高效液相色谱中理论塔板数的计算方法
仪器分析总结习题 (1)
第一章 气象色谱法1. 死时间tM2. 保留时间tR3. 调整保留时间t ’R4. 死体积VM5. 保留体积VR6. 调整保留体积7.相对保留值γ218.标准偏差σ9.半峰宽度Y1/2 10.峰底宽度Y1、若一个溶质的分配比为，计算它在色谱柱流动相中的质量分数（%）2、在一根色谱柱上分离苯和甲苯，保留时间分别为和，死时间为1min ，问：甲苯停留在固定相中的时间是苯的几倍？甲苯的分配系数是苯的几倍？ (3,3)3、某色谱条件下，组分A 的分配比为4，死时间为30s ，求组分A 的保留时间（150s ）4、下列哪些参数改变会引起相对保留值变化？A 、柱长B 、相比C 、柱温D 、流动相流速5、在气液色谱中，下列变化对溶质的保留体积几乎没有影响的是A 、改变载气流速B 、改变固定液化学性质C 、增加柱温D 、增加柱长E 、增加固定液的量例1 已知某组分峰Y ＝40s ，tR=400s 。
计算理论塔板数n 。
例2 已知一根1米长的色谱柱，neff ＝1600块，组份A 在柱上的调整保留时间为100s ，试求A 峰的半峰宽和Heff 。
例3 在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R= 。
计算需要多少块有效塔板。
若填充柱的塔板高度为 cm ，柱长是多少？ 解： γ2,1= 100 / 85 =n 有效 = 16R2 [γ 2,1 / (γ 2,1 -1) ]2= 16× × / ) 2= 1547（块）L 有效 = n 有效·H 有效 = 1547× = 155 cm1600)40400(16)(1622===Y t n R 理'21/25.54() R t L n H Y n ==有效有效有效即柱长为米时，两组分可以得到完全分离。
例2 有一根1m长的柱子，分离组分1和2得到如图的色谱图。
图中横坐标l为记录笔走纸距离。
液相色谱实验柱效测定
高效液相色谱测定色谱柱的柱效
实验目的：了解高效液相色谱仪的构造及操作
掌握液相色谱柱校和分离度的测定方法
实验原理：柱效常以理论塔板数n或理论塔板高度H表示用来说明柱子性能好坏，理论塔板数越高，柱效越好，分离出的组份峰又尖又高。
色谱柱的理论塔板数按计算公式：n= 16/(t R/ Y )2=5.54 [t R/( Y h/2)]2
实验原理：1.溶液的配制
配制20ppm萘和50ppm苯的混合液
2.实验条件的选择
(1) 反相色谱柱
(2) 流动相甲醇：水（90：10），流量1.0mL·min-1
(3) 监测器紫外光度监测器，254nm
(4) 进样量20uL
(5) 柱温30℃
3．测定
(1) 将配制好的流动相甲醇水溶液脱气15min。
(2) 根据实验条件，将高效液相色谱仪按照操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电
路系统达到平衡时，记录仪基线呈平直，即可进样。
数据处理：根据色谱图计算分离度和理论塔板数。
问题讨论。
色谱分析法习题及答案
色谱分析法习题及答案1.在液相色谱法中，液固色谱法属于吸附色谱法。
2.在高效液相色谱流程中，试样混合物在色谱柱中被分离。
3.液相色谱流动相过滤必须使用0.45μm的过滤膜。
4.在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行改变流动相的种类或柱子、改变固定相的种类或柱长、改变固定相的种类和流动相的种类、改变填料的粒度和柱长的操作。
5.一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为正庚烷/异丙醇（93/7）。
6.蒸发光散射检测器不能使用梯度洗脱。
7.在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在10～30cm的范围内。
8.在液相色谱中，某组分的保留值大小实际反映了组分与固定相的分子间作用力。
9.在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行改变流动相或固定相种类的操作。
10.紫外吸收检测器是液相色谱中通用型检测器。
11.在环保分析中，常常要监测水中多环芳烃，如用高效液相色谱分析，应选用荧光检测器。
12.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是减小填料粒度。
13.在液相色谱中，改变流动相流速不会显著影响分离效果。
14.红外检测器不是高液相色谱仪中的检测器。
15.高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了液相系统和样品前处理的步骤。
16.在高效液相色谱仪中，保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件是输液泵。
17.高效液相色谱、原子吸收分析用标准溶液的配制一般使用国标规定的一级、二级去离子水。
18.高效液相色谱仪与普通紫外-可见分光光度计完全不同的部件是流通池。
19.高效液相色谱仪的通用检测器是紫外检测器。
20.高效液相色谱仪中高压输液系统不包括梯度洗脱装置。
21.在气相色谱分析中，用于定性分析的参数是保留值。
22.在气相色谱分析中，用于定量分析的参数是峰面积。
23.良好的气-液色谱固定液为蒸气压低、稳定性好、溶解度大，对相邻两组分有一定的分离能力。
24.使用热导池检测器时，应选用氢气作载气，其效果最好。
25.下列说法中，不正确的是气相色谱法常用的载气是氧气。
高效液相色谱原理和操作详解
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 (2)一、液相色谱理论发展简况 (2)二、HPLC的特点和优点 (2)三、色谱法分类 (3)四、色谱分离原理 (3)II．基本概念和理论 (5)一、基本概念和术语 (5)二、塔板理论 (8)三、速率理论（又称随机模型理论） (9)III．HPLC系统 (10)一、输液泵 (11)二、进样器 (13)三、色谱柱 (14)四、检测器 (17)五、数据处理和计算机控制系统 (20)六、恒温装置 (20)IV．固定相和流动相 (20)一、基质（担体） (20)二、化学键合固定相 (22)三、流动相 (23)1．流动相的性质要求 (23)2．流动相的选择 (24)3．流动相的pH值 (24)4．流动相的脱气 (25)5．流动相的滤过 (25)6．流动相的贮存 (26)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (26)8．HPLC用水 (26)V．HPLC应用 (27)一、样品测定 (27)二、方法研究 (27)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (28)一、对起草单位的要求： (28)二、对复核单位的要求： (28)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
液相色谱分析方法建立-系列一基本理论及色谱介绍
硅 胶 的 溶 解 曲 线
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
硅胶表面键合相的水解（PH<2）
O
OH
Si
O
+
O
“Column Bleed”
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
Cl
CH3
O
+ H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH
O 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在 中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。
O 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 O 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。
50
色谱柱的pH值
O 填料的pH稳定性 O 硅胶填料 pH：2-8 O 聚合物填料 pH：2-12 O 杂化硅胶填料 pH：2-12
O
Low pH (hydrolysis of ligand)
O Si
O
O
OH
+
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
HO
CH3
硅胶的溶解（PH>8）
Nucleophilic attack
• Complete dissolution of Silica
• Catastrophic column failure
蒸发光散射
任何挥发性低于流动相的样 品均能被 检测
可检测所有物质。
hplc方法转换uplc计算公式
hplc方法转换uplc计算公式HPLC方法转换为UPLC计算公式引言：液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UPLC）是常用的分离和定量分析技术。
HPLC是基于传统液相色谱技术发展起来的，而UPLC 则是在HPLC的基础上进行了改进和优化。
本文将介绍如何将HPLC方法转换为UPLC方法，并给出相应的计算公式。
一、HPLC方法的转换HPLC方法转换为UPLC方法的关键在于优化色谱柱和流动相的选择。
由于UPLC使用的是亚微米级别的色谱柱颗粒，因此需要使用较高的操作压力。
同时，UPLC的流动相也需要进行优化，以保证在更高的操作压力下仍能保持良好的分离性能。
1. 优化色谱柱选择HPLC方法中常用的色谱柱粒径为3-5 μm，而UPLC使用的色谱柱粒径通常为1.7 μm。
色谱柱的粒径越小，表面积越大，分离效果越好。
因此，在将HPLC方法转换为UPLC方法时，需要选择亚微米级别的色谱柱。
2. 优化流动相选择UPLC方法中的流动相需要具有较低的粘度和较高的溶解度，以适应高操作压力下的分离。
常见的流动相包括甲醇、乙腈和水等有机溶剂，它们也可以与酸、碱和缓冲剂等添加剂混合使用，以达到更好的分离效果。
二、UPLC计算公式在将HPLC方法转换为UPLC方法时，需要进行相应的计算以确保分析结果的准确性。
以下是常用的UPLC计算公式：1. 流动相线速度（v）的计算公式：v = F/A其中，v为流动相线速度（cm/min），F为流速（ml/min），A为色谱柱截面积（cm^2）。
2. 色谱柱高度当量（HETP）的计算公式：HETP = L/N其中，HETP为色谱柱高度当量（cm），L为色谱柱长度（cm），N 为理论塔板数。
3. 保留时间（tR）的计算公式：tR = V/F其中，tR为保留时间（min），V为体积（ml），F为流速（ml/min）。
4. 分离度（α）的计算公式：α = tR2 - tR1 / (W1 + W2)其中，α为分离度，tR2和tR1分别为两个组分的保留时间，W1和W2分别为两个组分的峰宽。
实用高效液相色谱法的建立
液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、 基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R −=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R −−==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
塔板理论、速率方程
吸收了塔板理论的概念
结合了影响塔板高度的动力学因素
解释了影响塔板高度的各因素
内容：填充柱的柱效受分子扩散、传质阻力、 载气流速等因素的控制
H 2d p 2Dg u
2 2 0.01k 2 d p d 2 k f u 2 1 k 2 d g 3 (1 k ) DL
塔板理论有利于我们形象地理解色谱的分离过程；
导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现 象相吻合；
导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标；
塔板理论的局限：
定性地给出了塔板高度的概念，却无法解释板高的影
响因素；
不能解释流速对理论塔板数的影响； 四个假设与实际不相符合；
三、速率方程
论塔板数作为衡量柱效率
的指标。
二、塔板理论
Martin and Synge receiving the 1952 Nobel Prize in chemistry
二、塔板理论
塔板理论的假设：
（1）组分在两相间的分配可以瞬时完成。这样达到分
配平衡的一小段柱长称为理论塔板高度H；
（2）载气进入色谱柱不是连续的，而是脉动（间歇） 过程，每次进气为一个板体积； （3）试样开始时都加在0号塔板上，而且试样在相邻 两塔板间没有纵向扩散；
一、色谱分离基本参数
滞留因子
流动相在柱内的线速度为u cm· s-1，由于固定相对组分 的保留作用，组分在柱内的线速度us将小于u，两速度之比 称为滞留因子Rs
Rs us / u
Rs也可用质量分数ω表示
mM 1 1 Rs m mS mM 1 S 1 k mM
理论塔板数
理论塔板数1、定义理论塔板数（theoretical plate number）N，色谱的柱效参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)2柱效率用理论塔板数定量地表示：N=16*（t/w ）2。
其中，t是溶质从进样到最大洗脱峰出现的时间，w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。
在一色谱柱中用相同的洗脱条件时候，不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。
因此理论塔板数大的色谱柱效率高。
当然，N的大小和柱子长度有密切关系：理论塔板高度H=柱长/N，用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H越小，则色谱柱效率越高。
N为常量时，W随tR成正比例变化。
在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。
用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。
（一般HPLC柱的N在1000以上。
）若用调整保留时间（tR′）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16(tR′/W)2我们知道实际操作过程中，峰会出现拖尾的情况，所以，实用半峰宽比使用峰宽要准确一些，当然这也不是绝对的。
理论塔板高度和理论塔板数都是柱效指标，，由于峰宽或半峰宽是组分分子在色谱柱内离散的度量，总的离散程度是单位柱长内分子离散的累计，其与柱长成正比。
理论塔板数首先应该是和柱子的性能是有关系的，像填料，柱长什么的，和你的流动相，流速，样品分子量大小都是有关系的。
每个峰的理论塔板数肯定是不同的，理论塔板数越高峰形越好。
2、理论塔板数下降后可以考虑色谱柱再生（1）、反相柱分别用甲醇：水=90：10，纯甲醇（HPLC级），异丙醇（HPLC级），二氯甲烷（HPLC级）等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积，然后再以相反的次序冲洗。
高压液相色谱(HPLC)基本概念和理论
高压液相色谱(HPLC)基本概念和理论/?k1035835一、基本概念和术语1.色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
噪音(noise)--基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。
前者少见。
拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
峰底-基线上峰的起点至终点的距离。
峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。
峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W＝4σ半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。
Wh/2＝2.355σ标准偏差（standard deviation，σ)-正态分布曲线x ＝±1时（拐点）的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
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高效液相色谱中理论塔板数的计算方法
高效液相色谱中理论塔板数的计算方法
理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为:
N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2 W:峰宽 ; σ:曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。
N为常量时，W随tR成正比例变化。
在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。
用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。
(一般HPLC柱的N在1000以上。
) 若用调整保留时间(tR’)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)=16(tR’/W)2
理论塔板高度(theortical plate height,H)每单位柱长的方差。
H=。
实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算:H=L/N
在实际应用中能达到分离完全就可以了，塔板数超过会增加试验的时间，试验效率就会降低。
定义编辑
理论塔板数(theoretical plate number)N，色谱的柱效参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布
等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为:
理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)2 (2是平方)
柱效率用理论塔板数定量地表示:N=16*(t/w )2。
其中，t是溶质从进样到最大洗脱峰出现的时间，w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。
在一色谱柱中用相同的洗脱条件时候，不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。
因此理论塔板数大的色谱柱效率高。
当然，N的大小和柱子长度有密切关系:理论塔板高度H=柱长/N，用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H越小，则色谱柱效率越高。
N为常量时，W随tR成正比例变化。
在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。
用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。
(一般HPLC柱的N在1000以上。
)
若用调整保留时间(tR’)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)=16(tR’/W)2
处理方法编辑
理论塔板数下降后可以考虑色谱柱再生
反相柱
分别用甲醇:水=90:10,纯甲醇(HPLC级),异丙醇(HPLC级),二氯甲烷(HPLC级)等溶剂作为流动相,依次冲洗,每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积.然后再以相反的次序冲洗.
正相柱
分别用正己烷(HPLC级),异丙醇(HPLC级),二氯甲烷(HPLC级),甲醇(HPLC级)等溶剂做流动相,顺次冲洗,每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大,可降低流速,避免压力过高).注意使用溶剂的次序不要颠倒,用甲醇冲洗完后,再以相反的次序冲洗至正己烷.所有的流动相必须严格脱水.
离子交换柱
长时间在缓冲溶液中使用和进样,将导致色谱柱离子交换能力下降,.用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生,反之,用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生.
另外,还可以选择能溶解柱内污染物的溶剂为流动相做正方向和反方向冲洗.但再生后的色谱柱柱效是不可能恢复到新柱的水平的.
如果柱子装反了,可以调回来,但可能会造成柱内担体塌陷.在不得已的情况下尽量不要反装色谱柱。