4-2 急性毒性试验程序与急性毒性评价
第二节急性毒性试验程序与急性毒性
评价
一、急性毒性试验程序
(一) 急性试验剂量分组
探讨外来化合物急性毒性应首先测定其半数致死剂量或浓度(LD50或LC50)。
对一个未知毒性的外来化合物求其LD50(LC50)，应先做预试验。
做预试验方法很多，这里仅介绍其中一种。
首先了解分析受试化合物的化学结构和其理化性质，确定其所属已知化合物或其衍生物的种类，有何特殊基团及其分子量、熔点、沸点、比重、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等，依此查阅文献，找出与受试化合物化学结构与理化性质近似的化合物的毒性资料，并以其LD50(LC50)值作为受试化合物的预其毒性中值；但应注意，一定是相同动物种系和相同接触途径。
以此预期毒性中值为待测化合物的中间剂量组，再上下各推一到两个剂量组做预试验。
每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化合物的致死剂量范围。
初起组距可用剂量间的4倍差，即以log4(log4＝0.6)来划分各组剂量。
求外来化合物LD50时设置几个剂量组较为合适，应依预试验结果而定。
一般设置5~7个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。
每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠6~8只、家兔4~6只，若设计采用霍恩氏法计算LD50时，动物数可减少。
每组动物应雌雄各半；如化合物毒性有性别差异，则应分别求雌、雄性动物各自的LD50(LC50)。
(二) 观察持续时间
测定外来化合物的LD50(LC50)，一般要求计算实验动物接触化合物之后两周内的总死亡数。
对于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率。
也可仅计算24小时的死亡率，有些速杀性化合物的24小时LD50与两周LD50值往往没有差别。
但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础。
在观察期间应保障实验动物有完全的膳食、充足的饮水及适宜的温湿度环境，以防止动物出现非中毒性死亡。
(三) 症状观察
观察实验动物接触外来化合物的中毒症状是了解该化合物急性毒性的十分重要的一环，是补充LD50这个参数不足的重要方面。
故应详细地观察动物的中毒症
状、发生和发展过程及规律，死亡前症状特点、死亡时间等等。
这有助于揭示化合物甚至同类化合物的不同衍生物的急性毒性特征。
很多化合物在实验动物接触的初期往往先出现兴奋现象，有的化合物在动物接触的初期首先表现为抑制现象，在观察期间应注意观察其体重变化。
这有助于了解受试化合物所致的中毒效应是短暂的或较长期的效应。
此外，不少化合物还可以引起受试实验动物粘膜刺激症状，如出汗、流涎，甚至有血性分泌物，瞳孔改变等。
(四) 病理学检查和其它指标观察
二、急性毒性评价
应当重视病理组织学检查。
凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检查，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，并对有变化的脏器作病理组织学检查。
对存活动物于观察期结束后应做病理学检查。
外来化合物的急性毒性分级标准用于对急性毒性进行评价。
但各种分级标准还没有完全统一。
我国目前除参考使用国际上几种分级标准外，又提出了相应的暂行标准。
不论我国或国际上的急性毒性分级标准均还存在不少缺点，因为它们主要是根据经验确定，客观性还不足。
表4-3工业毒物急性毒性分级标准
表4-4化合物经口急性毒性分级标准
表4-5外来化合物急性毒性分级(WHO)
兔经皮对人可能致死的估计量
总量
g/kg(g/60kg)
联合国世界卫生组织推荐了一个五级标准(表4-5)。
总之，从表4-3到表4-5可见各种分级标准有相同之处，也有相异之点，但都有不完善的地方。
急性毒性试验
试验步骤和操作要点
1
试验设计
2
确定试验物质的给药途径、剂量和
暴露时间，合理设计试验组和对照
组，以确保试验数据的可比性。
3
数据分析
4
收集和整理试验数据，进行统计分 析和结果解读，评估化学物质的毒
性潜力和危害等级。
试验准备
准备动物和试验物质，并遵守试验 室安全和伦理规定，保证试验过程 的准确性和可靠性。
试验操作
按照设定的方案进行实验操作，严 格控制剂量和暴露时间，记录动物 的毒性反应和不良效应。
试验结果的解读和评价标准
急性毒性试验结果一般以LD50值为指标进行解读，在国际上有一系列评价标准，用于评估化学物 质的毒性程度和危害等级。
试验的局限性和改进方向
1 动物模型的局限性 2 测试方法的改进
动物模型不能完全代 表人类生物反应，因 此在试验结果的解读 和评估时需要谨慎考 虑。
急性毒性试验
急性毒性试验是一种评价化学物质对生物体的短期毒性潜力的试验方法，通 过暴露一定剂量的物质给实验动物，观察其对动物的毒性反应以及产生的不 良效学物质对生物体的毒性程度及其可能产生的危害， 为了规范评估过程，国际上制定了一系列的试验方法和评价标准。
常用的试验方法和原理
需要进一步发展和改 进更精准、准确的试 验方法，以提高试验 结果的预测性和可比 性。
3 替代和替补模型
发展替代和替补模型， 例如体外细胞实验和 计算机模拟，以减少 对动物实验的依赖。
试验的应用领域和意义
急性毒性试验在化学品安全评估、药物研发、环境保护等领域具有重要意义， 为保障人类健康和环境安全提供科学依据。
LD50试验 通过确定半数致死剂量（LD50）来评估化学物质的毒性，以毫克/ 千克体重作为单位。 急性口服毒性试验 通过将一定剂量的物质通过口服给予 动物，观察其对动物的毒性反应，用于评估化学物质的毒害程度。 急性皮肤 毒性试验 通过将一定剂量的物质涂抹于动物皮肤上，观察皮肤反应和毒性症 状，用于评估化学物质的皮肤刺激和毒害作用。
急性毒性试验
三、给药方法 (一)动物禁食 动物购入后应在实验室观察1星期，口服给药前，为减少吸收差异和大容量 给药造成胃急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食4 -6h，要求一夜停食(不停水)， 投药后再停食3-4h。 (二)给药途径 中药新药除临床给药途径外，—、二类新药还希望其他给药途径，水溶性 药 物应同时采用静脉给药途径，其他如油剂，混悬剂之类可采用皮下给药途径。 腹腔汁射在人体极少用，中药粗制剂成分复杂，动物毒性试验中也尽可能少 用，以避免腹腔刺激性的干扰。 各给药途径的容量一般为小鼠0．4—0．5ml／20g(体重)，大鼠lml／ l00g(体重)。小鼠口服最大容量不超过0．8ml／20g(体重)，其他途径不超过 0．5ml／20g(体重)。大鼠口服最大容量不超过2ml／l00g(体重)，其他途径不 超过lml／l00g(体重)。
第二节 急性毒性试验方法
一、LD50的测定 最小致死量是使动物刚好致死的药物剂量，但由于药物的性质，给药方法 和个体差异，每只动物的最小致死量确很大的差异，实验和统训学原理表明 一群动物最小致死量的平均值相当于半数致死量。半数致死量测定方法很多， 但实验没计大同小异，所不同者为算方法的不同，其试验方法如下： 预试验：目的是找出0％及100％估计致死量。更确田地说是找到—个0死亡 的最大剂量和100％死亡的最小剂量的估值以决定实验中采用的最大剂量(Dm) 和最小剂量(Dn)，，这在测定中非常重要，是实验成败的关键。可用雌或雄 性动物，设四组以上，每组3-4只，先用1；10的剂量比给药(如5mg／kg、 50mg／kg、500mg／kg、5000mg／kg固定剂量)。观察7日，记录死亡动物数。 然后在死亡数4／4和0／4两组之间按1；2(如50mg/kg、100mg/kg、200mg／ kg、400mg／kg)以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的0和100％死亡 率。
急性毒性试验
Sx50=0.0307 logLD50及其95%可信限 =0.6329±1.96×0.0307=0.6329±0.0602 小鼠的经口LD50为4.29g/kg，其95%可信范围 为3.74~4.93g/kg
急性毒性评价
外源化学物相对毒性分级标准
急性毒性分级（WHO）
鱼类急性毒性分级
LD50的局限性
急性毒性试验方法
一、急性毒性
急性毒性指人或动物一次或24 h
之内多次接触外源化学物后，在短
期内所发生的毒性效应，包括致死 效应。
一次：指瞬间给实验动物染毒，如经
口、经静脉注射染毒。
24 h之内多次：指外源化学物毒性过 低，需给予动物较大剂量。
急性毒性效应出现的快慢和毒性反应的强 度与外源化学物的性质和染毒剂量的大小 有关。
20只动物的完全随机分配
完全随机分配后各组所属动物号
20只动物完全随机分配的结果
20只动物的完全随机分配
动物编号 随即数字 除4后余数 1 54 2 2 83 3 3 80 0 4 53 1 5 90 2 6 75 3 7 53 1 8 78 2 9 93 1 10 47 3 11 72 0 12 09 1 13 54 2 14 66 2 15 95 3 16 44 0 17 68 0 18 67 3 19 67 3 20 86 2
由急性毒性试验可得到两类毒性参数
上限参数 是以死亡为终点的毒性，包 括绝对致死量、半数致死量、最小致 死量、最大耐受量等；
下限参数 是以非致死性急性毒作用 为终点的毒性，包括急性阈剂量和无 作用剂量等。
用小动物试验可求出外源化学物对一种或几种 实验动物的急性LD50或LC50; 用 大 动 物 试 验 可 求 出 近 似 致 死 剂 量 （approximate lethal dose, ALD）; 根据LD50 （LC50 ）值可进行急性毒性分级，以 初步评价外源化学物对机体急性毒性大小和急 性毒作用的强度。
4-2 急性毒性试验程序与急性毒性评价
第二节急性毒性试验程序与急性毒性评价一、急性毒性试验程序(一) 急性试验剂量分组探讨外来化合物急性毒性应首先测定其半数致死剂量或浓度(LD50或LC50)。
对一个未知毒性的外来化合物求其LD50(LC50)，应先做预试验。
做预试验方法很多，这里仅介绍其中一种。
首先了解分析受试化合物的化学结构和其理化性质，确定其所属已知化合物或其衍生物的种类，有何特殊基团及其分子量、熔点、沸点、比重、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等，依此查阅文献，找出与受试化合物化学结构与理化性质近似的化合物的毒性资料，并以其LD50(LC50)值作为受试化合物的预其毒性中值；但应注意，一定是相同动物种系和相同接触途径。
以此预期毒性中值为待测化合物的中间剂量组，再上下各推一到两个剂量组做预试验。
每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化合物的致死剂量范围。
初起组距可用剂量间的4倍差，即以log4(log4＝0.6)来划分各组剂量。
求外来化合物LD50时设置几个剂量组较为合适，应依预试验结果而定。
一般设置5~7个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。
每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠6~8只、家兔4~6只，若设计采用霍恩氏法计算LD50时，动物数可减少。
每组动物应雌雄各半；如化合物毒性有性别差异，则应分别求雌、雄性动物各自的LD50(LC50)。
(二) 观察持续时间测定外来化合物的LD50(LC50)，一般要求计算实验动物接触化合物之后两周内的总死亡数。
对于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率。
也可仅计算24小时的死亡率，有些速杀性化合物的24小时LD50与两周LD50值往往没有差别。
但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础。
在观察期间应保障实验动物有完全的膳食、充足的饮水及适宜的温湿度环境，以防止动物出现非中毒性死亡。
(三) 症状观察观察实验动物接触外来化合物的中毒症状是了解该化合物急性毒性的十分重要的一环，是补充LD50这个参数不足的重要方面。
急性毒性试验使用技术说明
急性毒性试验使用技术说明毒性试验是评估化学品、药品、食品等物质对人体健康的危害程度的重要方式之一。
其中急性毒性试验被广泛运用于药物研发、化学工业、食品生产等领域中。
本文旨在介绍急性毒性试验的使用技术，希望为相关领域从业人员提供一些有价值的参考。
1、实验室准备实验室是进行急性毒性试验的关键场所。
在进行实验前，有必要做好实验室的准备工作，以确保实验的准确性和安全性。
首先，实验室应有完善的配备。
仪器设备、试剂物品、动物品种等设备要齐全，保证各种条件下都能准确执行试验。
其次，实验人员要接受专业训练，掌握实验技能，能够准确执行实验步骤，确保错误率的最小化。
最后，在进行实验时，实验室应实行严格的安全管理制度，保证安全操作。
2、实验步骤急性毒性试验一般包括口服、皮肤接触、静脉注射等不同方式的试验。
此处以口服试验为例子，具体实验步骤如下：（1）实验前的注射控制在实验开始前，要提前选用健康状态良好、体状均匀的小鼠进行注射，检查小鼠的MedDRA和文献纪录和行为的合适性。
（2）药物给药将小鼠随机分成各组，分别给予相同剂量的药物，以及对照组的生理盐水，以评估药物对小鼠口服的毒性。
药物在实验过程中需遵循国际公认的实验流程，严格按照规定剂量进行投药喂食。
（3）观察反应在小鼠口服后的一定时间内，实验人员应准确记录小鼠出现的毒性反应。
如呼吸急促、朦胧、食欲减退、神经功能障碍等。
根据实验的需要，可以设定不同的观察时间，以便获得更加详细和准确的数据。
3、急性毒性试验指标在进行急性毒性试验时，需要通过一系列指标对小鼠的反应进行评估。
以下列举几个重要指标：（1）主观症状针对小鼠出现的主观症状，如神经功能障碍、冻僵、的颤抖等，进行记录，其出现的时间、持续时间和严重程度都是反映药物毒性的可靠指标。
（2）生理学指标根据实验对象的不同，分析包括血液、尿液、粪便的生理学指标，如血糖、尿素含量、粪便颜色等，可以有效判断毒物的毒性程度。
（3）组织学变化可以通过取样,对小鼠的内脏或组织进行检查和观察，来判断毒物对器官和组织的毒性作用。
急性毒性试验
三、给药方法
(一)动物禁食
动物购入后应在实验室观察1星期，口服给药前，为减少吸收差异和大容量 给药造成胃急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食4 -6h，要求一夜停食(不停水)， 投药后再停食3-4h。
(二)给药途径
中药新药除临床给药途径外，—、二类新药还希望其他给药途径，水溶性 药
物应同时采用静脉给药途径，其他如油剂，混悬剂之类可采用皮下给药途径。 腹腔汁射在人体极少用，中药粗制剂成分复杂，动物毒性试验中也尽可能少 用，以避免腹腔刺激性的干扰。
(一)观察指标
不能把求得致死剂量看作是急性毒性实验的唯一要求。发现毒性症状及毒性反应 的靶器官同样是急毒实验非常重要的目的。给药前后应观察体重、进食、进水的状 况，密切观察异常毒性症状，特别是给药后的一、二日。以后1日至少观察1次，观 察7 日观察症状包括①行动：不安定、多动、发声；②神经系统反应：举尾、振颤、 痉挛、运动失调、姿态异常；③自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流汨、排尿、 下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸；④死亡。应每日记录体重、毒性反应和死亡情况， 濒死动物应单独饲养，死后及时解削进行肉眼观察和病理组织学观察。试验结束存 活动物也进行解剖，如有病变进行组织学观察。
(二}致死剂量计算
可用Bliss点斜法、简化机率法、改进寇氏序贯法等计算最小致死量或半数致死量。 Bliss法严谨精确，缺点是计算非常繁复。但近代有计算机软件，汁算方法可推荐 Bliss法。各种方法原则基本相同，如：①剂量刘数值应为等差，即剂量应按等比级 数排列；②各组动物数应相等；③死亡率应在50％上下基本对称分布等。但各种方 法还各有特殊设计要求，如有的要求Dm和Dn必须为100％和0％死亡率等，可参考有 关专著，此处不赘述。如受试物毒性低，测不出LD50，可求得最大给药量。
毒性分级标准
第二节急性毒性试验程序与急性毒性评价一、急性毒性试验程序(一) 急性试验剂量分组探讨外来化合物急性毒性应首先测定其半数致死剂量或浓度(LD50或LC50)。
对一个未知毒性的外来化合物求其LD50(LC50)，应先做预试验。
做预试验方法很多，这里仅介绍其中一种。
首先了解分析受试化合物的化学结构和其理化性质，确定其所属已知化合物或其衍生物的种类，有何特殊基团及其分子量、熔点、沸点、比重、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等，依此查阅文献，找出与受试化合物化学结构与理化性质近似的化合物的毒性资料，并以其LD50(LC50)值作为受试化合物的预其毒性中值；但应注意，一定是相同动物种系和相同接触途径。
以此预期毒性中值为待测化合物的中间剂量组，再上下各推一到两个剂量组做预试验。
每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化合物的致死剂量范围。
初起组距可用剂量间的4倍差，即以log4(log4＝来划分各组剂量。
求外来化合物LD50时设置几个剂量组较为合适，应依预试验结果而定。
一般设置5~7个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。
每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠6~8只、家兔4~6只，若设计采用霍恩氏法计算LD50时，动物数可减少。
每组动物应雌雄各半；如化合物毒性有性别差异，则应分别求雌、雄性动物各自的LD50(LC50)。
(二) 观察持续时间测定外来化合物的LD50(LC50)，一般要求计算实验动物接触化合物之后两周内的总死亡数。
对于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率。
也可仅计算24小时的死亡率，有些速杀性化合物的24小时LD50与两周LD50值往往没有差别。
但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础。
在观察期间应保障实验动物有完全的膳食、充足的饮水及适宜的温湿度环境，以防止动物出现非中毒性死亡。
(三) 症状观察观察实验动物接触外来化合物的中毒症状是了解该化合物急性毒性的十分重要的一环，是补充LD50这个参数不足的重要方面。
急性毒性实验流程
急性毒性实验流程一、实验前的准备。
要做急性毒性实验啦，那可得好好准备一番呢。
首先得确定实验的对象，是小动物呢，还是其他的什么。
要是小动物的话，像小白鼠之类的，就得找个靠谱的来源，确保它们健康得很。
然后就是实验场地啦，得打扫得干干净净的，不能有什么脏东西或者干扰因素。
那些实验器材也得检查检查，像喂食管啊，注射器之类的，可不能出岔子。
还有啊，实验用到的药品得准备齐全，并且要清楚地知道它们的性质和用法，可别到时候手忙脚乱的。
二、实验动物的处理。
好啦，动物到手了，咱得好好对待它们呢。
要先给它们编号，就像给它们取个小名字一样，这样才能区分开来。
然后呢，要确定给它们喂药或者注射药物的剂量。
这个剂量可是很有讲究的，要根据不同的实验要求和动物的体重之类的因素来计算。
给动物喂药的时候，要小心一点哦。
如果是口服的药，得想办法让它们乖乖吃下去，可不能强来。
要是注射的话，那技术就得过关啦，可不能让小动物太疼了。
在这个过程中，还得观察动物的反应，看它们有没有什么异常的表现，比如是变得特别兴奋呢，还是无精打采的。
三、观察阶段。
这时候就开始认真观察啦。
观察的时间也是有规定的，不是随便看看就了事的。
要时刻盯着这些小动物，看它们的行为有没有变化。
比如说它们的活动量是不是减少了，或者是它们的饮食有没有受到影响。
还要看看它们的身体外观有没有变化，像毛发是不是变得乱糟糟的，眼睛有没有什么异样。
这个时候可不能马虎哦，哪怕是一点点小变化都可能是很重要的线索呢。
而且观察的频率也要合适，不能隔太长时间才看一次，也不能一直盯着让小动物有压力。
四、数据记录。
在观察的过程中，可别忘了记录数据呀。
这个数据记录就像是写日记一样，把看到的动物的各种表现都写下来。
什么时候开始有变化的，变化的程度是多少，这些都要清清楚楚地记录。
数据记录可不能瞎编哦，一定要实事求是。
要是记录错了，那整个实验可就白做了。
而且记录的时候也要有条理，不要写得乱七八糟的，这样以后分析数据的时候才能一目了然。
[医药]急性毒性试验
LD50法
※动物 ●种类：小鼠 ●体重：18∼22 g/只 ●分组：一般6组 ●每组动物数：10∼20只〔每组动物数相
等〕 ●性别：雌、雄各半
LD50法
※剂量组 ●最高剂量：达到或接近使动物100%死亡 ●最低剂量：达到或接近动物0%死亡 ●中间设3个剂量组 ●另设对照组
LD50法
※剂距：0.60∼0.90,常用0.70 ∼0.8 各组间成等比级数
※给药容量：0.2 mL／10gBW 灌胃最大容量可达0.8 mL/只
LD50法
※观察—观察期14天 ●观察重点：死亡 ●体重 ●征状 ※结果：分性别根据各剂量组的死亡率用
Bliss法计算LD50
固定计量法
●动物：首选大鼠
●剂量：5、50、500和2000 mg/kg
●观察终点：明显的毒性反应
●实验：
用2000 mg实 验
2000
用500 mg实 验
无严重急性 毒性危险性
上下法〔阶梯法〕
※主要用于： ●口服化学药物的急性毒性试验 ●动物死亡发生于给药后1～2天内的药物
※优点：节省动物
上下法
※动物 ●种类：啮齿类,一般选用大鼠 ●性别：单一性别,一般选用雌性 ●周龄：实验时8～12周 ※实验 ●限度实验：适用于毒性可能较小的受试物 ●主实验：适用于估计有明显毒性的受试物
固定剂量法
※正式实验 ●结果判断
剂量
5
50
存活<100%
高毒
有毒或高毒用
（LD50≤ 25） 5 mg实验
存活100%毒 性明显
有毒（LD50 25～ 200）
有害 （LD50 200～
2000）
存活100%无 用50 mg实验 用于500 mg
2022年医学专题—第四章--急性毒性作用及其试验方法
5级，剧毒
4级， 中等毒
3级，低毒
2级， 实际无毒 1级，无毒
大鼠经口 LD50(mg/Kg 体重）
＜1
大约相当于 体 重 7 0 Kg 人的致死剂 量
稍尝，＜7 滴
几种化学物质急性毒性举例
肉毒杆菌毒素（致死量30～ 50mg人）
1～50
7 滴 ～ 1 茶 对硫磷（6～15） 西力生（30）
第二十二页，共二十二页。
第十七页，共二十二页。
4查表
第十八页，共二十二页。
第十九页，共二十二页。
第二十页，共二十二页。
第二十一页，共二十二页。
内容(nèiróng)总结
第四章 急性毒性作用及其试验方法。急性毒性和急性毒性试验。是研究(yánjiū)一次或24小时内 多次给予实验动物被检化学物后，观察在短期内（一般7天）引起动物毒性表现的实验。眼球突出、 眼球震颤。因急性毒性实验中，动物的中毒症状以及死亡，一般多出现在给予被检物后24～48h以内。 Zac值的大小可反应急性阈剂量距离LD50的宽窄。小动物常设5～10个剂量组，每组6～10只。 t=0,±1,±2，±3。4查表
2 急性毒性试验
是研究一次或24小时内多次给予实验动物(dòngwù)被检
化学物后，观察在短期内（一般7天）引起动物毒性表 现的实验。
第二页，共二十二页。
3 急性毒性试验的目的
(1) 测定受试物对一种或几种实验动物的半数致死 量（LD50），以初步估计其对人类毒 害的危险性。
(2) 了解受试物的毒性强度、性质和可能的靶器官，阐 明受试物急性毒性的剂量反应关系。
需预试。
2 剂量(jìliàng)分组
❖ 小动物常设5～10个剂量组，每组6～10只。首先确定最高、最 低量两个组，分别可使动物90％和10％死亡。