实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体
大学课程《细胞生物学》实验教案-叶绿体的分离与荧光观察
大学课程《细胞生物学》实验教案-叶绿体的分离与荧光观察大学课程《细胞生物学》实验教案叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
二、实验原理用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。
三、实验材料新鲜菠菜叶四、实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。
五、实验药品匀浆介质(0.25mol／L蔗糖、0.05mol／L Tris—HCi缓冲液，pH7.4)：称取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约42．5ml0.lmol／LHCI，最后蒸馏水定容至1000ml。
50％蔗糖溶液，15％蔗糖溶液。
0.35M氯化钠，0.01％吖啶橙六、实验步骤(一)叶绿体的密度离心l. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5g，剪碎。
2. 加入预冷到近0'C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎o。
3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。
4. 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000r／min离心1min。
5. 在2ml离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15％蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面，50％蔗糖溶液加0.9ml，15％蔗糖溶液加0.5ml。
加液完后，可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。
6．在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。
7．离心8000r／min，20min。
8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。
还可在暗室内用荧光显微镜观察。
(二)菠菜叶手切片观察用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／LNaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察，(1)在普通光镜下观察·(2)在荧光显微镜下观察(3)用同样方法制片，但滴加1～2滴0.01％吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
蔗糖密度梯度离心步骤
蔗糖密度梯度离心是一种分离和纯化生物分子（如蛋白质、核酸等）的常用方法。
密度梯度离心利用溶液中不同密度的层级来实现分离，蔗糖是常用的密度梯度介质之一。
下面是蔗糖密度梯度离心的一般步骤：
1. 准备样品：将待分离的混合物样品准备好，通常是细胞裂解液、细胞上清液、蛋白质提取物等。
2. 制备蔗糖梯度：按照需要离心的生物分子的密度范围，选择适当的蔗糖浓度。
通常是在离心管中按体积比例混合蔗糖和缓冲液，制备成密度梯度。
3. 加样：将待分离的样品轻缓地加到蔗糖梯度上，以防混合。
4. 离心：将装有样品和蔗糖梯度的离心管放入离心机中，进行高速离心。
离心过程会使样品中的生物分子沉降到与其密度相匹配的蔗糖层级中。
5. 收集分离物：离心后，观察离心管中形成的密度梯度。
在离心管中，生物分子会沉降到不同的密度层级，形成分离的带状区域。
用适当的技术，如针管、泵或滴管，从密度梯度中收集分离的生物分子。
密度梯度离心是一种常用的生物分离技术，特别适用于分离不同密度的生物分子或细胞亚群。
在生物学、生物化学、免疫学等领域中
广泛应用，用于纯化和分析复杂的混合物。
蔗糖密度梯度离心原理
蔗糖密度梯度离心原理
蔗糖密度梯度离心是一种常用的生物化学分离技术，通过在蔗糖溶液中形成梯度，利用不同物质在梯度中的沉降系数不同的原理，实现生物大分子的分离和纯化。
本文将介绍蔗糖密度梯度离心的原理及其在生物化学研究中的应用。
蔗糖密度梯度离心的原理是基于物质在密度梯度中的沉降系数不同而实现的。
在蔗糖溶液中，溶液浓度逐渐增加，形成一个密度梯度。
当样品加载到密度梯度上方时，由于样品与梯度中某一层的密度相近，样品会停留在该层上。
这样，不同密度的生物大分子就可以被分离开来。
蔗糖密度梯度离心广泛应用于生物化学研究中，例如可用于分离细胞器、蛋白质、核酸等生物大分子。
在分离细胞器方面，可以通过蔗糖密度梯度离心将细胞质、线粒体、叶绿体等细胞器分离开来，为后续的研究提供纯净的样品。
在分离蛋白质方面，可以利用蔗糖密度梯度离心将不同密度的蛋白质分离开来，实现纯化。
在分离核酸方面，也可以利用蔗糖密度梯度离心将DNA、RNA等核酸分离开来，为分
子生物学研究提供纯净的核酸样品。
总之，蔗糖密度梯度离心是一种重要的生物化学分离技术，通过利用物质在密
度梯度中的沉降系数不同的原理，实现生物大分子的分离和纯化。
在生物化学研究中具有广泛的应用价值，为研究人员提供了一种有效的手段，帮助他们获得纯净的样品，推动生物化学领域的发展。
叶绿体的分离
1.3叶绿体的分离
1.3.1 植物组织匀浆
1．去掉水稻叶片中脉，把叶片剪成3-5mm小段。
2．取10g剪碎的叶片，在研钵中加入液氮，将叶片研磨成精细的粉末；加入预冷的提取缓冲液（200 mL/10鲜重），继续研磨成匀浆（注：对于菠菜等纤维素含量低的植物叶片，使用匀浆机匀浆叶片组织即可。
如果组织匀浆太剧烈，叶绿体中的淀粉结晶会导致叶绿体破碎）。
3．在不挤压纱布的情况下，用四层纱布过滤匀浆物，使匀浆液自然流下（如果挤压纱布过滤，叶绿体得率会提高）。
1.3.2 叶绿体的分离
1.3.
2.1蔗糖梯度制作
用提取缓冲液按表1要求，配制不同浓度的蔗糖溶液（长时间不用，应存放在-20℃冷冻保存，以防长菌）。
取一只30 mL的离心管，从下到上铺加4、6、4mL 的60%，40%，20%蔗糖混合物，置于4℃冷藏备用。
表1 不同浓度的蔗糖溶液（w/v）
蔗糖溶液60%40%20%
蔗糖（g）604020
终体积（mL）100100100
6．在叶绿体的悬浮液中加入5倍体积的洗涤缓冲液，2500×g 离心10分钟（4℃），回收叶绿体。
7．倾去上清液，加入20 m L洗涤缓冲液，用画刷温和重悬沉淀，2500×g 离心10分钟（4℃）；重复操作1-2次（须除去所有的蔗糖）。
8．用3 m L左右的洗涤缓冲液温和重悬沉淀。
9．用相差显微镜检测叶绿体是否完整（完整的叶绿体在显微镜下很亮，而不是在视野中发暗或半透明）。
密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光染色
密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光染色课程名称：细胞生物学实验指导老师：成绩：__________________ 实验名称：密度梯度法分离提纯叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理1、一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关；2、用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。
三、实验用品1. 材料：新鲜菠菜叶2. 器材：光学显微镜、荧光显微镜、台式高速冷冻离心机，研钵、剪刀、托盘、玻皿等3. 试剂：（1）匀浆介质（0.25 mol/L 蔗糖、0.05 mol/L Tris-HCI 缓冲液，pH7.4）（2）50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶液四、实验步骤1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、主脉后，称取2~3g ，剪碎置研钵中。
2. 加入10ml 匀浆介质于研钵中，研磨成糜状。
3. 用双层纱布过滤捣碎液到烧杯中。
4. 将滤液倒于离心管内，500rpm 离心10min ，轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml 加入离心管，再取15%蔗糖溶液0.4ml 小心沿管壁缓缓注入，不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面可见，制成密度梯度。
6. 加入0.4ml 上清液，严格平衡离心管后，用水平转头8000r/min 离心，20min 。
7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。
另装订线取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观察。
生化大实验
实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。
以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。
两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。
与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。
1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。
然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。
这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。
密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。
颗粒在梯度中移动的快慢。
取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。
在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。
用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
通过这种方法可粗略的分离叶绿体。
叶绿体的分离、纯化和鉴定.pdf
(2)细胞破碎时，不必过细。用普通的家用食品 料理机匀浆2 min同样可以达到很好的效果。此 外，过滤时不要用力挤压，以避免对叶绿体被膜 的破碎。在用细胞器分离缓冲液悬浮叶绿体粗提 物时应轻缓，在冰上轻轻晃动使叶绿体分散开来。
心机配平)， 轻轻吸取上清液。 5. 在2.0ml离心管内依次加入50%蔗糖溶液0.9ml和15%蔗糖溶液 0.5ml（注意15%蔗糖溶液要缓缓沿离心管壁注入，不能搅动 50%蔗糖液面）。 6. 小心地沿离心管壁加入0.4ml上清液。 7. 离心8000r/min, 20 min。 8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度 液中间形成带。
冲液 ph=7.4） 50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液，0.01%吖啶橙
Байду номын сангаас
实验步骤
1.选取菠菜叶片（选择嫩绿色的新鲜叶片），洗净擦干后去除 叶梗和粗脉，撕成小碎块（剪碎更宜碾磨），称2~3g放于玻 璃匀浆器中
2.加入预冷（放在冰上预冷）到0℃匀浆介质10ml，在冰上用研 钵研磨。
3.捣碎液用尼龙网过滤于50ml烧杯中。 4.将滤液平分到2个离心管中（2ml），1000r/min下离心1min(离
(4)加样时一定要小心，防止破坏梯度。为此，应采用宽口 吸头吸取叶绿体粗提物悬浮液，释放时，将枪头贴于管壁 接近15％蔗糖浓度处缓慢释放。
(5)离心时，为防止速度快速上升和快速下降对浓度梯度层 的破坏，离心机的加速一定要缓慢，而下降时也要缓慢停 下。此外，为防止高速离心过程中温度上升可能造成的由 于颗粒扩散而引起的梯度破坏，离心前一定要让离心机在 0℃或更低的温度下充分预冷【1】。
9.用吸管对准叶绿体那一层吸取一滴叶绿体悬液滴于载片上， 加盖片观察： 1）在普通光镜下观察；
蔗糖梯度密度离心
纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。
其过程如下：1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。
2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。
4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。
11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。
5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE （根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。
-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。
问：我在做病毒纯化时，需先用超速离心，再用蔗糖密度梯度离心，求助高手用蔗糖密度梯度离心时的转速与超速离心时的转速有联系吗，是相等还是蔗糖密度梯度离心的转速要比超速离心的速度高？若为后者，那又若何决定蔗糖密度梯度离心时的转速？谢谢！答：1、病毒的纯化时，先用超速离心，你应该查一下资料，看在多大的转速时能够把病毒离心下来．那么你的这一步的转速应该至少不小于该转速，你这一步离心下来的沉淀中含有病毒和蛋白成分。
2、因此你的第二步工作就是要将病毒与其他的蛋白以及杂质分离开，密度梯度离心就可以达到该目的。
这时你的离心速度要考虑病毒的大小和蔗糖的密度，使得病毒不能沉淀道管底又可与蛋白层分开。
这也可能要具体问题具体分析。
问：谢谢主任的指点，我的病毒直径为100nm。
查阅了有观资料，超速离心为21000rpm,45min，我用24000rpm2hr，我用20%-60%连续蔗糖密度梯度离心，该病毒在蔗糖中的浮密度为1.18mg/ml，请问我的糖密度梯度离心速度大概是多少？谢谢！答：我们实验室IBV （80-100nm）的纯化是：l 病毒纯化浓缩（方法一）1、冷冻之尿囊液解冻后，4℃，11000rpm离心20min。
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实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体
实验原理2、1 概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。
此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。
密度梯度区带离心法又可分为两种：
（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。
在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。
此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。
离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同
沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。
梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1、28 kg/cm3和60％。
此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。
离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。
体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。
等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。
等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝（CSCl），其密度可达1、7g/cm3。
此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。
2、2 梯度溶液的制备（1）梯度材料的选择原则。
作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：①与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。
②可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。
③不会对离心设备发生腐蚀作用。
④容易纯化，价格便宜或容易回收。
⑤浓度便于测定，如具有折光率。
⑥对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。
这些条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。
下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。
②无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。
③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。
④硅溶胶：如Percoll。
⑤蛋白质：如牛血清白蛋白。
⑥重水。
⑦非水溶性有机物：如氟代碳等。
（2）梯度材料的应用范围
⑴ 蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1、33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。
⑵ 聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。
主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。
⑶ 氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达
1、91g/ml。
由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DN
A、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。
⑷ 卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。
NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。
⑸Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。
它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。
2、3 密度梯度区带离心法图解图2-23 A速度沉降，B等密度沉降2、4 收集区带的方法（1）用注射器和滴管由离心管上部吸出。
（2）有针刺穿离心管底部滴出。
（3）用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。
（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。
三
实验材料新鲜菠菜叶。
四
实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片。
普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。
五
实验药品5、1 匀浆介质（0、25mol/L蔗糖、0、05mol/L Tris-Hcl缓冲液，pH7、4）配制方法：
称取
85、55g 蔗糖，6、05g Tris，溶解在近400ml蒸馏水中，加入约4、25ml 0、1mol/L的Hcl溶液，最后用蒸馏水定容至
500ml。
5、260% 蔗糖溶液，50％蔗糖溶液，40% 蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15％蔗糖溶液配制方法：配制80% 的蔗糖溶液，然后按照下表进行稀释，分别配制成50%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液。
六实验步骤6、1 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取50g，剪碎。
6、2 加入预冷到近0℃的匀浆介质100ml，在组织捣碎机上选高速档捣碎2min。
6、3 捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。
6、4 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上500r/min离心5min，轻轻吸取上清液。
6、5 在Polyallomer离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液(或依次加入60%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液)，注意要用滴管吸取15％蔗糖溶液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml （如果是四个梯度则每个梯度加
6ml）。
加液完成后，可见两种溶液界面处折光率稍不同，形成分层界面，这样密度梯度便制好了、6、6 在制好的密度梯度上小心
地沿离心管壁加入1ml上清夜。
6、7 严格平衡离心管，份量不足的管内轻轻加入少量上清夜。
6、8 用甩平转头离心18000r/min，90min。
6、9 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。
还可在暗室内用荧光显微镜观察。
七结果与分析结果如图所示，叶绿体在由两种不同浓度的蔗糖溶液组成的混合液中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；而在由四种不同浓度的蔗糖溶液组成的混合液中，叶绿体可形成两条带，聚集在密度梯度交界处。
沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。
吸出叶绿体制成临时装片，暗室内用荧光显微镜观察，视野中可见到许多的小红点，这是由于叶绿体被荧光激发而产生的。
结果证明，该方法可以较好的分离出叶绿体。
八离心操作的注意事项高速与超速离心机是生化试验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。
8、1 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。
8、2 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装
得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。
每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。
8、3 若要在低于室温的温度下离心时。
转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。
8、4 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。
8、5 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。
每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。