细菌生理生化实验

细菌的生理、生化实验简介
微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。

因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物检验中常用的生化反应介绍如下：
一、糖酵解试验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。

可用指示剂及发酵管检验。

试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。

接种后，置36±°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力，培养物可呈弥散生长。

本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。

一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。

二、淀粉水解试验
某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄
糖。

淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20℃培育5天。

然后将碘试剂直接滴浸于培育表面，假设为液体培育物，那么加数滴碘试剂于试管中。

当即检视结果，阳性反映（淀粉被分解）为琼脂培育基呈深蓝色、菌落或培育物周围显现无色透明环、或肉汤颜色无转变。

阴性反映那么无透明环或肉汤呈深蓝色。

淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。

培养基pH必须为中性或微酸性，以最适。

淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

三：V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

试验方法：
１）O’Meara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C 培养48h，培养液1ml加O’Meara试剂（加有%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1~2min，静置于室温或36±1°C恒温箱，若4h内不呈现伊红，即判定为阴性。

亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。

２）Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C 培养4天、培养液先加入a萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液,再加40%氢氧化钾水溶液，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

３）快速法：将%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。

不产酸的培养物不能使用。

本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。

在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。

四：甲基红（Methyl Red）试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至以下，使甲基红指示剂变红。

试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。

迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。

甲基红为酸性指示剂，pH范围为~，其pK值为。

故在以下，随酸度而增强黄色，在以上，则随碱度而增强黄色，在或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。

五：靛基质（Imdole）试验
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。

吲哚的存在可用显色反应表现出来。

吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。

试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1°C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。

实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。

六、硝酸盐（Nitrate）还原试验
有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。

亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。

试验方法：临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各等量混合、取混合试剂约、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。

用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。

进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。

α-萘
胺具有致癌性、故使用时应加注意。

七、明胶（Gelatin）液化试验
有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。

试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。

于20~22℃培育7~14天。

明胶高层亦可培育于36±1℃。

天天观看结果，假设因培育温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观看其是不是被细菌液化，如确被液化，即为实验阳性。

平板实验结果的观看为在培育基平板点种的菌落上滴加试剂，假设为阳性，10~20min后，菌落周围应显现清楚带环。

不然为阴性。

八、尿素酶（Urease）试验
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。

尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。

其活性最适pH为。

试验方法：挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管
中，摇均，于36±1℃培育10，60和120min，别离观看结果。

或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要抵达底部，留底部作变色对照。

培育2，4和24h别离观看结果，如阴性应继续培育至4天，作最终判定，变成粉红色为阳性。

九、氧化酶（Oxidase）试验
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。

试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。

阴性者无颜色改变。

应在数分钟内判定试验结果。

十、硫化氢（H2S）试验
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。

试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1℃培育24~28h，培育基呈黑色为阳性。

阴性应继续培
育至6天。

也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一样营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培育基上空，以可不能被溅湿为适度；用管塞压住置36±1℃培育1~6天。

纸条变黑为阳性。

十一、三糖铁（TSI）琼脂试验
试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培育18~24h，观看结果。

本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。

葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

十二、硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验
试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培育18~24h，观看结果。

培育物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培育表面，静置10min，假设试剂呈红色为靛基质阳性。

培育基未接种的下部，可作为对照。

本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。