脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。
脂肪酶活测定
一．脂肪酶活测定原理：脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。
在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。
水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。
酸碱滴定法 :酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。
脂肪酶活力单位＝(A-B)*nf/t*v式中：A为样品耗碱液ml数，B为对照组耗碱液ml数，n为每毫升碱液微克分子数(n=cM=0.05x23x1000)，f为稀释倍数，t为作用时间(分),v:反应的酶液的体积二．挥发性脂肪酸（VFA）的测定滴定法分析1原理：将废水以磷酸酸化后，从中蒸发出挥发性脂肪酸，再以酚酞为指示剂用NaOH 溶液滴定馏出液。
废水中的氨态氮可能对测定形成干扰，因此应当首先在碱性条件下蒸发出氨态氮。
4．计算挥发性脂肪酸含量计算如下：VFA=V (NaOH)*C*1000/Vs (mmol/L)式中：V(NaOH)-----滴定消耗的NaOH标准溶液的体积，ml;c ------ 滴定消耗的NaOH标准溶液的准确浓度，mol/L;Vs--------被测废水水样的体积，ml.酶活力定义：40℃,ph为5.6的条件下，每分钟酶解淀粉释放出lmg的还原糖(葡萄糖)所需酶量为一个酶活力单位。
1U=1mg还原糖\min.ml酶三．淀粉水解酶活性原理：淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位体积样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
四.纤维素酶酶活力测定：原理：纤维素酶水解纤维素，产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定的范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系，利用比色法测定其还原糖的量就可测定纤维素酶的活力。
脂肪酶测定标准操作程序
脂肪酶测定标准操作程序1. 摘要脂肪酶检测用于定量测定人血清或血浆中脂肪酶的活力，用于临床相关疾病的辅助诊断。
2. 适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中LPS 的浓度。
3. 职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定LPS 浓度的工作人员要严格按照本SOP 程序进行,室负责人监督管理；本SOP 的改动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4. 检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的二脂肪酶监测试剂盒采用的是酶法。
5. 原理1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯−−→−脂肪酶1，2-领-二月桂基-消旋-甘油+戊二酸+6-甲基试卤素灵 1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯在样本中的脂肪酶的作用下水解生成1，2-领-二月桂基-消旋-甘油、戊二酸以及红色的6-甲基试卤素灵。
由于甲基试卤素灵在波长570nm 附近处有吸收峰所以在一定脂肪酶活力范围内，570nm 处吸光度的变化值与样本中脂肪酶活力成正比。
6. 仪器日立7600自动生化分析仪7. 试剂7.1 试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2 试剂瓶内主要成分：R1：Good ’s 缓冲液、共脂肪酶、脱氧胆酸钠、乙酸钙R2：酒石酸缓冲液、1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯、牛脱氧胆酸钠。
7.3 试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。
试剂不可冰冻。
试剂开瓶后冷藏于分析仪中可以保存14天。
7.4 试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：使用某某公司提供的标准品对自动分析仪进行校准。
按照公司标准品使用要求，并以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白，经校准测定，仪器自动对标准品响应量通过合适的数学模型绘制校准曲线。
8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
脂肪酶的测定
脂肪酶的测定脂肪酶是一种能够加速脂肪分解的酶类物质，它在人类的体内起着非常重要的作用。
脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，可以用于研究肥胖、代谢疾病等疾病的发病机制。
脂肪酶的测定方法有很多种，其中最常用的是化学法和免疫法。
化学法是利用化学反应测定脂肪酶的活性，它的原理是将样品与一种特定底物反应，通过测定产生的底物或反应产物的浓度，来计算脂肪酶的活性。
常用的底物有三酰甘油、辅酶A等。
免疫法则是利用特异性抗体与脂肪酶结合反应，进行测定。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单等优点。
在进行脂肪酶测定前，需要收集样品。
常用的样品有血浆、血清、尿液等。
对于血浆和血清样品，需要在采集后立即离心分离血清或血浆，避免冷藏时间过长而影响测定结果。
对于尿液样品，需要在采集后立即保存在冰箱中，避免样品在室温下发生酶解反应。
此外，还需要注意样品的质量和数量，以保证测定结果的准确性。
脂肪酶的测定结果可以反映人体脂肪代谢能力的强弱。
正常情况下，脂肪酶的活性处于一定的范围内。
如果脂肪酶活性过高，说明人体脂肪代谢能力较强，有利于减肥和预防肥胖等疾病；反之，如果脂肪酶活性过低，说明人体脂肪代谢能力较弱，容易出现肥胖和代谢性疾病等问题。
需要注意的是，脂肪酶的测定结果并不是唯一的评估指标，还需要结合其他指标如体重、体脂率、血糖、血脂等指标进行综合分析。
此外，脂肪酶的测定结果也受到许多因素的影响，如年龄、性别、饮食、运动等因素都会对脂肪酶活性产生影响，因此需要综合考虑。
脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，它对于研究肥胖和代谢疾病等疾病的发病机制具有重要的意义。
在进行脂肪酶测定时，需要注意样品的采集、处理和测定方法的选择，以保证测定结果的准确性。
血清脂肪酶的检测原理
血清脂肪酶的检测原理血清脂肪酶是一种重要的生物标志物，可以用于评估人体脂代谢情况和脂肪相关疾病的发展程度。
血清脂肪酶的检测原理是基于酶促反应的测定方法。
本文将从血清脂肪酶的定义、功能、检测原理和临床应用等方面进行阐述。
血清脂肪酶是一种酶类物质，也被称为脂肪酶、脂肪酯酶或胆固醇酯酶。
它主要存在于肠道、胰腺和肝脏等组织中，参与脂肪的消化和吸收过程。
血清脂肪酶可将脂肪酯水解为甘油和游离脂肪酸，从而促进脂肪的代谢。
血清脂肪酶的检测原理是基于酶促反应的测定方法。
具体而言，常用的检测方法是通过测定血清中的甘油水平来间接评估脂肪酶的活性。
测定过程中，首先将血清样品与试剂中的底物反应，脂肪酶催化底物水解生成游离甘油。
然后，使用特定的检测试剂将游离甘油与酶反应生成有色产物，其颜色的强度与甘油的浓度成正比。
最后，通过测定产物的光密度或吸光度，可以计算出血清中甘油的浓度，从而间接评估脂肪酶的活性。
血清脂肪酶的检测原理具有一定的临床应用价值。
首先，它可以用于评估人体脂代谢情况。
脂肪代谢紊乱是导致肥胖、高血脂和代谢综合征等疾病的主要原因之一。
通过检测血清脂肪酶的活性，可以了解脂肪代谢的状况，为脂肪相关疾病的早期诊断和治疗提供依据。
血清脂肪酶的检测原理可应用于脂肪相关疾病的评估。
例如，血清脂肪酶活性的增加常见于非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和胰腺炎等疾病。
这是因为这些疾病的发生与脂肪酶活性的改变密切相关。
通过检测血清脂肪酶的活性，可以评估疾病的严重程度和预后，并为治疗方案的制定提供参考。
血清脂肪酶检测还可用于监测治疗效果。
一些药物如胰岛素增敏剂和脂肪酶抑制剂等可以影响脂肪酶的活性。
通过定期检测血清脂肪酶的活性变化，可以评估治疗效果，并及时调整治疗方案，提高治疗的准确性和有效性。
血清脂肪酶的检测原理是基于酶促反应的测定方法。
通过测定血清中的甘油水平来间接评估脂肪酶的活性，从而了解脂肪代谢情况和脂肪相关疾病的发展程度。
血清脂肪酶的检测原理在临床上具有重要的应用价值，可以用于脂肪代谢的评估、脂肪相关疾病的诊断和治疗效果的监测。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及方法脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH 的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
血清脂肪酶(LPS)—生化检测项目
血清脂肪酶（LPS）
一、检测原理
LPS水解底物1,2-o-二月桂-外消旋-甘油-3-戊酸酯，产生显色的6-甲基试卤灵，生成速率反应LPS活力。
由于在底物中含有共脂肪酶和胆汁酸，抑制其他水解酶和酯酶的影响，使本方法能特定可靠，也不受血清基质效应的影响。
当6-甲基试卤灵酯降解为6-甲基试卤灵时，此红色染料引起的吸光度上升与样品中LPS的活力成正比，在570nm波长处，根据甲基试卤灵的生成速率，从而求得LPS的活性。
二、参考区间
血清：小于60U/L
三、临床意义
1、血脂肪酶仅有胰腺产生，测定血清脂肪酶水平，对胰腺疾病的诊断，特异性较大。
2、升高见于：急慢性胰腺炎、胰液淤滞（胰腺癌、胰腺囊肿、胆管癌、胆石症、乳头癌等），胰腺损伤、穿孔性腹膜炎、胰腺导管阻塞。
血清LPS增高常见于急性胰腺炎及胰腺
癌，偶见于慢性胰腺炎。
急性胰腺炎时，血清淀粉酶增加的时间较短，而血清LPS活性上升可持续10～15天。
腮腺炎未累及胰腺时，LPS通常在正常范围。
3、降低见于：胰腺炎晚期、胰大部切除等。
脂肪酶的作用基本原理和应用领域
其他脂肪酶，胰脂肪酶，如被分泌到细 胞外空间，他们为处理成更简单的形式， 可以更容易吸收和运输整个身体的饮食 血脂。
真菌和细菌分泌的脂肪酶，以促进养分的吸 收，从外部介质（或病原微生物的例子，以 促进一个新的主机入侵）。一定黄蜂和蜜蜂 毒液含有磷脂，加强“生物损伤和炎症刺交 付有效载荷”。
制备化工产品和试剂
利用脂肪酶催化的脂水解反应、酯合成 反应或酯转移反应可以制备许多有重要 价值的化工产品。另外，脂肪酶催化的 酯交换反应还被广泛应用于油脂改良以 生产具有特殊结构与性质的油脂。
造纸工业
用脂肪酶辅以纤维素酶和木质素酶处理 纸浆可以防止树脂在干燥转鼓上的沉积， 保持纸的产量和质量，并减少处理树纸 化学品的用量 。
琼脂块培养法：
将分离培养基用灭菌的打孔器制作成许 多单个的直径约的小琼脂块，排放在干 净的培养皿内，将套选的菌株接种在这 些小琼脂块上培养，让其充分生长。
然后依次再将长满菌的小琼脂块放到酶 活测定板上，28℃培养1-3d，观察各菌 落周围油脂水解圈的大小，水解菌越大， 酶活越强，将水解圈大的菌株纯化后保 存在斜面培养基上。
复筛选方法——摇瓶培养
种子培养基→发酵培养基→收集菌体和上清 液，分别测酶活。
酶活的测定：
在给定的时间内，脂肪酶酶活大小与其催化 水解生成的脂肪酸的量成正比。脂肪酶酶活 的测定方法很所，根据原理不同，其中酸碱 滴定法和分光光度法最为常用，常用的分光 光度法有铜皂显色法和对硝基苯酯法。
测定脂肪酶酶活常用方法的比较
品化生产的脂肪酶并不适合于饲料用。
脂肪酶的类型和生理分布情况
大多数脂肪酶的行动特定位置上的脂至底物 （小肠）甘油骨干。列入，人体胰腺酶。只 是主要的酶，能分解人体消化系统中的膳食 脂肪。转换成单甘酶和两种脂肪酶的摄入由 衷的甘油三脂基板。其他及中国类型那个的 脂肪酶的活性存在于自然中 如磷脂和鞘磷脂， 然而，这些通常是从 传统的脂肪酶 分别对 待。
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脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过和测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1 min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。
公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单位：mmol/l)，y是吸光值，14.474、0.0272是反应系数，R2是相关系数。
则，酶活计算公式为：酶活=1000*n*V*(y-0.0272) / 14.474t 其中n为稀释倍数，t为反应时间（单位：min），V 为反应体系的总体积（单位：L）、1000是mmol到μmol的比例。
二、底物耐碱性测定及试验液配制1.底物耐碱性测定a.6种底物分别加至pH7，pH8的37℃的PBS缓冲液中（选择37℃培养箱），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；b.6种底物分别加至pH8，pH9的Tris-HCl缓冲液中（37℃），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；c.分别加至pH9，pH10的Gly-NaOH缓冲液。
2.测酶活所需要试剂的配制，酶活测定方法方法一：（96孔板法，粗略，速度快）a.溶液的配制溶液A：溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物，337.52g/mol，即8.89*10-5mol)溶于10.00ml异丙醇（浓度为8.89*10-3M，或8.89mM），4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶500次测定；溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。
96孔板（220μL）：A液（底物液）：18μL↗体系液180（μL）+ 酶液（40μL）↘B液（pH缓冲液）：162μL此步骤中，底物再次被稀释，浓度为0.889mM。
方法二：（吸光度法，精准，速度慢）a.溶液的配制溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物)溶于10.00ml异丙醇，4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶8-10次测定，或用于8-10个酶一次测定，或用于一个酶4次密精测定；溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。
b.脂肪酶的活力测定（以单个酶液做一个/ 两个对照为例）①准备试管30个，10个15ml离心管；②取1ml / 1.2ml溶液A加入到9ml / 10.8ml溶液B于离心管中，充分混匀，37℃水浴保温5min，分装至3 / 4个试管中，每个2.7ml，即体系液；③向每个试管中加入适量酶液（粗酶液加300μL），对照组中加入灭活酶液(沸水煮沸5min)，加入酶液后即为反应液；④37℃反应10-15min，加入95%乙醇终止反应，在410nm下测定吸光值，每个样品重复2 / 3次，取平均值。
三、96孔板装样方式：步骤一：温度不变，定为40℃，以pH和底物为变量，先在EP管内反应，后加入至96孔板中。
其中每个孔是220μL体系。
pH缓冲液分别采取PBS缓冲液（7、8）、Tris-HCl缓冲液（8、9）。
a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*80=3.2ml，其中需要灭活的是800μL。
以方便计算以及加样，取4ml酶液，1ml用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*16=288μL，以方便计算和加样，取300μL。
c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液4ml，每个底物900μL。
表为96孔加样模式：C2等代表底物，后面的数字代表pH，红色字体表示一个空白对照和三个平行。
蓝色字体中，pH8分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液，以便比较不同缓冲液对酶活的影响。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A C2 7空白C2 7平行C4 7空白C4 7 C8 7空白C8 7 C127空C127C167空C167B C2 7平行C2 7平行C4 7 C4 7 C8 7 C8 7 C127C127C167C167C C2 8空白C2 8 C4空白C4 8 C8空白C8 8 C12空白C128C16空白C168D C2 8 C2 8 C4 8 C4 8 C8 8 C8 8 C128 C128C168C168E C28Tri空白C28TriC48Tri空白C48TriC88Tri空白C88TriC128Tri空白C128TriC168Tri空白C168TriF C28TriC28TriC48TriC48TriC88TriC88TriC128TriC128TriC168TriC168TriG C29Tri空白C29TriC49Tri空白C49TriC89Tri空白C89TriC129Tri空白C129TriC169Tri空白C169TriH C2 C2 C4 C4 C8 C8 C12 C12 C16 C16孔是220μL体系。
a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*60=2.4ml，其中需要灭活的是600μL。
以方便计算以及加样，取3ml酶液，750ml用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*12=216μL，以方便计算和加样，取250μL。
c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液3ml，每个底物750μL。
表为96孔加样模式其中C2等代表底物，后面的数字代表温度，红色字体表示一个空白对照和三个平行。
40℃因已经在上个步骤中做过，不再重复。
9Tri 9Tri 9Tri 9Tri 9Tri 9Tri 9Tri 9Tri 9Tri 9Tri1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A C230空白C230平行C430空白C430C830空白C830C1230空白C1230C1630空白C1630B C230平行C230平行C430C430C830C830C1230C1230C1630C1630C C250空白C250C450空白C450C850空白C850C1250空白C1250C1650空白C1650D C250C250C450C450C850C850C1250C1250C1650C1650E C260空白C260C460空白C460C860空白C860C1260空白C1260C1660空白C1660F C260C260C460C460C860C860C1260C1260C1660C1660G H。