小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态
临床医学
中国组织工程研究与临床康复 第 12 卷 第 3 期 2008–01–15 出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15, 2008 Vol.12, No.3
小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞 生长状态★
李 斌1,2，彭秋平2，卢伟英1,2，徐 雯1,2，金应霞2，黄元华1,2
Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratios
Li Bin1,2, Peng Qiu-ping2, Lu Wei-ying1,2, Xu Wen1,2, Jin Ying-xia1, Huang Yuan-hua1,2
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Abstract
AIM: The key of the human embryonic stem cell culture is to guarantee the totipotency and inhibit spontaneous differentiation. There are the problems in the traditional methods that human embryonic stem cells were cultured on the mouse embryonic fibroblasts or human foreskin fibroblasts as feeder layer. We aimed to solve the problems, observe growth state of human embryonic stem cells when it was cultured on the mixed feeder layers of different proportion. METHODS：Experiments were completed in Reproductive Medical Center of Hainan Medical College from April 2006 to July 2007. ①The foreskin was from the boy who was circumcised, provided by Department of Urinary Surgery of Hospital Affiliated to Hainan Medical College. Child guardian signed an informed consent of the treatment and experiment and the experiment was approved by the hospital medical ethics committee. Human embryonic stem cell line (HN-1) was isolated from human blastocysts and identified. Eleven clean fetal mice of 12.5-14.5 d were collected and the disposal of animal conformed to the animal ethics standards during the experiments. ②The fetal mice whose heads, limbs and internal organs were removed were repeatedly digested by the trypsin to obtain cells, then cells were cultured. Parts of the original cells were cryopreserved after confluence. It was the mouse embryonic fibroblast feeder layer that cells which were treated for 2.0-3.0 h with mitomycin C were cultured in the center plate coated by gelatin at 1×108 L-1. Isolation, culture and preparation of feeder layer of human foreskin fibroblast were the same as above. Mixed feeder layer was that cells which were mixed according to 1∶0，3∶1，1∶1，1∶3，0∶1 were cultured in the center plate coated by gelatin at 1×108 L-1. ③Growth states of human embryonic stem cells were observed in three different feeder layers and undifferentiated phenotypes were detected, including expression of alkaline phosphatase, and presence of OCT-4, Tert and cell marker (OCT-4). Without feeder layer, human embryonic stem cell differentiation was observed in vitro. RESULTS：①Comparison of human embryonic stem cell growth state on different feeder layers: Colonies of human embryonic stem cells on the mouse embryonic fibroblast feeder layer and human foreskin fibroblast feeder layer was both flat and thin, but those on the mixed cells feeder layer were full and thick. The clonal morphology of the mixed feeder layer, overall, was significantly better than others. ②Comparison of human embryonic stem cell growth state on the mixed feeder layers prepared by different ratios: When mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts were mixed at a ratio of 1∶1 human embryonic stem cells accumulated significantly and cloning edge was clear, obvious and full. No significant changes were found at 1∶3. It was significantly better than others. ③Detection of human embryonic stem cell undifferented phenotypes on mixed feeder layer: Expression of alkaline phosphatase and OCT-4 antigen were strongly positive. Specific bands of OCT-4 and telomerase mRNA appeared respectively on 200-300 bp and 300-400 bp. ④Differentiation experiment in vitro: Human embryonic stem cells on mixed feeder layer was able to form embryoid bodies and differentiate into a variety of cells. CONCLUSION： ①Comparison with conventional feeder layers prepared by mouse embryonic fibroblasts or human foreskin fibroblasts, the mixed cells feeder layer may be better suitable for human embryonic stem cell culture in vitro and obtain better human embryonic stem cell clonal morphology. ②The feeder layer mixed at a ratio of 1∶1 can get better effect. Li B, Peng QP, Lu WY, Xu W, Jin YX, Huang YH.Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratios.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12 (3):424-428(China) [https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html,/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-424(ps).pdf] 摘要
目的：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维 细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题，观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态。 方法：实验于 2006-04/2007-07 在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。①对象：包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南 医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞 系 HN-1 由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕 12.5~14.5 d 的胎鼠 11 只，实验过程中对动物的处置符合动物 伦理学标准。②实验方法：将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇 合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素 C 处理 2.0~3.0 h 后，按 1×108 L-1 密度接种于明胶包被的中心皿内，即小鼠胚胎成纤维 细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按 1∶0，3∶1，1∶1， 1∶3，0∶1 比例混合，然后以 1×108 L-1 密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。③实验评估：观察体外传代培养 的人胚胎干细胞在 3 种不同饲养层上的生长状态。并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4 表 达免疫组化检测、OCT-4 及端粒酶 mRNA 表达 RT-PCR 检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 结果：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较：生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆 扁平、不饱满，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②人胚胎干细 胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较：小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞按 1∶1 混合时，人胚胎干细胞显著堆积 生长，克隆边缘清晰、隆起明显且饱满，按 1∶3 混合时无明显变化，优于其余 3 种混合比例。③混合饲养层上人胚胎干细胞未 分化状态的检测：碱性磷酸酶染色及 OCT-4 抗原表达均呈强阳性，分别在 200~300 bp 和 300~400 bp 处可见 OCT-4 和端粒酶
Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China; 2 Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China Li Bin ★ , Master, Assistant, Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China；Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China libinliccc@https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html, Correspondence to: Huang Yuan-hua, Master, Professor, Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China; Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China huang_yuanhua@ https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html, Received:2007-08-22 Accepted:2007-11-22
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kf23385083@https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html,
李斌,等. 小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态
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https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html,
海南医学院，海 南 省 海 口 市 571101；2 海南医 学院附属医院生 殖医学中心， 海南 省海口市 570102 李 斌★，男， 1979 年生，安徽 省蚌埠市人，汉 族， 2005 年安徽 农业大学毕业， 硕 士，助教，主要从 事胚胎干细胞方 面的研究。 libinliccc@ https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html, 通讯作者：黄元 华，硕士，教授， 海南医学院， 海南 省 海 口 市 571101； 海南医学 院附属医院生殖 医学中心， 海南省 海口市 570102 huang_yuanhua@ https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html,
中 图 分 类 号 :R394.2 文献标识码:B
mRNA 表达的特异性条带。④体外分化实验：能形成拟胚体，贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞。 结论：①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比，二者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体 外传代培养，获得更佳的克隆形态。②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为 1∶1 时效果较好。 关键词：人胚胎干细胞；成纤维细胞；饲养层；混合 李斌，彭秋平，卢伟英，徐雯，金应霞，黄元华.小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生 长状态[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(3):424-428 [https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html,/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-424(ps).pdf] >>本 文 导 读 <<
课题背景： 课题资金来
源于海南省重点学科经 费， 目前已成功建成并鉴 定完一株新的人胚胎干 细胞系 HN1，后续又建有 一单原核来源的人胚胎 干细胞。
应 用 要 点 ：将小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤
维细胞按照一定的比例制成混合饲养层，此方法为 本实验室最先使用，目前国内外均未见相关报道。 二者比例为 1∶1 和 1∶3 时产生的效果相近，而且 明显好于其他混合比例。混合饲养层能够更好的支 持人胚胎干细胞的体外生长，完全能够替代常规的 单一种类细胞饲养层。
同 行 评 价 ：文章选择一定比例
混合后的细胞作饲养层，不但良 好地维持了人干细胞的克隆形 态及其干细胞状态，而且明显延 长了饲养层细胞的使用寿命，减 轻操作人员的工作量，一举两 得，颇具实践意义。
文章编号:1673-8225 (2008)03-00402-05
收稿日期:2007-08-22 修回日期： 2007-11-22
材料： 实验于 2006-04/2007-07 在海南医 0 引言 人胚胎干细胞是由人的囊胚内细胞团分 离出来的一类多潜能细胞，有望为治疗人类许 多难治性疾病提供无限的细胞来源。已有许多 基础和临床研究表明，胚胎干细胞及其衍生细 胞移植后修复受损组织是可行有效的
[1-3]
学院附属医院生殖医学中心完成。 包皮来自于 行包皮环切的儿童， 由海南医学院附属医院泌 尿外科提供， 儿童家属对治疗及实验均签署知 情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。 人胚胎干细胞系 HN-1由本实验室从人类囊胚 中分离培养并鉴定。 清洁级孕12.5~14.5 d的胎 鼠11只（由海南省人民医院动物中心提供） ， 实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标 准。 设计、实施、评估者：实验设计为第一、 二作者，干预实施、结果评估为全部作者，均 接受相关技能培训，未使用盲法评估。 方法： 小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养与饲养 层的制备：将孕12.5~14.5 d的胎鼠麻醉后，去 除头、 四肢和内脏， 按常规胰蛋白酶反复消化 法获得细胞悬液进行接种培养， 待细胞生长汇 合后， 冻存部分原代细胞。 饲养层的制备参照 Robertson[11] 的方法，用丝裂霉素 C 处理 2.0~ 3.0 h后，按1×108 L-1密度接种于明胶包被的 中心皿内。 人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层 的制备： 包皮消毒后， 按常规胰蛋白酶消化法 获取细胞悬液进行接种培养， 待细胞生长汇合 后，冻存部分原代细胞。饲养层的制备同上。 混合饲养层的制备：将丝裂霉素C处理后 的小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞 分别进行计数后， 按 1∶ 0， 3∶ 1， 1∶ 1， 1∶ 3， 0∶1比例混合，然后按1×108 L-1密度接种于 明胶包被的中心皿内。
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(07-50-8-4582/ZS·Q)
。人胚
胎干细胞的传代培养首要解决的问题是抑制其 自发分化，保证细胞的全能性。目前，在体外 培养过程中，通常还是多以小鼠胚胎成纤维细 胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层来支持人胚 胎干细胞的生长
[4-10]
。 然而本实验室在长期的人
胚胎干细胞传代培养过程中发现，虽然以小鼠 胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养 层能够维持胚胎干细胞的未分化状态，但是人 胚胎干细胞的生长不能呈明显堆积状态。 本试验首次将小鼠胚胎成纤维细胞和人 包皮成纤维细胞按照一定的比例混合后制成 混合饲养层进行人胚胎干细胞的传代培养，并 与单独使用小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成 纤维细胞作饲养层细胞的培养效果进行比较， 以期为人胚胎干细胞的传代培养找到一种新 的培养方案，解决常规饲养层法培养人胚胎干 细胞时存在的问题。 1 材料和方法 设计：多样本观察比较。 单位：海南医学院，海南医学院附属医院 生殖医学中心。
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
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李斌,等. 小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态
胚胎干细胞的传代培养与克隆形态观察：用机械法 将人胚胎干细胞克隆切割成小块细胞团后，随机将细胞 团种植在新鲜制备的3种饲养层上，每日换液，6~ 7 d传 代一次，观察细胞克隆形态。 混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测： ①碱性磷酸酶检测：采用碱性磷酸酶检测试剂盒进行 检测，阳性结果为细胞克隆被染成红色，饲养层细胞 不着色，分化细胞亦不着色。先用体积分数为0.9的无 水乙醇固定常规培养5 d的人胚胎干细胞 1.5 min， 洗涤 后加入碱性磷酸酶标记试剂，室温避光15 min，当显色 充分时及时终止，镜下观察并照相。②OCT-4表达免疫 组化检测：磷酸盐缓冲液洗涤，室温下40 g/L多聚甲醛 固定15 min，经穿透、封闭后加入初始抗体OCT-4 （ 1∶ 50） ，室温作用40 min，磷酸盐缓冲液洗涤后加入FITC 标记二抗（1∶100） ，室温作用40 min后，磷酸盐缓冲 液洗涤，荧光显微镜下观察OCT-4的表达，阳性结果为 细胞克隆呈苹果绿色。 ③OCT-4和端粒酶(Tert)的mRNA 表达 RT-PCR检测：按Trizonl试剂说明提取人胚胎干细 胞 RNA 。 利 用 1 μ g RNA ， 参 照 ImProm-II Reverse Transcription System 操作手册进行反转录及 PCR扩增。 PCR产物行 2%琼脂糖电泳，紫外灯下观察 并照相。 体外分化实验：将划成小块的人胚胎干细胞克隆 移入无饲养层的35 mm培养皿中， 用不含碱性成纤维细 胞生长因子的胚胎干细胞培养液悬浮培养7~10 d， 镜下 观察。 2 2.1 结果 不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较 生长
生长于人包皮成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞， 与周围细胞交界鲜明。但克隆不饱满，无显著细胞堆积， 且克隆中心易分化，总的来说克隆仍显“单薄” 。见图2。
Figure 2
Human embryonic stem cells on human foreskin fibroblast feeder layer and surrounding cells have obvious limits, but human embryonic stem cell cloning is not full and center cells differentiate easily（×20） 图 2 生长在人包皮成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细 胞，与周围细胞交界明显，克隆不饱满，中心分化 （×20）
在小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞 =1:1 的混合饲养层上生长的人胚胎干细胞，克隆边缘清晰， 细胞隆起明显，呈显著堆积生长，饱满，克隆显得“厚 实” ，克隆形态明显好于单独使用小鼠胚胎成纤维细胞 或人包皮成纤维细胞的饲养层，见图3。
于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞，克隆边 缘清晰，与周围细胞有较明显的界限。但克隆不饱满，较 扁平，无明显细胞隆起，克隆显得“单薄” 。见图1。
Figure 3
图 3
Human embryonic stem cells on mixed feeder layer prepared by mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at a ratio of 1:1 and surrounding cells have obvious limits and human embryonic stem cell cloning is full（×20） 生长在小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞 =1∶1 的混合饲养层上的人胚胎干细胞，与周围细 胞交界明显，克隆饱满（×20）
2.2
人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态
比较 小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞的混合比 例为1∶0时，人胚胎干细胞克隆边缘清晰，克隆不饱满， 较扁平，无明显隆起，混合比例为3∶1时与其基本相似。 混合比例为1∶1时，人胚胎干细胞克隆边缘清晰，
Figure 1 Human embryonic stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder layer and surrounding cells have obvious limits and human embryonic stem cell cloning is flat（×20） 生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细 胞，与周围细胞界限明显，克隆扁平（×20）
细胞显著堆积生长，克隆隆起明显且饱满，细胞紧密， 混合比例为1∶3时与其基本相似。 混合比例为0∶1时，人胚胎干细胞克隆边缘清晰， 但克隆不饱满，无明显隆起，中心较易分化。 2.3 混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测
图1
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李斌,等. 小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态
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①碱性磷酸酶染色：生长在混合饲养层上的未分化人 胚胎干细胞红染，呈强阳性，饲养层细胞及分化克隆 均不着色（图 4a） 。②OCT-4表达免疫组化检测：未分 化人胚胎干细胞在荧光显微镜下为苹果绿色，呈强阳 性（图 4b） 。③ OCT-4和端粒酶的 mRNA的表达：未分 化 人 胚 胎 干 细 胞 RT-PCR 检 测 分 别 在 200~300 bp 和 300~400 bp处出现特异性条带（图4c） 。
能分化成机体所有细胞组织潜能的一种干细胞。在关 于人胚胎干细胞建系和体外常规培养的报道中，人们 通常采用孕 12.5~14.5 d的胎鼠成纤维细胞作为饲养细 胞来支持人胚胎干细胞的生长[4-6]。近几年，有研究者 报道人包皮成纤维细胞[7-10]、人子宫内膜细胞[12]、人胎 盘成纤维细胞[13]、人胎儿皮肤细胞 [14]及人胚胎干细胞 来源成纤维细胞 [15-17] 等多种人源细胞也能够支持人胚 胎干细胞的体外培养。但本实验室在分别使用小鼠胚 胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞做饲养细胞时发 现，虽然两种细胞均能够支持人胚胎干细胞的体外生 长，但两者均存在着一个共同的问题——人胚胎干细 胞克隆不饱满，细胞堆积生长不明显，给人一种很“单 薄”的感觉。
a: Detection of alkaline phosphatase(×50)
a: Embryoid bodies
b：Immunohistochemical detection of OCT-4 antigen (×200)
1 2 3 4 M 1 2 3 4
Tert，300-400 bp
β-actin OCT-4，300-400 bp
b：Differentiation of human embryonic stem cells into a variety of cells
Figure 5 图5
c： Specific bands of OCT-4 and telomerase mRNA appeared respectively on 200-300 bp and 300-400 bp M：marker；1：positive control；2：negative control (feeder cell)；3： blank control；4：human embryonic stem cells
Differentiation of human embryonic stem cell suspended in vitro without feeder layer(×60) 撤除饲养层人胚胎干细胞克隆在体外悬浮培养后的分 化情况(×60)
本实验将小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细 胞按照一定的比例进行混合后制成混合饲养层来支持 人胚胎干细胞的体外生长，结果表明这种混合饲养层 能够很好的维持人胚胎干细胞的未分化状态，而且人 胚胎干细胞克隆饱满，细胞堆积生长明显，克隆给人 一种“厚实”的感觉。本实验成功的应用此培养方案 进行 2次长时间的人胚胎干细胞传代培养，第 1次是将 第24代人胚胎干细胞传至42代，第2次是将解冻的第16 代人胚胎干细胞培养至30代，均能获得如图3的培养效 果。 为了对混合饲养层的培养效果进行进一步的研 究，实验中设计了不同混合比例的实验。实验结果表 明小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞为 1∶ 1 和
Figure 4 图4
Detection of human embryonic stem cell undifferented phenotypes on mixed feeder layer 混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测
2.4
体外分化实验
撤除饲养层细胞后，人胚胎干细
胞在体外悬浮培养后可形成拟胚体，贴壁后可分化为 多种形态的细胞，见图5。 3 讨论 人胚胎干细胞是从着床前囊胚的内细胞团中分离 而来的，在体外适当条件下能保持未分化状态，具有
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李斌,等. 小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态
1∶3时的效果相近，而且明显的好于其他比例混合。原 因可能在于小鼠胚胎成纤维细胞相对于人包皮成纤维 细胞的贴壁能力弱，它对干细胞的生长提供的更多的是 增殖的空间，而对于干细胞生长所需要的生长因子可能 更多的来源于人包皮成纤维细胞，因为5代以后的小鼠 胚胎成纤维细胞已不能单独很好的支持干细胞增殖。 另外本实验还发现，应用此方法后小鼠胚胎成纤 维细胞和人包皮成纤维细胞的使用寿命明显延长。目 前，本实验室相关研究中小鼠胚胎成纤维细胞和人包 皮成纤维细胞的使用寿命分别达到 16代和 23代，远超 过常规方法中细胞的使用寿命 [18]。这个发现能够让研 究人员在保持人胚胎干细胞良好增殖状态的前提下， 显著减少劳动量。综合试验结果认为，混合饲养层能 够更好的支持人胚胎干细胞的体外生长，获得更佳的 人胚胎干细胞克隆形态，完全能够替代常规的单一种 类细胞饲养层。 已有研究表明，饲养层支持胚胎干细胞生长的机制 可能是：①饲养层分泌的细胞外基质与胚胎干细胞直接 接触从而启动维持细胞不分化的信号转导途径[19]。②饲 养层通过分泌分化抑制因子抑制胚胎干细胞分化及分泌 成纤维细胞生长因子、 促有丝分裂因子促进其增殖
[20]
2 3 4 5 6 7 8 9
10
11 12
13 14 15 16 17 18
。 通
过对混合饲养层的研究，认为小鼠胚胎成纤维细胞和 人包皮成纤维细胞两种细胞所分泌的细胞外基质及各 种细胞因子间可能存在某种互补协同作用，而这种细 胞间的协同作用能够显著地提高其对人胚胎干细胞的 支持作用，使人胚胎干细胞克隆状态能够得到明显的 增强。但这种细胞间的协同作用到底是什么目前仍不 清楚，可能是某种细胞因子的活性互补增强，也可能 某一种新的不分化信号通路得到开启所造成。不过这 一切都还只是笔者推测，真正原因还需要进一步研究 才能确认。
19 20
4
1
参考文献
Bjorklund LM, Pernaute S, Chung S, et al. Embryonic stem cells develop into functional dopaminergic neurons after transplantation in a Parkinson rat model. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(4):2244-2349
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小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至 少放置15 min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一 个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS 使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全 培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2.吸除废液。 3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结 2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条 摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。 11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。 4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。 5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。 6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。 7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。 8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。 注释： MEF培养基成分：
小鼠胚胎干细胞的培养
小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展 郑晨光生科091 学号090304109 (河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018) 摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物 c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。 关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子 胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。 1 原始生殖细胞的发育 雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。 2 生殖细胞分化的基因标记 PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段 的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养 一、实验材料 1．主要仪器设备 倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 2．试剂 RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶 3．实验动物 孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。 二、实验步骤 1. 获取小鼠胚胎 (1) 取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上 (2) 75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的 皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。 (3) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整 个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸 上去除血迹。 (4) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。 (5) 将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带 有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。 (6) 将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和 内脏，得鼠胚躯干。 (7) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血 色。 2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法） (1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成 约1 mm3以下的碎块。 (2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底 离心管中。 (3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。 (4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可 见组织块变得较为粘稠）。 (5) 加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织 碎块沉淀。 (6) 每个离心管内加入5ml 1640培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到25ml的螺口的培 养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。 (7) 做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃， 5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。 (8) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底， 周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有 的是呈圆形的上皮细胞。
小鼠胚胎干细胞培养体系的建立
第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1 材料和方法 111 动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112 溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结
MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结 2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞 知识总结 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。 13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
【2018新课标 高考必考知识点 教学计划 教学安排 教案设计】高二生物：胚胎分割和胚胎干细胞
二、重难点提示 重点：1. 胚胎分割的过程 2. 胚胎干细胞的特点和应用 难点：胚胎干细胞的特点和应用
【随堂练习】 1. 胚胎分割是一种现代生物技术，关于这一技术的叙述正确的是（） A. 胚胎分割可以将早期胚胎任意分割成多份 B. 胚胎分割技术可以获得同卵双胎或多胎 C. 胚胎分割技术属于有性生殖，不属于克隆 D. 胚胎分割技术可以分割任意时期的胚胎 思路分析：在胚胎分割时要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，所以不能将早期胚胎任意分割成多份；胚胎分割移植可以看作无性生殖；胚胎分割一般要在桑椹胚或囊胚时期进行。 答案：B 2. 北京市某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，如果后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的是（） A. 用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性 B. 用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病 C. 如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术 D. 如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物 思路分析：用脐带血干细胞培养出人体需要的器官用来治疗疾病，不需要激发细胞的所有全能性。脐带血干细胞不能治疗所有疾病，如意外伤害、毒药伤害等。脐带血干细胞最大的优点就是自体移植不会有免疫排斥反应，因而不需要给他使用免疫抑制药物。 答案：C 例题1 利用胚胎干细胞治疗肝衰竭，实现此过程的最重要原因是（） A. 细胞生长 B. 细胞特化 C. 细胞分化 D. 细胞增殖 思路分析：胚胎干细胞具有发育的全能性，可以被诱导分化形成新的组织细胞，移植胚胎干细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能，因此利用胚胎干细胞治疗肝衰竭主要是利用其分化特性而实现的。 答案：C 例题2 如图为经过体外受精和胚胎分割移植培育优质奶牛的过程，请回答下列问题： （1）A细胞是____________，在进行体外受精前要对精子进行____________处理。 （2）进行胚胎分割时，应选择发育到____________时期的胚胎进行操作。 （3）②指的是____________。 （4）通过胚胎分割产生的两个或多个个体具有相同遗传性状的根本原因是
小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态
临床医学
中国组织工程研究与临床康复 第 12 卷 第 3 期 2008–01–15 出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15, 2008 Vol.12, No.3
小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞 生长状态★
李 斌1,2，彭秋平2，卢伟英1,2，徐 雯1,2，金应霞2，黄元华1,2
Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratios
Li Bin1,2, Peng Qiu-ping2, Lu Wei-ying1,2, Xu Wen1,2, Jin Ying-xia1, Huang Yuan-hua1,2
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Abstract
AIM: The key of the human embryonic stem cell culture is to guarantee the totipotency and inhibit spontaneous differentiation. There are the problems in the traditional methods that human embryonic stem cells were cultured on the mouse embryonic fibroblasts or human foreskin fibroblasts as feeder layer. We aimed to solve the problems, observe growth state of human embryonic stem cells when it was cultured on the mixed feeder layers of different proportion. METHODS：Experiments were completed in Reproductive Medical Center of Hainan Medical College from April 2006 to July 2007. ①The foreskin was from the boy who was circumcised, provided by Department of Urinary Surgery of Hospital Affiliated to Hainan Medical College. Child guardian signed an informed consent of the treatment and experiment and the experiment was approved by the hospital medical ethics committee. Human embryonic stem cell line (HN-1) was isolated from human blastocysts and identified. Eleven clean fetal mice of 12.5-14.5 d were collected and the disposal of animal conformed to the animal ethics standards during the experiments. ②The fetal mice whose heads, limbs and internal organs were removed were repeatedly digested by the trypsin to obtain cells, then cells were cultured. Parts of the original cells were cryopreserved after confluence. It was the mouse embryonic fibroblast feeder layer that cells which were treated for 2.0-3.0 h with mitomycin C were cultured in the center plate coated by gelatin at 1×108 L-1. Isolation, culture and preparation of feeder layer of human foreskin fibroblast were the same as above. Mixed feeder layer was that cells which were mixed according to 1∶0，3∶1，1∶1，1∶3，0∶1 were cultured in the center plate coated by gelatin at 1×108 L-1. ③Growth states of human embryonic stem cells were observed in three different feeder layers and undifferentiated phenotypes were detected, including expression of alkaline phosphatase, and presence of OCT-4, Tert and cell marker (OCT-4). Without feeder layer, human embryonic stem cell differentiation was observed in vitro. RESULTS：①Comparison of human embryonic stem cell growth state on different feeder layers: Colonies of human embryonic stem cells on the mouse embryonic fibroblast feeder layer and human foreskin fibroblast feeder layer was both flat and thin, but those on the mixed cells feeder layer were full and thick. The clonal morphology of the mixed feeder layer, overall, was significantly better than others. ②Comparison of human embryonic stem cell growth state on the mixed feeder layers prepared by different ratios: When mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts were mixed at a ratio of 1∶1 human embryonic stem cells accumulated significantly and cloning edge was clear, obvious and full. No significant changes were found at 1∶3. It was significantly better than others. ③Detection of human embryonic stem cell undifferented phenotypes on mixed feeder layer: Expression of alkaline phosphatase and OCT-4 antigen were strongly positive. Specific bands of OCT-4 and telomerase mRNA appeared respectively on 200-300 bp and 300-400 bp. ④Differentiation experiment in vitro: Human embryonic stem cells on mixed feeder layer was able to form embryoid bodies and differentiate into a variety of cells. CONCLUSION： ①Comparison with conventional feeder layers prepared by mouse embryonic fibroblasts or human foreskin fibroblasts, the mixed cells feeder layer may be better suitable for human embryonic stem cell culture in vitro and obtain better human embryonic stem cell clonal morphology. ②The feeder layer mixed at a ratio of 1∶1 can get better effect. Li B, Peng QP, Lu WY, Xu W, Jin YX, Huang YH.Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratios.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12 (3):424-428(China) [https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html,/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-424(ps).pdf] 摘要
目的：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维 细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题，观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态。 方法：实验于 2006-04/2007-07 在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。①对象：包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南 医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞 系 HN-1 由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕 12.5~14.5 d 的胎鼠 11 只，实验过程中对动物的处置符合动物 伦理学标准。②实验方法：将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇 合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素 C 处理 2.0~3.0 h 后，按 1×108 L-1 密度接种于明胶包被的中心皿内，即小鼠胚胎成纤维 细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按 1∶0，3∶1，1∶1， 1∶3，0∶1 比例混合，然后以 1×108 L-1 密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。③实验评估：观察体外传代培养 的人胚胎干细胞在 3 种不同饲养层上的生长状态。并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4 表 达免疫组化检测、OCT-4 及端粒酶 mRNA 表达 RT-PCR 检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 结果：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较：生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆 扁平、不饱满，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②人胚胎干细 胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较：小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞按 1∶1 混合时，人胚胎干细胞显著堆积 生长，克隆边缘清晰、隆起明显且饱满，按 1∶3 混合时无明显变化，优于其余 3 种混合比例。③混合饲养层上人胚胎干细胞未 分化状态的检测：碱性磷酸酶染色及 OCT-4 抗原表达均呈强阳性，分别在 200~300 bp 和 300~400 bp 处可见 OCT-4 和端粒酶
Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China; 2 Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China Li Bin ★ , Master, Assistant, Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China；Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China libinliccc@https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html, Correspondence to: Huang Yuan-hua, Master, Professor, Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China; Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China huang_yuanhua@ https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html, Received:2007-08-22 Accepted:2007-11-22
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110004
kf23385083@https://www.360docs.net/doc/5c9374448.html,
C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定
-C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定 广东学药学院 报ournJa lfoGuang dngo ParmhceutiaalcUn ievrsty i unJ 2．14， 030（3） C 7 5胚小胎神经鼠干胞的分离、培细与养定 鉴 12 万丽 1 易，林，桦贝伟 剑（ 1 广．药学院东中医药研究 / 广东省院代性谢病疾中医防 治药重实点室验，家国中医药理局管脂高血调肝降脂症重研点 究室/ 国家中药管理医局代谢脂级实三室验，东广广 5州10006 ；．2中大学山生科命学院干学胞研究细室，广广州东510 006）培 养神经干胞细（NSCs ）并，对其行进鉴定方。采法用动手 法胰蛋白酶消化及法摘：要的体外分目离分离、鼠脑细胞胎，用化的无优血清NS C 培s养基行进养培。细胞疫免光荧检法测N CSs特异性标记子 3 d分左获右得大未分量化巢呈悬浮状生的长表的达结。果分离脑的细体胞培外养48 h已部分大壁贴神，经干胞细团第 3 代时，。少很见到贴细壁胞，几乎是神全球，经
神经球周围在存较多刺微。细表胞达一中种间丝蛋白，即巢 蛋白（nes ti）n 。论结成功分、离鉴定出C57小鼠 NSsC， 并在体外可件条进下行传扩增培代养。关键词：C 57 胎小胚；鼠经干细胞；神胞细培；养蛋巢白中分图类：号Ｒ392 文献 志标码 A：d i： 10．o396 9 j/．sin．1s060873．8214003．0．22878 （3 214）0 00354340 章文编号：0016 -Is laoion，t culurtean d iedtifnciaitnoo f eunalrste mcel sl rfmoC5 e7bmyorin mccieW N Ai1L， IYHual n2 ，iBEI W iejia1n 1．（uGnagdogn TMCKey L abratory ofroM taboelc iisDaees，s Ky eLbarotorayo Modfluaintg Lievrt oTrat HepeyripemlaiS ATM， anC Ldeev 3l Labraotroyo f Liid Mpteboaism SAlTM，CIn stiute oftChinese edMciinla Sicneec，GsuagnongdPha racemtucail UinvesrtyiGuan，gzohu5 1006，0hCin；a 2．St m eCle Ｒlseeacrh Depratmne，t choSlo o fifL Sceeicens， uS nYtasn Ueinersivyt， Guagnzhou， 50006，1China） bsArtatc：Obejtivc Toei slotae cu，turl aned deitnfiy hte eunarlste m cllse（ SCN ）s． Meth od NSsCs for mftal eimce ewe irsloteda bydi sesticon ad nnzeyatmi dcgiestoin a，n ductlrude ni he opttima slreufreem SCN mdeimu． he Tpesifcicb ioamker orf
成纤维细胞
成纤维细胞 科技名词定义 中文名称：成纤维细胞 英文名称：fibroblast 定义： 普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶 原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 疏松结缔组织中的成纤维细胞 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的 间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚， 多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁
大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成 和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维 细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分 重要的作用。 目录 细胞的功能活动状态划分 来源 特征 创伤修复 分离培养 原代培养 展望 展开 编辑本段 细胞的功能活动状态划分
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌 活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核 小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。[1] 编辑本段 来源 成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平 细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。前 胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞 外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶 原分子（tropocollagen ）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具 有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。 编辑本段 特征 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细 胞(mesenchymalcell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维 细胞(fibrocyte)的