光密度法测定微藻生物量

光密度法测定微藻生物量沈萍萍，王朝晖，齐雨藻，谢隆处，王艳（暨南大学水生生物研究所，广东广州510632）［摘要］目的：为准确而又快速的测量微藻生物量.方法：选用15种不同微藻，在实验室中分别测定其细胞密度及光密度并进行直线回归分析，同时采用吸光系数来估算浮游植物生物量.结果：得出了浮游植物吸光系数与细胞碳含量（即生物量）的回归方程：Ig （!）=-1.0465In （"）+4.2551.结论：这是一种利用光密度法来测量微藻生物量的简单有效的方法.［关键词］微藻；吸光系数；生物量；碳含量；光密度法［中图分类号］@949［文献标识码］A［文章编号］1000-9965（2001）03-0115-05藻类的生物量测定是藻类生长、生理生化、生态等方面研究的必要手段，藻类生物量测定方法很多，常使用的有：计数细胞个体数，测干重，叶绿素法，浊度法，最大比生长速率法等［1］.通常的显微直接计数法，光密度（OD ）测量法，叶绿素测量法，COunter 电子显微计数法等各有优缺点.最后一种方法由于大多数微藻形状不规则，加之仪器本身昂贵，因此在一般实验室中应用并不普遍.而叶绿素法操作复杂且所需样品量较大，相比而言直接计数法和光密度法适用的范围就广泛的多.到目前为止，计数细胞个体数仍然是最准确，最令人满意的方法之一，可以获得最基本的种群信息［2］.但对于微藻来说，大小相差很大，小的只有几个微米，大的可达几百微米，而且形态各异，有的是单细胞（运动或不运动），有的是群体，其体型也多种多样，有球形、椭圆形、锥形、链状、丝状等.因此微藻的直接计数法不但工作量大，不同种类间由此估算的生物量差异也较大.光密度法操作简单，需要样品量少，能够实现快速测定.因此我们在实验室培养中期望能找到一条简便有效的途径，准确而又快速的测量出微藻的生物量.!材料与方法!.!藻种实验选用了5种绿藻，4种甲藻，1种金藻，1种针胞藻，1种棕囊藻作为实验材料.均由暨南大学水生生物研究所藻种室提供.其形态特征［3］及大小见表1.!."方法藻种培养于20C ，光照度4000Ix ，光暗比为1211121.待培养4~5c ，用754-UV 分光光度计在600~750nm 之间每隔10nm 进行波长扫描，绘制吸收曲线，确定最大吸收峰波长.然后将藻液稀释成浓度梯度，在最大吸收峰处测其OD 值，同时显微计数.小于10!m 的藻，用血球计数板计数，大于10!m 的藻用0.1mL 浮游植物计数框计数细胞密度（至少计数3次）.以OD 值对细胞密度作图，求其吸光系数.［收稿日期］2000-11-15［作者简介］沈萍萍（1975~），女，山东青岛，98级硕士研究生.第22卷第3期2001年6月暨南大学学报（自然科学版）JOurnaI Of Jinan University （NaturaI Science ）VOI.22NO.3Jun.2001表!微藻形态特征微藻名称（学名）形状特征大小是否群体扁藻（Platymonas elliptica）细胞卵圆型.具有两条鞭毛，20~24（11~16）!m X12~否游动活泼.15（11~14）!m X7~10!m绿微小小球藻和蛋白核小球藻单细胞，球形.否（Chlorella minutissima直径3~5!m和C.pyrenoidosa）直径3~10!m盐藻（两株）（Dunaliella salina Strain1）（Dunaliella salina Strain2）单细胞，梨形.无细胞壁，有两条鞭毛，游动活泼.Strain122!m X14!mStrain29!m X3!m否藻羊角月牙藻单细胞，呈镰刀形弓状，无8~12!m X5~6!m否（Selenastrum copricornutum）鞭毛，不能运动.异鞭藻微球藻（Nanochlorpsis Sp.）单细胞，圆形，无鞭毛.直径2~4!m否海洋原甲藻（Prorocentrum micans）单细胞，一侧较扁，另一侧圆弧形.具鞭毛，运动.30!m X20!m否甲锥状施氏藻（Scrippsiella trochoidea）单细胞，细胞前端锥形，底端钝圆.有时聚集在一起.20!m X15!m否具有鞭毛，能够运动.塔玛亚历山大藻单细胞或少数几个细胞连接40!m X45!m否/是（Alexandrum tamarense）成链状.具鞭毛，能运动.藻红色裸甲藻单细胞，无细胞壁，具有30!m X20!m否（Gymnodinium sanguineum）鞭毛，游动.金藻球等鞭金藻（Isochrysis galbana）裸露的运动细胞，椭圆形.具有两条等长的鞭毛，运动缓慢.5~6!m X2~4!m X2.5~3!m否针胞藻赤潮异湾藻（Heterosigma akashiwo）单细胞，呈长椭圆形，具鞭毛，能游动.15!m X10!m否定鞭藻球形棕囊藻（两株）（Phaeocystis globosa）HK株ST株圆形或卵圆形单细胞及球形群体两种形态，群体有胶质囊.单细胞具有两条等长鞭毛，运动活跃.直径3~8!m是"结果与讨论".!吸收曲线与标准曲线由各种微藻的吸收曲线可以看出：藻类的吸收光谱曲线具有明显的相似性，最大吸收峰即光密度值位于670~680nm处.吸收峰与微藻色素种类组成及含量有关，从不同藻类吸收峰值来看，具有一致性，670~680nm之间的吸收峰，一般是细胞内色素的吸收峰.因为藻类都含有叶绿素a［3］，差别只在于含量的多少，例如绿藻含有叶绿素a、D的含量高于其它藻类，金藻中胡萝卜素占细胞内色素总量的75%［4］.所以选择合适的波长有利于藻类比色测定的准确度，结果具有可比性，便于种类间比较研究.出于实验目的，我们选择680nm作为测量波长［5］.611暨南大学学报（自然科学版）2001年由标准曲线可以看出：不同生长期，尤其是对数期的微藻个体数与光密度值基本成正比.不同浓度的藻液与细胞密度之间的相关系数均较好.但较特殊的是细胞较小的藻种，如小球藻、微球藻等，可能因为藻细胞过小，密度过大，在显微镜下计数时容易出现较大的人为误差，同时当微藻的光密度测量值过高超过0.8（例如微球藻）或者过小低于0.05时（例如几种甲藻），对于微藻数量的测定也有很大的影响，将大大降低其准确度，相关性不显著.所以制作一条精确的标准曲线，必须同时考虑到细胞的密度与细胞本身的大小以及形态，对于提高微藻的计数准确度具有关键的作用.经回归分析，微藻的细胞密度与光密度之间呈直线关系，其吸光系数（即斜率K ）各不相同，这与微藻本身的特性有关，例如：藻体体积大小、内容物的含量、颜色及分布或运动情况等.斜率K 与细胞大小（体积）有关，不同种微藻（例如微小小球藻、蛋白核小球藻、微球藻、棕囊藻等），细胞大小（体积）相近，其相关的吸光系数也比较接近.而细胞大小（体积）相差较大的同种微藻（盐藻）或不同种微藻，其吸光系数相差较大.可以看出，细胞体积越大，吸光系数越小；相反，细胞体积越小，其吸光系数越大.而且，形状越规则的细胞，光密度与细胞密度之间的相关性愈好.例如小球藻、微球藻、棕囊藻、球形等鞭金藻等，而如甲藻类细胞形状多样，且细胞体积较大，其相关性明显较差.!.!生物量与吸光系数的关系另外按照文献［6］中方法计算出微藻的体积，然后利用公式（lg （m ）=0.94lg （V ）-0.6其中m 为碳含量，V 为细胞体积）将体积转化为生物量［7］，得出结果如表2所示.将生物量与吸光系数进行回归，发现两者之间存在关系如下.回归方程：y =-l.0465ln （x ）+4.255l 即：lg （m ）=-l.0465ln （x ）+4.255l 相关系数；R 2=0.77l 4（>0.388=R 20.0l ，I =l5），极显著.其中m 为生物量，x 为吸光系数.所以只要测得单种微藻或者混合藻类的吸光系数，就可以直接求得它们的生物量，从而大大简化浮游植物生物量的测定方法.微藻的形状多样，如球形，椭圆形及锥形、镰刀形等，又有单细胞、群体之分，其中有的具有鞭毛，能够游动，而有些不具备运动能力，因此使得显微计数方法相对复杂且结果不十分准确.同时细胞大小差别较大，因此用细胞个体数量来表达生物量很难取得一致，结果不够精确，没有可比性.相反，光密度法能够较好的处理以上缺点，并且操作简便，结果相对准确."结论这种光密度法在实际中具有应用价值，除了能够简化测定纯种培养中微藻生物量的方法外，在野外调查中，例如微型浮游植物大小一般小于20!m 大于2!m ，在通常生态研究中往往忽略，现在随着检测技术和方法的进步，实际上已经证明微型浮游植物在水域生态系统的生物地球化学循环和能量流动种占有重要地位［8~l0］.但是由于它们体积微小，在普通的观测方法中往往观察不到，利用光密度法测定它们的生物量，不仅可以使生态研究更精确，同时又简化测定程序.7l l 第3期沈萍萍等：光密度法测定微藻生物量表!各种微藻的细胞密度与光密度回归直线，相关系数!!及体积、生物量等比较微藻种名（学名）直线回归方程（R2）P值V/!m3生物量（lg m）吸光系数（斜率K）扁藻Y=406.24X<0.0l709.4l2.08406.240（Platymonas elliptica.）（0.9987）微小小球藻Y=3375.7X<0.0522.830.683375.700（Chlorella minutissima）（0.9622）蛋白核小球藻Y=3682.4X<0.05l9.860.623682.400（C.pyrenoidosa）（0.975l）盐藻l Y=l2l.2l X<0.05l537.942.40l2l.2l0（Dunaliella salina Strainl）（0.9328）盐藻2Y=l73.67X>0.0528.890.77l73.670（D.salin Strain2）（0.89l2）羊角月牙藻Y=994.45X<0.0l l78.30l.52994.450（Selenastrum copricornutum）（0.9877）微球藻Y=3266.6X<0.05l5.290.5l3266.600（Nanochlorpsis Sp）（0.9488）海洋原甲藻Y=28.92l X0.052996.002.6728.92l （Prorocentrum micans）（0.8357）锥状施氏藻Y=ll3.24X>0.05l270.602.32ll3.240（Scrippsiella trochoidea）（0.8764）塔玛亚历山大藻Y=25.243X>0.05l9702.273.4425.243（Alexandrum tamarense）（0.8903）红色裸甲藻Y=l5.242X>0.0532l0.002.70l5.242（Gymnodinium sanguineum）（0.8987）球形等鞭金藻Y=95l.59X<0.0l l6.480.5495l.590（Isochrysis galbana）（0.9897）赤潮异湾藻Y=l33.8l X<0.05428.00l.87l33.8l0（Heterosigmaakashiwo）（0.9779）球形棕囊藻HK Y=l l28X<0.0544.580.95l l28.00（Phaeocystis globosa HK）（0.9722）球形棕囊藻ST Y=l348.7X<0.0577.04l.l7l348.70（Phaeocystis globosa ST）（0.9787）当然，这种方法选择叶绿素活体吸收常数亦有限制因素，因为叶绿素含量与藻类的生长条件，尤其是光照强度及其它因子有很大的关系，因此不同地域生态研究中这一相关性具有不同的特点.野外条件下生长的微藻与实验室培养的藻细胞生长周期可能不同，大多数藻达不到同步生长，体内叶绿素含量有差别，因此应该在实验室中继续进行模拟野外条件下混合微藻的OD值与生物量之间的关系的研究.8l l暨南大学学报（自然科学版）200l年［参考文献］［1］周永欣，章宗涉.水生生物毒理试验方法［M ］.北京：农业出版社，1989.179.［2］STEIN J R.Dry weight ，volume and optical density.In ：Stein J R.Handbook of Phycological Methods ：CultureMethods and Growth Measurements ［M ］.New York ：1973.21.［3］HAROLD C B ，MICHEAL J W.Introduction to the Algae ，Structure and Reproduction ［M ］.2nd ed.New Jersey ：Prentice -Hall ，Inc ，Englewood Cliffs ，1985.17~20.［4］郑重.海洋浮游生物学［M ］.北京：海洋出版社，1984.17，120.［5］张志良.植物生理学实验指导［M ］.北京：高等教育出版社，1990.78~88.［6］孙军，刘东艳，钱树本.浮游植物生物量研究I.浮游植物生物量细胞体积转化法［J ］.海洋学报，1999，21（2）：75~85.［7］EPPLY R W ，REID F M H ，STRICKLAND J D H.The ecology of the plankton off La Jolla ，California ，in the periodApril through September 1967Part !.Estimates of phytoplankton crop size ，growth rate and primary production ［J ］.Bull Scripps Inst Oceanogr ，1970，17：33~42.［8］孙书存，陆健健，张利华.流式细胞仪在微型浮游植物生态学中的应用［J ］.生态学杂志，2000，19（1）：72~78.［9］BURKILL P H.Biogeochemical cycling in the northwestern Indian Ocean ：a brief overview ［J ］.Deep Sea ResearchII ，1993，40（3）：59~62.［10］LE BOUTEILLER.Size distribution pattern of phytoplankton in the western Pacific ：towards a generation for tropicalopen ocean ［J ］.Deep Sea Research ，1992，39：501~509.An optical density method for determination of microalgal biomassSHEN Ping -ping ，WANG Zhao -hui ，OI Yu -zao ，XIE Long -chu ，WANG Yan（Institute of Hydrobiology ，Jinan University ，Guangzhou 510632，China ）［Abstract ］Aim ：To investigate the relationship between optical density （OD ）and the biomass of microalgae.Methods ：15microalgal species were used under laboratory conditions to study the relation-ship between the cell density and its related OD.Meanwhile ，the optical absorption coefficient ，namely the slope of the linear graph which showed the relationship between cell density and OD ，was utilized to estimate the phytoplankton biomass.Results ：Regression analysis results showed the linear function ：lg （!）=-0.4511ln （"）+4.2422，in which #is the carbon content and "is the optical absorption co-efficient of microalgae.Conclusion ：This is a useful and rapid OD method to measure the biomass of microalgae.［Key words ］microalgae ；optical absorption coefficient ；biomass ；carbon content ；OD911第3期沈萍萍等：光密度法测定微藻生物量光密度法测定微藻生物量作者：沈萍萍， 王朝晖， 齐雨藻， 谢隆处， 王艳作者单位：暨南大学水生生物研究所,刊名：暨南大学学报(自然科学与医学版)英文刊名：JOURNAL OF JINAN UNIVERSITY年，卷(期)：2001,22(3)被引用次数：49次1.周永欣;章宗涉水生生物毒性试验方法 19892.Stein J R Dry weight,volume and optical density 19733.HAROLD C B;MICHEAL J W Introduction to the Algae,Structure and Reproduction .2nd ed 19854.郑重海洋浮游生物学 19845.张志良植物生理学实验指导 19906.孙军;刘东艳;钱树本浮游植物生物量研究I.浮游植物生物量细胞体积转化法 1999(02)7.EPPLY R W;REID F M H;STRICKLAND J D H The ecology of the plankton off LaJolla,California,in the period April through September 1967 Part Ⅲ.Estimates of 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