实验二 微生物基因组DNA提取和鉴定
微生物DNA提取方法
细菌基因组DNA的提取方法综述1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。
B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。
C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4oC保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
31) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。
3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。
微生物基因组DNA提取ppt课件
4．加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，10000*g，离心 4min。将上清液转入一个新管中。 5．加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀， 10000*g,离心5min，将上清转入一只新管中。 6．加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来 ， 12000*g,离心5分钟，去上清，用 70%乙醇洗涤。 7．7500*g,离心5min，弃上清，自然干燥，重溶于 30μl 的TE缓冲液。
四、注意事项——材料准备
最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量 较少，提取前先富集
四、注意事项——细胞裂解
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： • 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶
微生物基因组 DNA提取
一、实验原理
2、核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
基因组dna提取实验报告
基因组dna提取实验报告基因组 DNA 提取实验报告一、实验目的本次实验的主要目的是从不同的生物样本中提取高质量的基因组DNA，以便进行后续的分子生物学实验，如 PCR 扩增、基因测序等。
通过本次实验，掌握基因组 DNA 提取的基本原理和操作方法，了解影响 DNA 提取质量的因素，并对提取的 DNA 进行质量检测和分析。
二、实验原理基因组DNA 提取的基本原理是利用细胞裂解液破坏细胞膜和核膜，使细胞内的物质释放出来，然后通过蛋白酶 K 消化蛋白质，去除 RNA 等杂质，再利用酚/氯仿等有机溶剂抽提，将蛋白质、多糖等杂质去除，最后通过乙醇沉淀或异丙醇沉淀得到纯净的基因组 DNA。
三、实验材料与试剂（一）实验材料1、新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）2、植物叶片3、细菌培养物（二）实验试剂1、细胞裂解液（含 TrisHCl、EDTA、NaCl、SDS 等）2、蛋白酶 K3、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）4、无水乙醇5、 70%乙醇6、 RNA 酶 A7、 3M 醋酸钠（pH 52）8、 TE 缓冲液（10 mM TrisHCl，1 mM EDTA，pH 80）（三）实验仪器1、离心机2、移液器3、恒温水浴锅4、紫外分光光度计5、电泳仪及电泳槽四、实验步骤（一）动物组织基因组 DNA 提取1、取约 01g 新鲜的动物组织，放入 15ml 离心管中，加入 1ml 细胞裂解液，用剪刀将组织剪碎，然后在冰上放置 10min。
2、向离心管中加入20μl 蛋白酶 K（20mg/ml），充分混匀，在 55℃水浴锅中孵育过夜，直至组织完全消化。
3、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），轻轻颠倒离心管10min，使溶液充分混匀。
4、 12000rpm 离心 10min，将上清液转移到新的离心管中。
5、重复步骤 3 和 4 一次。
6、向上清液中加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠（pH 52）和 2 倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒离心管，可见白色的 DNA 沉淀出现。
DNA的粗提取与鉴定_实验报告.ppt
3.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶 于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少 的DNA。 4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯胺 可以作为鉴定DNA的试剂。
2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1 蒸馏水
3.溶解细胞核内的DNA
2 mo1／L 的 NaCl 溶液 40 mL
4.析出含DNA 的黏稠物
蒸馏水
5.滤取含DNA 的黏稠物
6.将 DNA 的黏稠物再溶解 2 mol／L 的 NaCl 溶液 20 mL
7.过滤含DNA 的 NaCl 溶液
8.提取含有杂质较少的DNA 9.DNA 的鉴定
二、方法与过程
1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）
0.1g/mL柠檬酸钠100mL 500mL烧杯中，玻棒搅拌，
活鸡鲜血180mL
离心、分离或静置沉淀。
2.提取DNA
⑴.提取血细胞核物质：
①取血细胞5-10mL＋20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向 快速搅拌。
②纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。 ③原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒快速 搅拌，机械加速血细胞破裂。
练习
1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。
．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的 是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会 由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难； 第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功 与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解； 第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、 对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将 DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定， 这是对整个实验的结果的检测。
细菌基因组DNA提取及分光光度法定量
细菌基因组DNA提取及分光光度法定量一、目的1. 熟悉并掌握SDS裂解法提取细菌基因组DNA的基本方法。
2. 了解基因组DNA的分光光度法定量及荧光检测。
二、原理基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事。
细菌基因组是环状DNA，在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA。
因此要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。
另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。
在提取过程中EDTA的作用就是螯合二价金属离子，起到抑制核酸酶活性的作用。
制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。
大肠杆菌染色体DNA抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）及CTAB破裂细胞，SDS具有的主要功能是：(1)溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；(3)SDS 能与蛋白质结合成为R1-O-SO3R2-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。
“CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA”破细胞后蛋白质经等体积苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去，之后用洒精沉淀回收DNA。
DNA提取与测序实验报告
DNA提取与测序实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取 DNA 的基本原理和方法。
2、熟悉 DNA 测序的基本流程和操作要点。
3、学会对 DNA 提取和测序结果进行分析和评估。
二、实验原理DNA 提取原理DNA 在细胞中以与蛋白质结合的状态存在。
提取 DNA 的基本思路是通过裂解细胞，使细胞膜和核膜破裂，释放出 DNA，然后去除蛋白质、RNA 等杂质，得到纯净的 DNA。
常用的裂解方法包括物理方法（如研磨、超声破碎）、化学方法（如使用去污剂）和酶解法（如使用蛋白酶K）。
去除杂质的方法则包括使用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等。
DNA 测序原理目前常用的 DNA 测序技术是 Sanger 测序法。
其基本原理是在DNA 合成过程中，通过掺入特定的双脱氧核苷酸（ddNTP）来终止DNA 链的延伸。
由于 ddNTP 缺少3’OH 基团，一旦掺入到 DNA 链中，链的延伸就会终止。
通过在多个反应中分别加入不同的 ddNTP，可以得到一系列不同长度的 DNA 片段。
这些片段经过电泳分离，根据条带的位置可以读取 DNA 的碱基序列。
三、实验材料与设备实验材料1、新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉）或植物组织（如叶片）。
2、细胞培养物（如细菌、酵母）。
实验试剂1、细胞裂解液（包含去污剂、蛋白酶 K 等）。
2、酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1）。
3、无水乙醇、70%乙醇。
4、 TE 缓冲液（10 mM TrisHCl，1 mM EDTA，pH 80）。
5、 DNA 测序试剂盒（包含引物、dNTP、ddNTP、DNA 聚合酶等）。
实验设备1、离心机。
2、移液器。
3、恒温水浴锅。
4、电泳仪。
5、凝胶成像系统。
6、 DNA 测序仪。
四、实验步骤DNA 提取步骤1、样本处理对于动物组织，将其剪碎后加入适量的裂解液，在匀浆器中匀浆。
对于植物组织，先在液氮中研磨成粉末，然后加入裂解液。
对于细胞培养物，离心收集细胞，加入裂解液重悬。
DNA的粗提取与鉴定PCR蛋白质的提取与分离
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链 四个亚铁红素基团
一、血红蛋白的提取和分离 1.分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多 少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的 蛋白质。
方法步骤 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液
加入物质
目的 ① ② ③ ④ ⑤
2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1 蒸馏水 3.溶解细胞核内的DNA 4.析出含 DNA 的黏稠物 5.滤取含 DNA 的黏稠物 6.将 DNA 的黏稠物再溶解 7.过滤含 DNA 的 NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的DNA 冷却的 95％的酒精 50 mL A:(1)向试管中加入0. 015 mol ／L 的 NaCl 溶液 5mL (2)加入 DNA 9.DNA 的鉴定 (3)4 mL 二苯胺试剂 B:(1)向试管中加入0.015mol／L 的 NaCl 溶液 5mL 2 mol／L 的 NaCl 溶液 20 mL 2 m1／L 的 NaCI 溶液 40mL 蒸馏水
答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出
3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色
答：D
4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液? 答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于 上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以 要除去上清液(含有蛋白质)。
二、方法与过程
1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）
0.1g/mL柠檬酸钠100mL 500mL烧杯中，玻棒搅拌， 离心、分离或静置沉淀。 活鸡鲜血180mL 2.提取DNA。 ⑴.提取血细胞核物质： ①取血细胞5-10mL＋20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向 快速搅拌。 ②纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。 ③原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速 搅拌，机械加速血细胞破裂。 ⑵.溶解核内的DNA： 滤液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向 轻缓搅拌。
实验二植物基因组DNA的提取ppt课件
5.
保存
10000 r/min 离心10分钟
注意事项
➢ 在整个实验过程中应严格执行无菌操作； ➢ 部分药品有毒，操作中应注意安全防护； ➢ 磨样时最好是加液氮，磨样速度要快，使材料处于低
温状态 。 ➢ 刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要
轻柔！ ➢ 抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免
实验二植物基因组DNA的提取
背景知识
植物细胞中有哪些细胞器中含有DNA？ 与动物细胞的差别？
背景知识
DNA的存在形式
背景知识
DNA的存在形式
背景知识
DNA的存在形式
核苷酸 双螺旋结构
+组蛋白 一级结构-核小体
二级机构-螺线管
三级结构-超螺旋管
四级机构-染色体
背景知识
DNA的存在形式
DNA的理化性质
实
验
离心机：3台/12管 水浴锅：65℃
仪 研钵：10个
器 移液枪（包括枪头）
实 新鲜菠菜叶片
验 材
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 、三羟甲基氨基 甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、 氯化钠、Tris饱和酚、异丙醇、β-巯基乙醇、
料 无水乙醇、氯仿、异戊醇、液氮、聚乙烯吡咯
无水乙醇、氯仿、异戊醇、液氮、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)
1ml酚-氯仿-异戊醇
5mol/l EDTA
8ml
1ml酚-氯仿-异戊醇
酚1m:氯l酚仿-氯:异仿戊-异醇戊=注2醇5:2意4:1：4此0ml方法会把少量RNA提取出来，故后面通称核酸的提取。
取20ml前面配制的氯仿-异戊醇+20mlTris饱和酚
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四、实验步骤
2、DNA电泳检测 （ 3）上样电泳：将 20μLDNA 样品溶液和 5μL上样缓冲液混 匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置， 判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 （4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧 毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中10min左右，进入暗 室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。
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四、实验步骤
2、DNA电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，加入20mL 1×TAE 缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡 2-3 次，使琼 脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的 凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （ 2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃， 以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中， 加样孔靠近阴极的一端。
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五、实验结果与分析
1 2 3 4
图1 微生物组织基因组DNA提取结果
9提取 （1）将10mL过夜培养的大肠杆菌DH5α装入15mL离心管中， 4000r/min离心15min，弃上清。 （2）加入 560μL TE缓冲液，将菌体重悬后转移至 1.5mL离 心管中。 （3）加入30μL 100g/LSDS溶液和30μL 2mg/mL蛋白酶K溶 液，混匀后，37℃水浴放置30min。 （4）加入100μL 5mol/LNaCl溶液，充分混匀。 （ 5 ）加入 80μL 50g/LCTAB-0.5mol/LNaCl 溶液，混匀后， 65℃水浴放置10min。
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四、实验步骤
1、DNA的提取 （ 6 ） 加 入 600μL 氯 仿 / 异 戊 醇 ， 上 下 颠 倒 混 匀 后 ， 12000r/min离心5min，将上清吸入新离心管中。 （ 7 ） 加 入 预 冷 的 异 丙 醇 ， 上 下 颠 倒 混 匀 后 ， -20 ℃ 沉 淀 30min。 （8）12000r/min离心10min，弃上清。 （9）加入1mL 75%乙醇溶液，充分混匀。 （10）12000r/min离心10min，弃上清。 （11）加入20μL TE缓冲液，混匀后，即为DNA溶液。
实验二 微生物基因组DNA的提取和鉴定
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一、实验目的
学习并掌握从微生物中提取基因组DNA方
法及其原理。
2
二、实验原理
（1）微生物破碎细胞方法：溶菌酶、SDS裂解。 （2）破碎抽提核酸除去杂质： ①首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离； ②使核酸与蛋白质分离； ③除去脂类； ④多糖的除去。 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞， 随后用氯仿/异戊醇抽提，可以得到微生物基因组DNA。
三、仪器和试剂
1、仪器： 低速离心机、高速冷冻离心机、恒温摇床、稳压电源、 水平电泳槽、凝胶成像系统。 2、材料与试剂： 过夜培养的大肠杆菌DH5α、TE缓冲液、100g/LSDS、 2mg/mL蛋白酶K、5mol/L NaCl、50g/LCTAB-0.5 mol/L NaCl、氯仿/异戊醇=24:1（V/V）、异丙醇、1×TAE、 琼脂糖、上样缓冲液。