凝胶过滤层析常见问题解析
生物化学习题（含答案解析）
1变性后的蛋白质变性后的蛋白质,,其主要特点是A 、分子量降低B 、溶解度增加C 、一级结构破坏D 、不易被蛋白酶水解E 、生物学活性丧失正确答案：E答案解析：蛋白质变性的特点：生物活性丧失溶解度降低粘度增加结晶能力消失易被蛋白酶水解。
蛋白质变性：是蛋白质受物化因素（加热、乙醇、强酸、强碱、重金属离子、生物碱试剂等）的影响，改变其空间构象被破坏，导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。
一级结构不受影响，不分蛋白质变性后可复性。
2下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱时下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱时,,最先被洗脱的是A 、MB(Mr:68500)B 、血清白蛋白、血清白蛋白(Mr:68500) (Mr:68500)C 、牛ν-乳球蛋白乳球蛋白(Mr:35000) (Mr:35000)D 、马肝过氧化氢酶、马肝过氧化氢酶(Mr:247500) (Mr:247500)E 、牛胰岛素、牛胰岛素(Mr:5700) (Mr:5700) 正确答案：D答案解析：凝胶过滤层析，分子量越大，最先被洗脱。
3蛋白质紫外吸收的最大波长是A 、250nm B 、260nm C 、270nm D 、280nm E 、290nm 正确答案：D答案解析：蛋白质紫外吸收最大波长280nm 280nm。
DNA 的最大吸收峰在260nm 260nm（显色效应）（显色效应）。
4临床常用醋酸纤维素薄膜将血浆蛋白进行分类研究临床常用醋酸纤维素薄膜将血浆蛋白进行分类研究,,按照血浆蛋白泳动速度的快慢按照血浆蛋白泳动速度的快慢,,可分为A 、α1、α2、β、γ白蛋白B 、白蛋白、γ、β、α1、α2C 、γ、β、α1、α2、白蛋白D 、白蛋白、α1、α2、β、γE 、α1、α2、γ、β白蛋白正确答案：D答案解析：醋酸纤维素薄膜电泳血浆蛋白泳动速度的快慢，白蛋白、α1白蛋白、α1--球蛋白、α2球蛋白、α2--球蛋白、β球蛋白、β--球蛋白、γ球蛋白、γ--球蛋白背吧5血浆白蛋白的主要生理功用是A 、具有很强结合补体和抗细菌功能B 、维持血浆胶体渗透压C 、白蛋白分子中有识别和结合抗原的主要部位D 、血浆蛋白电泳时、血浆蛋白电泳时,,白蛋白泳动速度最慢E 、白蛋白可运输铁、铜等金属离子 正确答案： B答案解析：血浆白蛋白的生理功用1、在血浆胶体渗透压中起主要作用，提供7575－－80%80%的血浆总胶体渗透压。
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
凝胶过滤及离子交换层析介质详解
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
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离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
凝胶层析注意事项
凝胶层析注意事项凝胶层析是一种常用的分离技术，其原理是利用基质中化学成分在固相凝胶上的分配率差异，实现化合物的分离和纯化。
在进行凝胶层析实验时，需要注意以下几个方面：1. 选择合适的凝胶材料：根据所需要分离的物质的特性，选择适当的凝胶材料。
常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
需要根据分子量、电荷性质和疏水性等因素选择合适的凝胶材料。
2. 准备凝胶：凝胶层析实验中，制备凝胶的过程非常重要。
需要注意凝胶的质量，尽量避免制备过程中出现空隙或者气泡。
应根据实验需要调整凝胶的浓度和孔径大小，以确保能够将待分离物质分离开来。
3. 样品预处理：在进行凝胶层析实验之前，需要对待分离的样品进行预处理。
一般来说，预处理包括蛋白质的去除、富集或者纯化，以及样品的去盐、去色等操作。
预处理的目的是提高样品的纯度和分离效果。
4. 蛋白样品的加载量：在进行凝胶层析实验时，需要控制好蛋白样品的加载量。
过多的样品会导致样品分离不净，而过少的样品则可能会导致分离效果不理想。
因此，需要根据实验的要求和凝胶的大小选择合适的加载量。
5. 缓冲液的选择：在凝胶层析实验中，选择合适的缓冲液非常重要。
缓冲液对于维持凝胶的pH值稳定以及样品分离的效果有着重要的影响。
需要选择合适的缓冲液体系，并根据实验需要调整缓冲液的浓度和pH值。
6. 电泳条件的设置：在进行凝胶层析实验时，电泳条件的设置直接影响实验结果。
电泳的时间、电压以及温度等因素需要根据实验的要求进行合理的调整。
过高的电压可能会导致凝胶破裂，而过低的电压则可能会影响样品的分离效果。
7. 结果分析：在凝胶层析实验结束后，需要对结果进行分析和解读。
根据实验结果，判断分离效果和样品纯度，以确定实验是否成功。
同时还需要对分离得到的样品进行进一步分析，例如质谱分析、蛋白质鉴定等。
总之，凝胶层析是一种常用的分离技术，需要严格控制实验条件和选择合适的凝胶材料。
只有在合理操作的基础上，才能获得准确可靠的实验结果。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶层析的原理基于分子在固定凝胶柱上通过孔隙的能力。
凝胶是由交联的聚合物构成的，形成了许多孔隙，这些孔隙的大小和分子的大小具有相关性。
分子大小较大的物质将难以进入凝胶孔隙内，流速比较快，从而在柱体积内快速通过，出现在柱体积较大的位置；而分子大小较小的物质则能够进入凝胶孔隙内，流速比较慢，从而在柱体积内停留更长时间，出现在柱体积较小的位置。
凝胶层析的柱层结构是由一段硬基质构成，上面带有孔隙性的功能性聚合物层。
功能性聚合物的孔隙大小可以根据需要而定，常见的为分子质量在1000道尔顿到几十万道尔顿之间的分离。
当样品在凝胶柱上通过时，较小的分子能进入到凝胶层的孔隙内，流速较慢，溶液逐渐扩散。
而较大的分子无法进入到孔隙内，流速较快。
因此，凝胶层明显的区分了分子的大小。
在凝胶柱中选择的凝胶颗粒可以根据目标物质的分子量范围和理化性质进行选择。
通常使用的材料包括葡聚糖、琼脂糖、琼脂糖琼脂、琼脂糖琼脂纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
这些凝胶材料的孔隙大小和梯度能根据需要进行调整，以实现对样品分子的精确分离。
在进行凝胶层析的过程中，凝胶柱首先需要经过预处理，以去除杂质和活性剂。
样品可以直接在预处理后的缓冲液中加载到凝胶柱上，并在适当的流速下通过。
样品分子会在凝胶柱中发生分配，分子量较大的物质会穿过凝胶颗粒的外层，较小的分子则进入凝胶颗粒孔隙内。
这样，在整个流程中分子会逐渐分离并收集在柱底。
1.相对于其他层析技术，凝胶层析是一种非毒性和温和的技术，对生物大分子的分离影响较小。
2.凝胶层析具有良好的分辨率和高效率，可以实现对不同分子大小物质的分离。
3.凝胶层析可以在无需进行特殊环境条件下进行，如室温和常压。
4.凝胶层析可与其他分离技术如亲和层析、离子交换层析等相结合，实现更精确的纯化和分离过程。
总结起来，凝胶层析是一种基于分子大小的层析技术，通过凝胶柱的孔隙大小来实现分离物质的纯化。
它是一种相对简单且温和的分离方法，适用于大多数生物分子的分离和纯化。
凝胶层析法专题培训
4．聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其 商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联 葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自 动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺
和交联剂甲叉双丙烯酰胺
经过自由基引起聚会形 成聚丙烯酰胺凝胶。
（见下图）。只要控制单体用量和交联剂 旳百分比，就能得到不同型号旳凝胶。
3．葡聚糖凝胶离子互换剂
在G类凝胶上引入某些酸性或碱性基团后， 则制得多种葡聚糖凝胶离子互换剂 。
如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基 （CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAESephadex A）等。葡聚糖凝胶离子互换剂具有 离子互换和分子筛双重作用。其构造多孔、疏 松、非特异性吸附极少，层析时流速易控制， 尤其合用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等旳 分离纯化，以及生化制剂旳除热原。
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒 状旳干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一 起旳倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶旳溶胀性质和分离范 围旳不同，可提成10种类型。多种类型均以英 文字母P和阿拉伯数字表达，从Bio-Gel P-2至 Bio-Ge1 P-300。P背面旳阿拉伯数字乘以1000 即相当于排阻程度（按球蛋白或肽计算）。目 前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多 种规格旳Bio-Gel P。
式中Ve为脱体积，它涉 Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间旳 一种特定旳分配系数，它只与被分离物质分 子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd 可经过试验由Ve、Vo和Vi求得。
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd=－－－－
一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最终流出层析柱。 而中档大小旳分子，它们也能在凝胶颗粒 内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子 物质与小分子物质之间被洗脱。这么，经 过层析柱，使混合物中旳各物质按其分子 大小不同而被分离。
第五章 凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的 颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、 沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液 相体积的总和； 内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗 粒网孔中的液相体积的总和； 凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积 （matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶 颗粒固相所占据的体积，
第五章 凝胶过滤层析 第三节 凝胶过滤介质
一、凝胶过滤介质的基本结构 凝胶介质的基本结构都是具有多孔网状结构的水不溶性多 聚物。 理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件： （1）有较强的机械稳定性，能满足层析过程所需流速， 在其标称的操作压力范围内不发生体积变化； （2）高化学稳定性，凝胶颗粒对分离过程中常用的试剂 和样品都保持惰性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去 污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便清洗和消毒灭菌； （3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性； （4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
凝胶过滤层析如何操作？
凝胶过滤层析如何操作？凝胶过滤层析操作 1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。
方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5,10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。
在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
表凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量(g)直径(cm) 高(cm) 容量 (ml) G25 G50 G100 G200 0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3 0.9 30 19 5 2 1.2 0.60.9 60 38 10 4 2.5 1.21.6 20 40 10 42.5 1.21.6 40 80 20 8 5.02.41.6 70 140 35 14 9.0 4.4 1.6 100 200 50 20 12.5 6 2.6 40 210 50 20 12 72.6 70 370 90 35 20 122.6 2.6 100 60 530 1 000 130 250 50 110 30 70 17 352.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。
纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25,100倍。
去除盐及游离荧光素约为样品体积的4,10倍。
柱太短，影响分离效果。
柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。
层析柱的内径也要选择适当。
内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。
所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。
对于除盐来说应为1:5,1:25;对于纯化蛋白质来说应为1:20,1:100。
凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。
一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。
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凝胶过滤层析常见问题解析
1. 色谱峰对称性差
出峰上升时，上升缓慢是填料装填过紧，而拖尾是因为装填的太松，此时对称因子及
柱效都很差，出现这种情况就要重现装柱。
装柱前要了解填料的压缩系数（压缩因子）如Focurose FF系列的填料的压缩系数是1.15，且装完后要测柱效。
2. 柱床有裂缝或干涸等塌柱现象
检测管路及柱床体系是否有泄露或气泡，必要时重现装柱。
3. 分离度差
(1) 样品和选择的填料不匹配
待分离的样品中目标物质和其它杂质的分子量小于2倍且都在选择的填料的排阻极限
之外或者之内。
若样品中目标物质的分子量和其它杂质的分子量小于2倍时，建议尝
试其它方法分离，反之选择凝胶过滤层析时，填料的选择应根据样品中目标分子的大
小选择最接近（大或小都可以）目标分子排阻极限的填料进行分离。
(2) 柱床装填的效果差
通过测柱效等方式确保柱床装填的满足凝胶过滤层析的过程。
(3) 上样量过大
根据样品中目标物质和杂质的分子差异优化上样量，如脱盐等样品中目标分子和杂质
的分子量大于50倍时，上样量可以达到柱床体积的25%，最高不超过30%，若样品
中目标分子和杂质的分子量差异在2-5倍时，通常上样量控制在柱床体积的5%以内。
(4) 流速过快
凝胶过滤的过程流速不宜过快，降低流速在一定程度上可以提高分离度。
(5) 层析填料被污染或老化
随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性
吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。
此时可
对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。
(6) 样品自身的问题
样品粘度过大也会导致分离度下降，粘度大的样品在凝胶过滤时要对其进行稀释处理在凝胶过滤；
样品中目标物质和其它杂质的非特异性结合或者作用力，此时就要尝试添加一些添加剂（如2%的Triton x-100,150mM NaCl等），减少样品中各组份之间的作用力；
样品的pH，离子强度对某些填料的柱床体积会产生一些影响，也会影响分离度，必要时可以优化样品的缓冲液。
4. 反压大，液流慢
凝胶过滤层析柱的装填应控制在60-100cm，太低影响分离度，太高反压增大。
另外填料的清洁程度及样品的粘度，pH，离子强度也会影响液流速度。