动物疫苗中灭活剂与佐剂的种类及其作用
04第四章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂(兽医生物制品学)
温度越高，灭活越快，灭活作用随温度上升而加速。在低温时，温 度每上升10C，细菌死亡率可成倍增加。每升高10C，金属盐类的灭菌 作用增加2-5倍，石炭酸的杀菌作用增加5-8倍。但是，如果温度超过 40C 或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。
(五)pH
在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但 抗原性易受破坏。灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛溶液浓度 高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。
附：
用乙烯亚胺衍生物对病毒进行灭活，当灭活结束时，应中止灭活并 除去其残存物，以免继续作用而损害疫苗的免疫原性。采用的方法是： 在乙烯亚胺衍生物灭活的病毒液中加入过量的硫代硫酸钠或亚硫酸钠， 不论是0.05%AEI或0.02%BEI，病毒液中硫代硫酸钠最终浓度均为2%， 以中断灭活剂灭活作用。
此外，-丙内脂（-propiolactone）也是一种良好的病毒灭活剂， 它是一种不稳定的液体，于37C 2h后能自行水解为无毒物质。
注意：这里指的是甲醛的浓度，并非福尔马林的浓度！
(二) 苯酚
酚类是以羟基取代苯环上的氢而形成一类化合物。苯酚(phenolum)， 又称石炭酸(acidum carbolicum)，为具有特殊气味的无色结晶，易潮解， 溶于水及有机溶剂，见光则颜色变深，置于空气中易被氧化，颜色也变深， 所以应避光保存。
三、影响灭活作用的因素
(一) 灭活剂的特异性
某些灭活剂只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物 则效力很差。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%石炭酸溶液 于数小时内能杀死细菌的芽胞。阳离子表面活性剂抗菌谱广，效力快，对 组织无刺激性，能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细菌 芽胞作用弱。
兽用疫苗保护剂和佐剂
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖） 5g，加脱脂乳至 100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
2．明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 将 12%~18%明胶液、 30%蔗糖液和 6%~12%硫脲液加热溶解， 116℃高压 灭菌30~40min；
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；
• 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，
增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存
7．脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素
8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。
氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法:
（1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3· 18H2O
兽用疫苗冻干保护剂 和佐剂
冻干保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞） ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
05生物制品的佐剂保护剂灭活剂
(二) 白油Span佐剂
用 轻 质 矿 物 油 ( 白 油 ) 作 油 相 ， 用 Span-80( 去 水 山 梨 醇 单 油 酸 酯 ) 或 Span-85(去水山梨醇三油酸酯)及吐温-80(Tween-80)(聚氧乙烯脱水山梨 醇单油酸酯)，作为乳化剂制成的油乳佐剂，是当前兽医生物制品中最常 用最有效的佐剂之一。白油佐剂的配制方法很多，比例互有差别，仅举一 例作为参考，即：
存
化十八烷基三甲铵。
型
胺及其类似物：癸胺、癸胍及其他。
核酸及类似物：DNA、RNA、低核苷酸、多聚核苷
酸、环磷酸腺苷等。
药物：左旋咪唑及蜂胶等
佐剂的作用机理
各种佐剂的作用机理不尽相同，但概括起来有如下方面
1．对抗原的作用
(1) 增加抗原分子的表面积 某些佐剂颗粒表面可以吸附许多抗原，使抗原表面积明显
这些细胞增殖发挥更大作用。有些佐剂，如短小棒状杆菌、百日咳杆菌和 葡聚糖等，主要作用于巨噬细胞，使之激活，大量增殖分化，释放白细胞 介素-1等细胞因子，再去活化T细胞和B细胞。被激活的T细胞进一步分泌 各种细胞因子，进而促进B细胞和巨噬细胞功能。 对T细胞的作用
一些佐剂的主要作用对象是T细胞，通过T细胞的介导，增强各种免 疫功能。胸腺素、分枝杆菌及其有关成分如卡介苗及MDP等、香菇多糖、 异丙肌昔、左旋咪吐、二乙胺基二硫代甲酸钠（DTC）等均为T细胞增强 剂。它们作用于胸腺细胞系统，诱导T细胞前体细胞的产生，T细胞大量增 殖分化，形成效应淋巴细胞，产生淋巴因子。
被分散的物质称为分散相，承受分散的液体称为连续相，这两相间的 界面活性物质称为乳化剂。当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相
时，制成的乳剂为油包水型(W/O)，反之为水包油型(O/W)。 油包水型油乳佐剂粘稠，在机体内不易分散，抗原从乳剂中缓慢释
兽用疫苗保护剂与佐剂(57页)
• 50＜：运动粘度71112 / 3左右 *紫外吸收八25()-35()＜(). 1 %，紫外消光系数＜12X108； •单环芳烃 与双环芳烃含量低干0.5%，无多环芳烃； •小鼠腹腔注射0+51111或家免皮下注射2.01111^油，观察60山 表现正
常。
乳剂配方与乳化方法
(1) 剂在水屮法： 将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生 成0州乳剂。若欲
得从/0型，可继续加入油，直到发生变型。该 法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅
拌而得到较好的乳ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
(2) 剂在油屮法：
将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相屮得如水相 直接加入油相，得到〜
/0型，如欲得0/〜，继续加入至变型。该 法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在 0.5^0!左右，比较稳定。
蔗糖76.626、磷酸二氢钾0.528,磷酸氢二钾1.648、谷氨酸钠0.»相、牛血 淸白蛋 白10心 加去离子水至1000111],混合溶解，过滤除菌、
免度佐剎
一、佐剂概念与作用机理
1.佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物 质称为佐剂。
佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同 时注射于动物 体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗 原的特异性免疫应答，发挥 其辅佐作用的物质.
施汽吹沸熟化10111«»调节卩14 6.9土
6万皁升沸水屮，搅拌均 匀;倒入
0.1，继续熟化3111111»稳定卩?1
硫酸100kg,爆沸至棕 褐色，经30
6.9 十 0+1
〜后，加温 水，边加边搅拌约垔
总踅为 357；升：用前加水稀杼
至 100万品扑，温度约为80°0, 盛
生猪常用疫苗的种类以及合理的使用
生猪常用疫苗的种类以及合理的使用当前的生猪疫病多且复杂，难防难治。
免疫是生猪综合防疫中的一个重要环节，合理的选择和使用疫苗对生猪有计划的进行免疫，以提高生猪对某些疫病的特异抵抗力，减少生猪疫病的发生，进而构建养猪业生物安全的体系。
本文主要介绍目前生猪常用的疫苗种类以及合理使用方法，供参考。
标签：生猪；疫苗；种类；使用一、猪常用疫苗的种类猪常用疫苗主要有猪瘟、猪蓝耳病、猪口蹄疫、猪丹毒、猪肺病、仔猪副伤寒、猪伪狂犬、猪细小病毒、猪大肠杆菌、猪链球菌、猪传染性胸膜肺炎、猪喘气病等等。
这些疫苗又可分为灭活疫苗、弱毒疫苗、单价疫苗、多价疫苗、联合疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等。
现简要介绍以下常用的五种疫苗：1.弱毒活疫苗微生物的自然强毒株通过物理、化学、生物等方法，使其丧失致病力或引起亚临床感染，却能保持良好的免疫原性、遗传特性的毒株用以制备的疫苗，如猪瘟兔化弱毒疫苗及猪蓝耳病弱毒疫苗。
其优点是疫苗能在动物体内繁殖，接种少量的免疫剂量即可产生坚强的免疫力，免疫期长。
2.灭活疫苗将细菌或病毒利用物理的或化学的方法处理，使其丧失感染性或毒性，而保持免疫原性，接种动物后能产生主动免疫的一类生物制品。
如O型猪口蹄疫灭活疫苗和猪气喘病灭活疫苗等。
其优点是疫苗性质稳定，使用安全，易于保存与运输，便于制备多价苗或多联苗。
3.基因缺失疫苗是用基因工程技术将强毒株毒力相关基因切除后构建的活疫苗，如伪狂犬病缺失疫苗。
优点是：安全性好，不易返袓；免疫原性好，产生免疫力坚实；免疫期长，尤其是适于局部接种，诱导产生粘膜免疫力。
4.多价疫苗是指将同一种细菌或病毒的不同血清型混合而制成的疫苗，如猪链球菌病多价血清灭活疫苗和猪传染性胸膜肺炎多价血清灭活疫苗等。
其优点是：对多血清型的微生物所致疫病的动物可获得完全的保护力，而且适于不同地区使用。
5.联合疫苗是指由两种以上的细菌或病毒联合制成的疫苗，如猪丹猪、猪巴氏杆菌二联灭活疫苗和猪瘟、猪丹毒、猪巴氏杆菌三联活疫苗。
第三章 灭活剂 保护剂 与免疫佐剂
真菌以及革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌对各类灭活剂的敏
感性并不完全相同；细菌的繁殖体及其芽孢对化学药物的 抵抗力不同；生长期和静止期的细菌对灭活剂的敏感程度 也有一定差别。此外，细菌的浓度也会影响灭活的效果。
灭活剂浓度：以甲醛为例，甲醛浓度越高，灭活脱毒越
快，但抗原损失量亦较大。有时可以将甲醛溶液分数次加 入，加量由小至大，PH值由低到高，温度由室温开始， 逐步提高到允许的最高温度，这样对于保护抗原的免疫原 性有一定好处。
灭活温度：通常情况下，灭活作用随温度上升而加速。
但如果温度超过40℃或更高，对微生物的抗原性将有不利 影响。
灭活时间：灭活时间与灭活剂浓度和作用温度密切相关。
赋形剂：主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧
化，保护活性物质不受加热的影响，使冻干制品形成多孔 性、疏松的海绵状结构，从而使溶解度增加，如蔗糖、山 梨醇、乳糖、PVP(聚乙烯吡咯啶酮）葡萄糖等。常为高 分子物质。
抗氧化剂：可抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性
物质在冻干后储存期间的稳定性，如维生素C、维生素E 和硫代硫酸钠等。
2、非渗透剂，如聚乙烯吡咯啶酮和蛋白质等，能防止细 胞等生物活性物质由外向内渗透溶质。
非渗透性保护剂按相对分子质量大小可分为：
高分子物质和低分子物质
按化学性质，可分为：
复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物
一、冻干保护剂的组成与作用
营养液：可使因冻干而受损伤的细胞修复，对水分子其
缓解作用，并能使冻干生物制品仍含有一定量的水分；还 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度，如脱脂乳、蛋白胨、氨基酸和糖类等，常为 低分子有机物。
一般随着灭活剂浓度及作用温度升高，灭火时间则缩短。 在生物制品生产中，应以保证制品安全和效力，采用低灭 活剂剂量、低作用温度和短时间处理为最佳。
鸡新城疫灭活疫苗三种佐剂乳化效果的比较
鸡新城疫灭活疫苗主要是 由甲醛灭活后与油佐 剂混合乳化制成 。所有 的乳化剂分子都是 由极性 的 亲水基 团和非极性 的亲油基团两部分组成 ，而且两 部分分处分子的两端 ， 形成不对称的结构。这样的分 子结构使得乳化剂分子一部分可溶于水 ，另一部分 易于和油相结合 。乳化剂的作用就在于使用机械作 用分散所得 的液滴不互聚集结 ，在成品质量方面要 通过 试验对不同乳化剂进行研究 ， 以便指导生产。
冷库 冻 胚 １ ２ 小时左右 ， 即１ ２ ０小时 收 获 。 收获 是 用 自动 收 获 机进 行 ， 调 整好 收 获 时 间 ， 保 证 收获 的病 毒
疫灭活疫苗 ， 至今 己在欧洲 、 亚洲等许多国家推广使
用。 １ ９ ８ ３年 ， 中 国兽 医监察 所 、 哈 尔滨兽 医研 究所 、 北
将 制备 好 的疫 苗 每组 分 别 进 行 观 感 、剂 型 、 粘
１ 材 料 和 方 法 １ ． １ 试 验 材 料 和 实验 动 物
磷 酸 氢 二钠 、 磷 酸 氢二 钾 、 氯 化 钠 等 试剂 均 购 自 国药集 团药 业 股份 有 限公 司 ，试 验 所 需试 剂 为 同批 次 。注射 用水 由本 单 位制备 ， 保存 时 间 ６小 时 。一支 ８道 移 液 器 ， ９ ６孔 “ Ｖ ”形 微 量 反 应 板 ， 自动 接 种 机 （ 需 灭 菌 部件 已经 灭 菌 ） ， 自动 收 获 机 （ 需 灭 菌部 件
液质量 ， 留样做半成品检验 ， 其余进行灭活。 配制浓度为 ０ ． ８ ５ ％的生理盐水 ， １ ２ １ ｏ Ｃ 高压灭菌 ３ Ｏ 分钟。Ｓ Ｐ Ｆ 鸡翅下静脉采血 ， 与等量阿氏液混合 ， 配制 １ ％鸡 红细胞 悬 液 。 对收获 的病 毒 液进行 红 细胞 凝集 试 验 ，选取 其 血凝 效 价 ≥１： ２ ５ ６的再 进 行病 毒
免疫佐剂种类及在动物疾病防疫中的应用
Summarize and reviews | 综述与专论156 ·2021.130 引言疫苗的使用防止重大疫病的发生，在动物和病毒间建立起坚固的防线。
目前已经研制和使用的兽用的疫苗有300多种，按照类别可分为弱毒苗、灭活苗、合成苗、生物苗等，我国每年的疫苗销售总额在492亿以上。
疫苗的使用为我国畜牧业的发展做出重要贡献。
兽用疫苗的研制是依据病毒的致病机制，预先在机体能产生病毒分泌的抗原，让侵入体内的病毒失去活性。
但疫苗和病毒本身一样，不是在每个接种者身体一定会产生抗体。
因为接种程序或者接种者的身体机制的原因会造成接种失败。
疫苗接种后都不会检测免疫应答水平，造成非免疫者出现，在病毒侵害时无法获得防护[1]。
为了提高疫苗接种后的免疫应答水平，人们调查发现疫苗在体内产生抗体中可通过特殊的物质提高疫苗的抗体表达的几率。
人们将能提高免疫抗体表达的物质称为免疫佐剂。
研究发现在使用免疫佐剂的情况下，免疫应答率平均提到10%～25%。
1 免疫佐剂研究进展免疫增强剂是在疫苗诞生后40年才有理论基础，在人类接种疫苗后发现免疫后的人群还存在未免疫的情况。
在对无免疫应答的人群进行调查后发现，除疫苗接种程序、接种时机、身体健康状态外，健康的人也有未获得免疫的情况。
为增加疫苗进入机体产生抗药获得免疫，人们发现在使用某些物质后能增加抗原生产的可能。
经过多年的努力研发，现在的免疫增强剂的研究已成为解决增强疫苗免疫应答的首要手段。
在对疫苗的免疫应答表现的研究中发现，在新技术生产的疫苗中，获得免疫应答的能力较弱。
这主要是新型的疫苗主要采用的小分子的疫苗形式，小分子疫苗在机体内因为合成抗原的路径较长造成抗原表达有可能出现异常。
免疫增强剂的主要作用是协助疫苗快速的产生抗原。
通过对疫苗作用机制的不断探索，现在已经确定有免疫增加作用的免疫增强剂类型有6种，在实际生产中应用的免疫增强剂有400多种。
在提高免疫水平中起到重要作用。
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动物疫苗中灭活剂与佐剂的种类及其作用
摘要介绍了动物疫苗中的灭活剂和佐剂的种类及其作用,以期为灭活剂和佐剂的推广应用提供参考。
关键词动物疫苗;灭活剂;佐剂;种类;作用
动物疫苗种类包括弱毒苗和灭活疫苗,在灭活疫苗生产过程中,必然涉及灭活剂和佐剂,二者的安全性和效力也决定了疫苗的质量和推广应用效果。
1疫苗灭活剂
灭活是指破坏病原体的生物学特性,但尽可能避免影响其免疫原性或破坏血清中补体活性的过程。
常用的灭活剂有甲醛、β-丙内酯(BPL)或其他有效灭活剂。
1.1甲醛
甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质,其既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A,G,U),又可作用于病毒壳蛋白。
作用于病毒壳蛋白时,易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集,不能再作用于壳蛋白内的核酸。
这样,病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏,并可能有病原体存活。
用甲醛灭活时间长,一般需要在37～39℃处理24h以上或更长时间,使用浓度一般为0.1%。
其灭活的效果易受温度、pH值、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响,残留的游离甲醛若随疫苗注入机体后,会产生制激性反应。
1.2β-丙内酯
β-丙内酯(Beta-Propiolactone,BPL)在国外已广泛用于各种疫苗的灭活,是一种杂环类化合物,沸点155℃,常温下是无色粘稠状液体,对病毒具有很强的灭活作用。
能作用于病原体DNA或RNA,改变病毒核酸结构达到灭活目的,而不直接作用于蛋白,不破坏病原体的免疫原性。
大剂量β-丙内酯(BPL)虽是一种致癌物,但极易水解,在37℃水浴水解2h后消失,其水解为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸。
另外,由于其能在疫苗液体中完全水解,不必考虑在成品疫苗中的残留,接种反应也轻微。
同时,β-丙内酯灭活病原时间短,从而显著地缩短了疫苗生产周期,提高了经济效益。
但与甲醛相比,价格明显昂贵,不适用于发展中国家或经济落后国家。
2免疫佐剂
免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用、能增强机体针对抗原的免疫应答能力、或改变免疫反应类型的物质。
佐剂按有无免疫原性可分为2种:一种本身具有免疫原性,如百日咳杆菌、抗酸杆菌(结核分枝杆菌)以及革兰阴性杆菌等;另一种本身无免疫原性,如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。
目前常用的佐剂主要包括矿物质佐剂、油类佐剂和微生物佐剂等。
2.1铝盐佐剂
铝盐佐剂是传统佐剂中的一类,包括氢氧化铝胶和磷酸铝等。
铝盐佐剂使用方便,成本低廉,安全无毒,是至今唯一被FDA批准用于人用疫苗的佐剂,一直广泛用于人用和兽用疫苗的制备。
铝盐佐剂主要诱导体液免疫应答,抗体以IgG1类为主,刺激产生Th 2型反应,可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平,比较安全,对于胞外繁殖的细菌及寄生虫抗原是良好的疫苗佐剂。
但也存在缺点,皮下注射时常有肿胀或结块等炎症反应,抗原免疫原性弱时,不足以提高其免疫原性,激发细胞免疫应答能力差,不能诱导足够的抗病毒免疫应答,特别是保护性免疫机制要求T 细胞活性介导的免疫参加时,应使用其他佐剂。
铝盐佐剂制作简单,如氢氧化铝佐剂配制时,取5%硫酸铝溶液250mL,在强烈搅拌下加入5%氢氧化钠溶液100mL,用生理盐水离心洗涤沉淀2次,再悬入生理盐水中使总量达250mL。
免疫接种时,取适量氢氧化铝佐剂加等体积抗原即可免疫。
2.2 油类佐剂
主要有弗氏佐剂和可降解的油类佐剂。
弗氏佐剂(freund’s adjuvant,FA)是免疫学上广泛应用的油类佐剂,并应用于很多兽医疫苗研发过程中,根据是否添加分枝杆菌分为弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)2种,不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成,组分比为1～5∶1,可根据需要而定,通常为2∶1;不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/mL)或死的结核分枝杆菌,即为完全弗氏佐剂。
弗氏佐剂的佐剂效能很高,广泛应用于科学研究工作中,但可引起机体发热、注射部位的脓肿、肉芽增生、长时间的组织损伤等剧烈副作用,限制了它们在临床上的应用。
2.3微生物佐剂与其他佐剂
微生物佐剂主要有脂多糖、分枝杆菌等。
分枝杆菌在兽医中广泛地应用于疫苗,如牛分枝杆菌卡介苗是早期应用成功的一种。
蜂胶是一种天然的免疫增强剂和刺激剂,具有增进机体免疫功能和促进组织再生的作用。
据报道,应用蜂胶配合抗原能增强免疫功能以及补体和吞噬细胞活力,增加白细胞的产生和抗体产量,并使特异性凝集素的产生大大增加。
山东滨州兽医研究所开发了系列蜂胶作为佐剂
的禽类疫苗,应用效果良好。
2.4新型佐剂
理想的佐剂应当是以最小的免疫刺激可引起适当的免疫促进作用,且无不良反应。
但目前使用的传统佐剂或多或少存在着一定的缺陷,因此,开发研究安全、高效、无毒副作用的新型佐剂应当是以后佐剂研究的重点。
新型疫苗佐剂的组成形式多样,来源也不同,主要包括油/水乳剂型、颗粒型、微生物衍生物型佐剂等。
油/水乳剂型佐剂以MF59、AS02、Montani-de ISA-51和ISA-720为代表,是一类油包水或水包油型乳化剂。
颗粒型佐剂是将抗原输送系统与疫苗抗原复配或融合后形成颗粒状物质,主要包括病毒颗粒、聚乙交酯微粒、免疫刺激复合体及脂质等。
微生物衍生物型佐剂可分为来自微生物的核酸类和非核酸类佐剂,包括CpG 寡脱氧核苷酸、单磷脂A、不耐热肠毒素(LT)及其突变体等。
当然,新型疫苗佐剂的安全性能和临床使用效果有待以后进一步的研究和评估。
3参考文献
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