第五章亲和层析
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亲和层析
亲和层析（一）原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。
所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。
此法具有高效、快速、简便等优点。
（二）载体的基本要求和选择理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。
可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。
在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。
纤维素的非特异性吸附强。
聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。
琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。
琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。
琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。
因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
（三）试剂与配制1．Sepharose 4B2．CNBr（剧毒）3．抗原或抗体4．1Mol/L NaHCO3取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。
5．0.1Mol/L NaHCO36．2Mol/L NaOH7．0.01Mol/L pH7.4 PBS0.2Mol/L Na2HPO438.0ml0.2Mol/L Na2HPO4162.0mlNaCl 32.76g加水至4 000ml。
AC_XP
第七节 应 用
1. 2. 3. 4. 5. 6.
抗原、抗体的纯化 受体蛋白的纯化 糖蛋白的纯化 同工酶的纯化 亲和标记肽的纯化 核酸的纯化
|-O – CH2 – CH – CH2 – NH – Pro. | OH
二．手 臂 的连 接
接臂的方法： 1.手臂先接配体后偶联 2.手臂先偶联后接配体 NH2(CH2)nNH2 n=2 - 12 手臂的类型： 接手臂：
三． 蛋白质偶联的特殊问题
在较低 pH 偶联可减少蛋白质与活化琼脂糖的多 点结合。
5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
Scanning electron micrograph of an agarose gel
Magnification x 50,000
Ref: Anders S. Medin, PhD Thesis, Uppsala University 1995
Chroatography media
1.
E = 乳糖合成酶A蛋白 B = α- 乳清蛋白 E + A EA + B A = N – 乙酰 – D – 氨基葡萄糖
EAB
负洗脱
两元专一性三元专一性的源自亲和层析洗脱设计正洗脱 A = NAD+ B = AMP C = Py E = LDH
五、化学裂解
连二亚硫酸硫酸钠还原、高氯酸、盐酸胍 三氯醋酸、尿素
核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶
、
结合蛋白 激素及维生素：受体、载体蛋白 细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素
三、配体的浓度
一般使用较高的固定化配体浓度
当配体亲和力高，且本身带电则固定化 配体浓度须降低
亲和层析技术
一、亲和层析的原理
• （ 1 ）配基固定化：配基 与载体偶联，结合成具有 特异亲和性的分离介质。 • （ 2 ）吸附样品：亲和层 析介质选择性吸附生物活 性物质. （ 3 ）样品解吸：选择适宜 的条件使被吸附物活性物 质解吸。
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二、亲和层析载体
（一）、亲和层析对载体的要求：
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通用配基（general ligand）
• 用于一类物质的分离提纯。 • 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配 基； • 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； • 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时 的通用配基等。
特殊配基（specific ligand）
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四、 载体的活化与偶联
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• 3、葡聚糖凝胶： • 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小， 应用受到限制。 • 4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P • 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较 高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 • pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
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复合亲和力
• 离子效应作用，又有疏水作用。
• 配体与配基有较强生物特异性。 • 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高 选择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
• 洗脱 • 洗脱方法主要有三种： • 非专一性洗脱 • 特殊洗脱 • 专一性洗脱
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• （四）、载体孔径的影响 • 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 • 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 • • • • （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
第五章 亲和层析分离技术
遮盖，反而使亲和柱吸附力降低。
• 配体浓度太高又会使吸附力太强，造成洗脱困难； • 随着配体浓度的增加，非专一性吸附也增加，而专 一性吸附却降低。 • 理想的配基浓度为1-10µ mol/L；2µ mol/L的凝胶为
最好。
（三）配体偶联的位置
• 在一般情况下，亲和结 合时配体分子与待分离 物质仅有一部分发生相 互作用。 • 为了保证亲和吸附剂有 足够大的亲和能力，我 们希望配体固定化时， 其不参与亲和结合的部 位与载体进行偶联。
抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应
条件。 • 缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性 吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。 • 为了克服上述缺点，作载体用的市售Bio-Glass的商品都已 事先连接了氨烷基(烷基胺)。 • 用葡聚糖包被玻璃珠则可改善其亲水性，并增加化学活性基 团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在 DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。
二、间隔臂分子（手臂）
• 空间位阻效应 ：待分离生物大分子由于受到基质的空间
障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体。
• 解决的办法是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔 壁”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的
骨架向外扩展伸长。
O gel O OH C
NH + NH2(CH2)nNH2
配体Ligand: 亲和层析中能被某一生物大分
子识别和可逆结合的生物专一性物质。即
被固定在基质上的分子称为配体。
基质Matrix(载体): 亲和层析中与配体共价
结合,使其固相化的物质。
亲和吸附剂：配体和基质是共价结合的，
构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
亲和层析_精品文档
利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15为15个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，故有
利于酸性蛋白的偶联。
36
5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；
（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分
子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
40
（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基
团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂
（2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。
（3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。
55
反竞争性效应
56
亲和层析中配基的选择和洗脱条件
57
（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由
联。
33
34
3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
35
4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有
择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
利于酸性蛋白的偶联。
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5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；
（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分
子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
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（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基
团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂
（2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。
（3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。
55
反竞争性效应
56
亲和层析中配基的选择和洗脱条件
57
（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由
联。
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3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有
择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
亲和层析
2、凝集素和糖蛋白亲和层析；
3、含有辅酶的酶类的亲和层析； 4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析；
5、肝素为配体的亲和层析；
6、染料配体亲和层析； 7、金属螯合层析；
例如：凝集素和糖蛋白的亲和层析—凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合
蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原 待纯化的蛋白质 特定单克隆抗体或多克 隆抗体 配体 肝素 待纯化的蛋白质 凝聚因子、脂酶、结缔组 织蛋白酶、DNA聚合酶
单克隆抗体 蛋白质A、 蛋白质G
蛋白酶抑制 剂 磷酸
特定抗原 免疫球蛋白
蛋白酶 磷酸酶
胆固醇 脂肪酸
核苷酸 苯基硼酸盐
胆固醇受体、胆固醇结合 蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋白
五、亲和层析
（一）亲和层析的概念：
1、亲和力：根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和
可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
2、亲和层析法：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
（二）亲和层析法的原理：
在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后 再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其 有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上
方法 特异性配体亲 和层析法
通用性配体亲 和层析法
配体
性能
复杂的生命大分子物 具有较强的吸附选择性和 质（如抗体、受体和 较大的结合力 酶的类似底物等） 简单的小分子物质 成本低廉，具有较高的吸附 （如金属、染料、以 容量，通过改善吸附和脱附 及氨基酸等） 条件可提高层析的分辨率
3、含有辅酶的酶类的亲和层析； 4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析；
5、肝素为配体的亲和层析；
6、染料配体亲和层析； 7、金属螯合层析；
例如：凝集素和糖蛋白的亲和层析—凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合
蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原 待纯化的蛋白质 特定单克隆抗体或多克 隆抗体 配体 肝素 待纯化的蛋白质 凝聚因子、脂酶、结缔组 织蛋白酶、DNA聚合酶
单克隆抗体 蛋白质A、 蛋白质G
蛋白酶抑制 剂 磷酸
特定抗原 免疫球蛋白
蛋白酶 磷酸酶
胆固醇 脂肪酸
核苷酸 苯基硼酸盐
胆固醇受体、胆固醇结合 蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋白
五、亲和层析
（一）亲和层析的概念：
1、亲和力：根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和
可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
2、亲和层析法：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
（二）亲和层析法的原理：
在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后 再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其 有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上
方法 特异性配体亲 和层析法
通用性配体亲 和层析法
配体
性能
复杂的生命大分子物 具有较强的吸附选择性和 质（如抗体、受体和 较大的结合力 酶的类似底物等） 简单的小分子物质 成本低廉，具有较高的吸附 （如金属、染料、以 容量，通过改善吸附和脱附 及氨基酸等） 条件可提高层析的分辨率
亲和层析
（按性能优劣排序）
琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝 胶、纤维素。 最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B
3. 配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，
辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。
2）具有与基质共价结合的基团。
常 用 手 臂
5. 操作：
1） 层析前：制备亲和层析剂
选择 根据欲分离物质特性 根据配基分子大小及基团特性 配基 选择 载体 偶联 亲和层析剂
2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。
包括：非专一性洗脱和专一性洗脱
非专一性洗脱：
改变温度
改变pH值
改变离子强度
专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制
溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。
如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基
2）引入连接臂（space arm）
又称手臂（spacer ）
“接臂” 的目的：
克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。
“接臂”的途径：
常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如： AH-Sepharose 4B
+
配基
蛋白质
固 体 载 体
C
C
C
1.配基固相化
2.亲和吸附
3.解吸附
Affinity chromat质应满足以下要求： ① 高度的亲水性。 ② 极低的非特异性吸附性（惰性）。 ③ 具有足够的化学基团。 ④ 适当的多孔性。 ⑤ 较好的理化稳定性。
可被应用的基质（载体）：
（五）亲和层析(Affinity Chromatography)
琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝 胶、纤维素。 最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B
3. 配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，
辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。
2）具有与基质共价结合的基团。
常 用 手 臂
5. 操作：
1） 层析前：制备亲和层析剂
选择 根据欲分离物质特性 根据配基分子大小及基团特性 配基 选择 载体 偶联 亲和层析剂
2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。
包括：非专一性洗脱和专一性洗脱
非专一性洗脱：
改变温度
改变pH值
改变离子强度
专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制
溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。
如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基
2）引入连接臂（space arm）
又称手臂（spacer ）
“接臂” 的目的：
克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。
“接臂”的途径：
常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如： AH-Sepharose 4B
+
配基
蛋白质
固 体 载 体
C
C
C
1.配基固相化
2.亲和吸附
3.解吸附
Affinity chromat质应满足以下要求： ① 高度的亲水性。 ② 极低的非特异性吸附性（惰性）。 ③ 具有足够的化学基团。 ④ 适当的多孔性。 ⑤ 较好的理化稳定性。
可被应用的基质（载体）：
（五）亲和层析(Affinity Chromatography)
第五章亲和层析分离技术详解
多糖基质
环氧化物法
当前21页，总共43页。
多糖基质
苯醌法
当前22页，总共43页。
多糖基质 其他方法——甲苯磺酰氯
当前23页，总共43页。
聚丙烯酰胺基质
戊二醛法
当前24页，总共43页。
聚丙烯酰胺基质
肼法
当前25页，总共43页。
多孔玻璃与硅胶
当前26页，总共43页。
亲和配基固定偶联的密度的测定
➢ Con A 亲和层析 糖蛋白：免疫球蛋白，IgM 低密度酯蛋白
➢ 肝素亲和层析
当前40页，总共43页。
5.4.6 共价色谱
原理 （a）吸附过程；（b）洗脱过程；（c）再生过程
当前41页，总共43页。
共价介质的合成
引入硫醇基
引入双硫键
当前42页，总共43页。
共价色谱的吸附和解吸
1、上样预处理 2、吸附
当前6页，总共43页。
亲和层析分离技术
➢ 亲和层析的理论 ➢ 亲和介质的制备 ➢ 常见的亲和层析
当前7页，总共43页。
5.2 亲和层析的理论
当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡
E K d E 1 L M K lm E LM
Kd
E1 E
Klm EE1LLM M
当前8页，总共43页。
N N
N Cl
NH OH R
OH3S
SO3H
HO3S
SO3H
其中R为:
SO3H NN
当前36页，总共43页。
染料亲和层析
染料配基和蛋白质作用大小排列
第一组
第二组
第三组
第四组
第五组
Procion Blue MX-7RX
Cibacron Blue 2-RA
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第五章 亲和层析分离技术
Affinity Chromatography
第五章亲和层析
第一节 亲和层析概述
亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而 进行分离的一种层析技术
第五章亲和层析
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及 半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质 可以通过金属离子亲和层析得到分离。
第五章亲和层析
第五章亲和层析
拟生物亲和层析
• 定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子 结构或某特定部位。以人工合成的配体ion )
第五章亲和层析
一、亲和层析基本原理
基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定 在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分第子五章进亲和行层析分离纯化。
混合蛋白样品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白 第五章亲和层析
收集目的蛋白
第五章亲和层析
三、亲和层析的类型
• 生物亲和层析 • 免疫亲和层析 • 固定化金属离子亲和层析 • 拟生物亲和层析
第五章亲和层析
生物亲和层析
• 利用自然界中存在的生物特异性相互作用 物质对的亲和层析。
• 通常具有高的选择性。 • 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素
-受体等。
第五章亲和层析
免疫亲和层析
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合 基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金 属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合，选 择性的吸附蛋白质 。
目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪 唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋 白质与固定化金属离子结合，这是IMAC用于蛋白质分离 纯化的根据。
第五章亲和层析
固相化 (Immobilise)
配 体 Ligand: 亲 和 层 析 中 能 被 某 一 生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。即被固定在基质上的分子称为配体。
基质Matrix(载体):亲和层析中与配体 共价结合,使其固相化的物质。
第五章亲和层析
吸附 (Adsorption)
• 由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以 这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物 质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需 要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离 物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。
• 亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学 性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具 有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高， 是分离生物大分子的一种理想的层析方法。
第五章亲和层析
二、亲和层析的特点
• 分辨率很高 • 分离速度快 • 操作简便 • 对设备要求不高 • 亲和吸附剂通用性较差 • 洗脱条件较苛刻
第五章亲和层析
与其他层析技术比较
• 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是 利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸 附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分 离。
• 20世纪60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋 白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使 得亲和层析技术得到了快速的发展。
• 生物大分子的分离
第五章亲和层析
优点： 1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和
缺点： 1.亲和吸附剂通用性较差。针对某一分 离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的 实验条件 2.配体的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤
• 例如染料亲和层析（DAFC）和氨基酸亲和层析 (AALA)。染料配体，例如三嗪或三苯甲烷化合物， 能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。
• 染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用， 以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂 的形式进行。
第五章亲和层析
四、亲和层析载体
载体在亲和层析中的作用：使配体固定化、 提供结合的空间环境
分离过程
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生
物分子就与配体发生特异性的结合（静电引力、范 德华力以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上） ， 从而留在固定相上 • 而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并 随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生 物分子。 • 通过适当的洗脱液（改变起始液缓冲液的pH或增加离 子强度或加入抑制剂等因子）将其从配体上洗脱下来， 就得到了纯化的待分离物质
• 免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体 之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。
• 例如1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从 血清中分离其对应的抗体。
• 例如2：在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓 度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难 于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方 法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备 抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂， 就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。
第五章亲和层析
第二节 亲和层析基本原理及理论基础 • 原理：将具有亲和力的两个分子中一个固
定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的 特异性和可逆性，对另一个分子进行分离 纯化。
第五章亲和层析
亲和力
• 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯 合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography)”的概念，首次 成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二 乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如 Cu++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合， 不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从 而将蛋白质分离。
Affinity Chromatography
第五章亲和层析
第一节 亲和层析概述
亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而 进行分离的一种层析技术
第五章亲和层析
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及 半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质 可以通过金属离子亲和层析得到分离。
第五章亲和层析
第五章亲和层析
拟生物亲和层析
• 定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子 结构或某特定部位。以人工合成的配体ion )
第五章亲和层析
一、亲和层析基本原理
基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定 在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分第子五章进亲和行层析分离纯化。
混合蛋白样品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白 第五章亲和层析
收集目的蛋白
第五章亲和层析
三、亲和层析的类型
• 生物亲和层析 • 免疫亲和层析 • 固定化金属离子亲和层析 • 拟生物亲和层析
第五章亲和层析
生物亲和层析
• 利用自然界中存在的生物特异性相互作用 物质对的亲和层析。
• 通常具有高的选择性。 • 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素
-受体等。
第五章亲和层析
免疫亲和层析
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合 基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金 属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合，选 择性的吸附蛋白质 。
目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪 唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋 白质与固定化金属离子结合，这是IMAC用于蛋白质分离 纯化的根据。
第五章亲和层析
固相化 (Immobilise)
配 体 Ligand: 亲 和 层 析 中 能 被 某 一 生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。即被固定在基质上的分子称为配体。
基质Matrix(载体):亲和层析中与配体 共价结合,使其固相化的物质。
第五章亲和层析
吸附 (Adsorption)
• 由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以 这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物 质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需 要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离 物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。
• 亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学 性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具 有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高， 是分离生物大分子的一种理想的层析方法。
第五章亲和层析
二、亲和层析的特点
• 分辨率很高 • 分离速度快 • 操作简便 • 对设备要求不高 • 亲和吸附剂通用性较差 • 洗脱条件较苛刻
第五章亲和层析
与其他层析技术比较
• 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是 利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸 附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分 离。
• 20世纪60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋 白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使 得亲和层析技术得到了快速的发展。
• 生物大分子的分离
第五章亲和层析
优点： 1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和
缺点： 1.亲和吸附剂通用性较差。针对某一分 离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的 实验条件 2.配体的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤
• 例如染料亲和层析（DAFC）和氨基酸亲和层析 (AALA)。染料配体，例如三嗪或三苯甲烷化合物， 能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。
• 染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用， 以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂 的形式进行。
第五章亲和层析
四、亲和层析载体
载体在亲和层析中的作用：使配体固定化、 提供结合的空间环境
分离过程
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生
物分子就与配体发生特异性的结合（静电引力、范 德华力以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上） ， 从而留在固定相上 • 而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并 随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生 物分子。 • 通过适当的洗脱液（改变起始液缓冲液的pH或增加离 子强度或加入抑制剂等因子）将其从配体上洗脱下来， 就得到了纯化的待分离物质
• 免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体 之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。
• 例如1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从 血清中分离其对应的抗体。
• 例如2：在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓 度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难 于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方 法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备 抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂， 就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。
第五章亲和层析
第二节 亲和层析基本原理及理论基础 • 原理：将具有亲和力的两个分子中一个固
定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的 特异性和可逆性，对另一个分子进行分离 纯化。
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亲和力
• 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯 合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography)”的概念，首次 成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二 乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如 Cu++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合， 不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从 而将蛋白质分离。