侵入门户—先在局部粘膜和淋巴结中增殖—入血，形成第一次病毒血症—带有受体的靶组织（脊髓前角细胞、背根神经节细胞、运动神经细胞等）—在靶细胞中再次增殖后形成第二次病毒血症及临床症状。 检测方法第一是微生物学检查，检测方法：病毒分离检查：取咽漱液、粪便等样本，细胞培养出现CPE；血清学诊断：中和试验；病毒核酸测定。第二是防治:口服减毒活疫苗或者注射灭活疫苗. 2.2 柯萨奇病毒 柯萨奇病毒[2]对乳鼠的敏感性很高，根据它们感染乳鼠产生的病灶，柯萨奇病毒可以分为a、b两组。a组有23型病毒，b组有6型病毒。A组病毒：诱发新生乳鼠弥漫性骨胳肌炎，导致驰缓性麻痹。B组病毒：诱发新生乳鼠局灶性骨胳肌炎，导致痉挛性麻痹。通过型特异性抗原，经中和试验。Elisa方法等可以对各型进行鉴定。所有的b组及a组的第9型有共同的组特异性抗原，在b组内病毒之间有交叉反应，但是a组病毒没有共同的组特异性抗原。a组某些型别的型特异性抗原可在37℃引起人类O型红细胞凝集反应。 柯萨奇病毒A型感染潜伏期1-3天，上呼吸道感染，起病急，流涕、咳嗽、咽痛、
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价
肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）属于小 RNA 病毒科肠道病毒属，为危害程度仅次于脊髓灰质炎病毒的嗜神经性肠道病毒，可引起5岁以下儿童手足口病（Hand -foot -mouth disease ，HFMD ），少数 重症患者可并发严重的中枢神经系统疾病和肺部感 染，重症患儿病程进展迅速，预后差［1-4］ 。目前，HFMD 尚缺乏有效的预防措施和治疗方法，研制疫苗是控制HFMD 流行的重要手段。 中和效价是评价疫苗免疫原性的关键指标之一［5-8］，检测结果的准确性对疫苗研发和应用均具有重要意义。目前，EV71中和抗体检测方法多采用微量细胞病变法，该方法影响因素较多，且国内各实验室的应用时间尚短，为探讨和规范该测定方法，准确评价EV71疫苗毒株的免疫原性和保护能力，本实验对实验室内、实验室间以及不同毒株对EV71抗 基金项目：国家科技支撑项目（2008BAI69B01）资助项目. 作者单位：1中国药品生物制品检定所（北京100050）；2华兰生 物工程股份有限公司研发部（河南新乡453003）；3北京生物制品研究所（北京100024）；4北京科兴生物制品有限公司研发部（北京100085 ）；5中国医学科学院医学生物学研究所免疫室（昆明650118）.通讯作者：毛群颖，E -mail:maoqunying@https://www.360docs.net/doc/f212760899.html, *： 共享第一作者中国图书分类号R373.2R392-33文献标识码A 文章编号1004-5503（2010）08-0885-04 【实验技术】 人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价 毛群颖1*何鹏1*于祥2李楠2郝春生3高强4董承红5梁争论1李凤翔1沈心亮3王军志1 【摘要】目的 对人肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）中和抗体检测方法进行实验室评价，为该方法的标准化提供 依据。方法5个实验室按照统一制定的EV71中和抗体检测操作细则（SOP ），应用A 、B 和C 基因型的10株EV71病毒株，分别测定10份人免疫球蛋白、20份健康成人血浆和15份EV71动物高效价免疫血清样品中EV71中和效价，检测实验室内、实验室间重复性及不同EV71病毒株对中和抗体检测的影响。结果相同实验室应用各病毒株重复测定中和效价的最大值与最小值（Max -Min ）倍数差均在4倍以内，3次重复试验结果间差异无统计学意义（P 值均＞0.05）；不同实验室应用相同病毒株检测结果的Max -Min 倍数差在4倍以内； 不同实验室应用不同病毒株检测结果为：A 型株与其他基因型病毒株中和效价的Max -Min 差在192倍以内，B3与C4亚型的病毒株中和效价的Max -Min 倍数差在64倍以内，C4亚型不同病毒株之间中和效价的Max -Min 倍数差在16倍以内。结论按统一SOP 操作后,EV71中和抗体检测方法应用相同毒株在实验室内和实验室间具有较好的重复性，而不同病毒株对中和效价的测定结果有较大影响。【关键词】肠道病毒A 型，人；手足口病；中和抗体；基因型 Laboratory Evaluation of Method for Determination of Neutralizing Antibody against Human Enterovirus 71 MAO Qun -ying △,HE Peng,YU Xiang,LI Nan,HAO Chun -sheng,GAO Qiang,DONG Cheng -hong,LIANG Zheng -lun,LI Feng -xiang,SHEN Xin -liang,WANG Jun -zhi （△National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050,China ）【Abstract 】 Objective To evaluate the method for determination of neutralizing antibody against human enterovirus 71 （EV71）in laboratory and provide a basis for standardization of the method.Methods The neutralizing antibody titers against EV71 in 10human immunoglobulin,20healthy adult plasma and 15high titer animal immune serum specimens were determined with 10EV71strains of genotypes A,B and C by 5laboratories according to the SOP for EV71neutralizing antibody,based on which the in －tra -and inter -reproducibility of the method as well as effect of various EV71strains on determination of neutralizing antibody were analyzed.Results The fold differences in maximum and minimum （Max -Min ）of determination results of neutralizing antibody titers with various EV71strains by the same laboratory were less than 4,and the results of 3repeat tests showed no significant difference （P >0.05）.The fold differences in determination results with the same EV71strain by various laboratories were also less than 4.The determination results with various EV71strains by various laboratories were as follows:the fold differences of the Max -Min of neu －tralizing antibody titers of EV71strain genotype A with other genotypes were not more than 192,while those of subtypes B3with C4were not more than 64,and those of subtype C4with other strains were not more than 16.Conclusion By operation according to the unitary SOP,the method for determination of neutralizing antibody against EV71showed satisfactory intra -and inter -reproducibility.However,various EV71strains showed significant effect on the determination result. 【Key words 】Enterovirus A,human;Hand -foot -mouth disease;Neutralizing antibody;Genotype
肠道病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则
附件4 肠道病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对肠道病毒核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是针对肠道病毒核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 （一）肠道病毒简介 肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，能引起人类致病的肠道病毒有多种，包括人肠道病毒A、B、C、D组，有100多个血清型。人类肠道病毒主要包括：脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组（Coxsackievirus A，CA）、柯萨奇病毒B组（Coxsackievirus B，CB）、人肠道致细胞病变孤儿病毒（简称埃可病毒）（Echovirus ECHO）、新肠道病毒等。新肠道病毒为1969年后陆续分离到的，例如新型肠道病毒71型（EV71）等。近年来，鼻病毒（Rhinovirus）被划入肠道病毒属，鼻病毒包括A、B、C组，已经先后分离得到140多个血清型。 肠道病毒为球形，直径28～30nm，核衣壳二十面体立体对称，无包膜。病毒衣壳由60个相同的壳粒组成，排列为12个五聚体，每个壳粒由VP1、VP2、VP3和VP4四种蛋白组成。 肠道病毒基因组为单股正链RNA，全长约为7.2～8.4kb，基因组分为三部分，两端为保守的非编码区，在肠道病毒中同源性非常显著，其中5’端非编码区常作为肠道病毒通用检测试剂检测的靶基因。中间为连续开放读码框，包含结构蛋白编码区和非结构蛋白编码区，结构蛋白编码区依次编码VP4、VP2、VP3和VP1共４个衣壳蛋白。衣壳蛋白不仅含有抗原决定位点，而且还有决定病毒组织嗜性的受体识别位点，介导病毒与细胞的吸附和进入。非结构蛋白编码区主要负责编码与病毒基因组复制以及病毒颗粒包装等有关的蛋白及酶，它们在RNA复制、细胞器修饰，细胞裂解及形态形成中发挥各自不同的功能。 （二）肠道病毒致病性 肠道病毒在肠道中增殖，但通常不引起肠道疾病。90%以上肠道病毒感染为隐性感染，或仅出现轻微的上呼吸道感染或流感样症状。不同肠道病毒可以引起相同的临床症状，同一种病毒可引起几种不同的临床疾病。 肠道病毒的传染源为患者和无症状的病毒携带者。传播途径主要是粪-口途径，也可通过呼吸道传播，夏秋季是一年之中的主要流行期。肠道病毒以上呼吸道、咽喉和肠道为侵入门户，先在局部黏膜和咽、扁
TaqMan实时荧光定量RT
TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测ERCC1变异剪接体 检测平台的建立 前言 对一个基因的各个变异剪接体分别进行精确定检测是深入研究变异剪接的基础。在TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术( TaqMan real-time quantity RT-PCR)出现前，传统的检测方法有4种[1, 2]：（1）Northern blot; (2)核酶保护分析；（3）相对定量RT-PCR，（4）竞争定量RT-PCR这些方法都有其内在的局限性。Northern blot耗时，随时面临RNA降解的困扰，而且灵敏度不高，需要相对大量的RNA 才能检测出来，仅仅适合相对定量分析[3]。核酶保护分析比Northern blot相对灵敏，但是仍然耗时而且需要相对大量的RNA才方便检测[4-8]。相对定量RT-PCR 则需要在每个反应的指数扩增期停止反应后进行凝胶电泳分析，由于每个样本的起始拷贝数不一致，很难确保每个样本均处于相同的指数扩增期。而且此方法需要将PCR产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，增加了步骤，而且增加了污染的可能性[9]。竞争定量RT-PCR则需要根据不同的目的基因片断构建相应的竞争子，然后需要确定每个反应体系中竞争子和目的基因的不同比例，不仅仅耗时而且繁琐，更重要的是竞争子的构建不仅仅需要很大的技巧性，而是是一件极其艰难的工作[10, 11]。这些传统技术不仅繁琐耗时，而且对mRNA的质量要求较高，结果不稳定。而且，这些传统的方法由于方法学上的差异性，导致研究结果不十分可靠，各研究机构之间的结果差异较大。 应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术则可以分别精确检测各个变异剪接体的表达量，结果稳定，可重复性高，方便快捷，程序简单，无需后续处理，几无污染[1, 12-14]。本研究拟建立对切除修复交叉互补基因1即ERCC1（excision repair cross-complementation group 1）变异剪接体的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测平台，为深入研究ERCC1的变异剪接奠定基础[15]。 TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术的基本原理是通过设计与目的序列互补的一段寡核苷酸作为TaqMan探针，在此探针的5’端标记报告基团（如FAM），
实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤
实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
病毒的分类
病毒的分类 1 按感染的对象分动物病毒、植物病毒、细菌病毒、昆虫病毒及真菌病毒，另外尚有类病毒(Viroids)拟病毒(Virusoid)和朊病毒(Prion)。 2 按遗传物质分类分DNA病毒和RNA病毒两大类，其遗传物质单股(single strand)或双股(double strand)、核酸分子量、RNA为正义(sense)或反义(antise… 1. 按感染的对象分 动物病毒、植物病毒、细菌病毒、昆虫病毒及真菌病毒，另外尚有类病毒(Viroids)拟病毒(Virusoid)和朊病毒(Prion)。 2. 按遗传物质分类分 DNA病毒和RNA病毒两大类，其遗传物质单股(single strand)或双股(double strand)、核酸分子量、RNA为正义(sense)或反义(antisence) RNA都是主要的分类依据。 3.按基因结构划分 DNA病毒 l 腺病毒科 Adenoviridae l 疱疹病毒科 Herpesviridae EBV 带状疱疹病毒 l 虹彩病毒科 Iridoviridae l 乳头多瘤空泡病毒Papovaviruses l 小DNA病毒科 Parvoviridae l 痘病毒科 Poxviridae 天花病毒牛痘病毒 l 嗜肝DNA病毒科Viral Hepatitis乙型肝炎病毒 RNA病毒 l 冠状病毒科 Coronaviridae 严重急性呼吸道综合症病毒 l 玻那病毒科 Bornaviridae l 纤维病毒科 Filoviridae *埃博拉病毒 l 正黏液病毒科 Orthomyxoviridae *流感病毒 influenza virus *禽流感病毒Avian influenza l 副黏液病毒科 Paramyxoviridae 腮腺炎病毒麻疹病毒人类呼吸道融合病毒 l 小核醣核酸病毒 Picornaviruses 鼻病毒肠道病毒 l 反转录病毒科 Retroviridae *艾滋病病毒 HIV l 呼肠孤病毒科Reoviridae l 炮弹病毒科 Rhabdoviridae 狂犬病毒Rabies Virus 噬菌体 噬菌体bacteriophage，简称phage，寄生于细菌中病毒的总称。
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创新助手报告——主题分析报告 创新助手平台提供 北京万方软件股份有限公司 2014-07-10
报告目录 报告核心要素......................................................................................................... I 一、主题简介 (1) 二、主题相关科研产出总体分析 (1) 2.1 文献总体产出统计 (1) 2.2 学术关注趋势分析 (2) 三、主题相关科技论文产出分析 (2) 3.1 中文期刊论文 (2) 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 (2) 3.1.2 中文期刊论文增长趋势 (3) 3.1.3 发文较多期刊 (4) 3.1.4 发文较多的机构 (4) 3.1.5 发文较多的人物 (4) 3.1.6 核心期刊分布数量对比 (4) 3.1.7最近相关中文期刊论文 (5) 3.1.8被引较多的相关期刊论文 (6) 3.2 学位论文 (7) 3.2.1 近十年学位论文年代分布列表 (7) 3.2.2 学位论文增长趋势 (8) 3.2.3 硕博学位论文数量对比 (8) 3.2.4 发文较多的机构 (9) 3.2.5 发文较多的人物 (9) 3.2.6 最近相关学位论文 (9) 3.3 中文会议论文 (10) 3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列表 (10) 3.3.2 中文会议论文增长趋势 (11) 3.3.3 中文会议论文主办单位分布 (11) 3.3.4 发文较多的机构 (12) 3.3.5发文较多的人物 (12) 3.3.6最近相关中文会议论文 (13) 3.4 外文期刊论文 (13) 3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列表 (13) 3.4.2 外文期刊论文增长趋势 (14) 3.4.3 最近相关外文期刊论文 (14) 3.5 外文会议论文 (15) I