淀粉酶的制备及活力测定共26页
项目二-淀粉酶的制备及活力测定
五、实验结果
编号 吸光值 计算用的吸光值
I-1 0.022 0
I-2 0.047 0.025
I-3 0.115 0.093
(三）α-淀粉酶活力测定： ① 取试管3支 ② 于每管中各加入酶液1mL，在70℃±0.5℃恒温 水浴中准确加热15min，钝化β-淀粉酶。取出 后迅速用流水冷却。 ③ 在对照管中加入4mL0.4mol/L氢氧化钠。 ④ 在4支试管中各加入1mLpH5.6柠檬酸缓冲液。 ⑤ 将4支试管置于恒温水浴中，40℃±0.5℃保温 15min，再向各管分别加入40℃下预热的1%淀 粉液2mL，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计 时保温5min。取出后向测定管迅速加入 4mL0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。
（一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净 的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂。 摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水 冷却，加蒸馏水定容至25ml。以1号管作 为空白调零点，在520nm波长下比色测定， 记录吸光度。以麦芽糖含量为横坐标，吸 光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
管号 麦芽糖 标准液 蒸馏水 麦芽糖 含量 3，5二硝基 水杨酸
淀粉酶的制备及活力测定
指导老师：
一、淀粉酶
• 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通 常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料， 由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的 退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、 碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种 类很多，根据织物不同，设备组合不同， 工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有 浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由 于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少， 可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜 明的环保特色。
操作项目 I-1 淀粉酶原液 钝化β-淀粉 酶 3，5-二硝基 水杨酸 2.0 1.0
生物化学实验淀粉酶活力测定 PPT
七、考虑题
• 1、为什么要将试管中的淀粉酶原液置70℃水浴中 保温15min？
• 2、为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉 溶液分别置于40℃水浴中保温？
三、仪器和试剂
• 主要仪器: • (1)离心机 • (2)分光光度计 • 试剂 • (1)标准麦芽糖溶液(2mg/mL) • (2)1%3,5-二硝基水杨酸试剂 • (3)1%淀粉
四、操作步骤
1、标准曲线的制作(每2组4人做1标准曲线)
编号
1#(空白)
2#
3#
4#
5#
6#
2mg/mL麦芽糖标准液(mL)
表1－1不同谷物淀粉的比旋光度
品种
品种
小麦
182、7ຫໍສະໝຸດ 马铃薯黑麦184、0
小米
大麦
181、5
荞麦
水稻
185、9
燕麦
195、4 171、4 179、5 181、3
玉米
184、6
[α]D20
实验二 氨基酸的纸上层析
一、实验目的
通过对氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析,滤纸纤维上的－ OH具有亲水性,因此能吸附一层水作为固定相,而通常把有机 溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动,称为下行层析;自 下而上流动,称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之 间连续抽提,使物质在两相之间不断分配而得到分离。
1、主要仪器: (1)旋光仪 (2)电子天平(感量0、0001g) 2、试剂:
⑴1％盐酸溶液 ⑵30％硫酸锌溶液。 ⑶15％亚铁氰化钾溶液。
四、实验步骤
1、样品的处理 在电子天平上称取小麦粉2、5000g置于三角瓶中→加
淀粉酶的制备及活力测定
（ 4 ） 1 ％ 淀 粉 溶 液 ： 称 取 1 g 淀 粉 溶 于
100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
（ 5 ）
0.4M NaOH
实训步骤
1 、称取 1g 萌发 3 天的小麦种子，置于
研钵中。 2. 加入少量的石英砂和 2mL 的蒸馏水， 研磨匀浆。 3. 将匀浆倒入离心管中，用 6mL 蒸馏 水分次将残渣洗入离心管。提取液在 室温下放置提取 15 至 20 分钟。每隔数 分钟搅动一次，使其充分提取。
[3] 何国庆 , 丁立孝 . 食品酶学 . 北京 : 化学工业出版社 2009 [4] 周晓云编著.酶技术.北京:石油工业出版社，1995 [5] 罗贵民.酶工程.北京:化学工业出版社，2003 [6] /question/266186296.htm l
实训原理：
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度 的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀 粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成 的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子， 淀粉酶活力最强，其中主要是α- 淀粉酶和β- 淀粉酶。两种 淀粉酶特性不同，α - 淀粉酶不耐酸，在pH3.6 以下迅速钝化。 β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。
（ 3 ）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，
参考文献：
[1] Gardner H W.Recent investigations into the lip oxygenase pathway of plants.Biochem Biophysical Ac ta.1991 [2] 莎娜,赵立超,陈永泉.α-淀粉酶对甘薯果脯废糖液澄 清效果的研究
生化实验04-淀粉酶活性的测定
四、实验步骤
1、麦芽糖标准曲线的制作 A540=0.264x-0.052 (x为mg麦芽糖） 2、酶液制备
称取1g萌发的小麦种子 加少量蒸馏水 研磨 转入100 mL容量瓶 定容 放置15min 过滤 淀粉酶原液（酶液Ⅰ） 取酶液Ⅰ 10 mL于50 mL容量瓶，用蒸馏水定容 至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液（酶液Ⅱ）
实验04
一、目的
二、原理
淀粉酶的作用机制及产物显色原理： α-淀粉酶 （内切酶） 淀粉 β-淀粉酶 （外切酶） 麦芽糖等 寡聚糖 麦芽糖 3，5-二硝 基水杨酸 3-氨基-5硝基水杨酸
（棕红色）
淀粉酶活性大小的表示方法：
淀粉酶活性的大小与产生的还原糖的量成正比。以单 位质量样品单位时间生成的还原糖的量表示。
பைடு நூலகம்
3、酶活力的测定
取4支干净的具塞刻度试管，编号，按下表操作：
操作项目
Ⅰ-1 淀粉酶原液（酶液Ⅰ）/mL 钝化β-淀粉酶 淀粉酶稀释液（酶液Ⅱ）/mL 3，5-二硝基水杨酸/ mL 预保温 1%淀粉溶液/ mL（ 40。C ） 保温 3，5-二硝基水杨酸/ mL 0 0 2.0 1.0 Ⅰ-2 1.0
测定α-淀粉酶和β-淀粉酶： α-淀粉酶不耐酸， β-淀粉酶不耐热，本实验采用70。 C保温15min钝化β-淀粉酶而测出α-淀粉酶。总活力 减去α-淀粉酶活力则为β-淀粉酶活力。
三、材料、仪器设备及试剂
材料：萌发的小麦种子（芽长1cm）
仪器设备：分光光度计、恒温水浴、刻度试管、
容量瓶
试剂：
1、标准麦芽糖溶液（1mg/mL） 2、3，5-二硝基水杨酸（含NaOH） 3、1%淀粉溶液
空白管：
2 mL蒸馏水 + 2 mL3，5-二硝基水杨酸，沸水浴 5min，定容至20 mL
淀粉酶的制备及活力测定
• 3、酶活力的测定：取5支干净的试管，编号，按表 进行操作
反应顺序 样品（重 复3个）
标准空白
样品空白
样品稀释液 （ml）
蒸馏水 依次加入淀粉 溶液（ml） 依次加入DNS 试剂（ml） 加入蒸馏水至 总体积（ml）
1
0 0 60℃预热5min 1.5
1
1
0
1.5
1.5
混合60℃保温30min 1.5 1.5 1.5
二、实验原理
• α －淀粉酶是内切酶，酶的作用点仅限于淀粉链的α －1，4 糖苷键，对α －1，6糖苷键不能作用，但能越过α －1，6糖 苷键，将α －1，4糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精， 而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐变红棕色。 • 在酶解的最初阶段，α －淀粉酶对淀粉的水解速度很快，但 当水解到一定程度后，水解虽在继续进行，水解速度却变得 缓慢。该酶的最小作用底物是麦芽三糖以上的低聚糖，对麦 芽三糖的作用很弱，对麦芽糖没有水解能力。 • 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶制剂的主要生 产菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。 • 本实验利用高产α －淀粉酶的枯草芽孢杆菌T2生产α －淀粉 酶用于制备淀粉水解糖。
三、材料、试剂与仪器
• 实验材料：萌发的小麦种子（芽长1厘米左右） • 仪器：722光栅分光光度计，恒温水浴锅，离心机，容量 瓶，小台秤，研钵，具塞刻度试管，试管，移液器，烧杯 • 试剂：① 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸 馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）； ② pH5.6的柠檬缓冲液： • A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L） • B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L） • 取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；
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淀粉酶的制备与活力测定基础知识淀粉酶是水解淀粉（包括糖原、糊精）中糖苷键的一类酶的统称，广泛存在于动植物和微生物中。
它是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广的一类酶。
1.α-淀粉酶的结构目前，已对很多不同种类和来源的α-淀粉酶（黑曲霉、米根霉、人和猪胰腺、人唾液腺、大麦种子和地衣芽孢杆菌)的晶体结构进行了X-射线衍射研究，并得到了高分辨率的晶体结构图。
研究表明所有α-淀粉酶均为分子量在50ku 左右的单体，由经典的三个区域(A、B、C)组成：中心区域A由一个(β/α)8圆筒构成；区域B由一个小的β-折叠突出于β3和α3之间构成；而C-末端球型区域C则由一个Greek-key基序组成，为该酶的活性部位，负责正确识别底物并与之结合。
为保持α-淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要一个能与之紧密结合的Ca2+，而Cl-往往是α-淀粉酶的变构激活因子，并且在所有Cl-依赖性的α-淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保守的[10]。
2.α-淀粉酶的性质早在1967年，Jones 和Varner就对小麦中α-淀粉酶的活性进行了研究[11]。
不同来源的α-淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别，它们的性质对在其工业应用中的应用影响也较大，在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶，因此对淀粉酶性质的研究也显得比较重要。
2.1底物特异性α-淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。
2.2最适 pH和最适温度反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。
因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。
淀粉酶的制备及活力测定方案
1
2
3
2、加蒸馏水1ml
加NaOH1ml
加HCl1ml
1
2
3
3、各加可溶性淀粉溶液2ml
1
2
3
4、放入60º C热水中
5、加斐林试剂2ml
1
2
3
60º C热水
60º C热水 温度条件保持5min
60º C热水
6、煮沸1min
1 2 3
实验器材
• 1.菌种：枯草芽孢杆菌JD-32生产法 • 2.仪器：培养皿、试管、发酵罐、灭菌 锅、振荡培养箱、高速冷冻离心机
工艺流程
保藏菌种
斜面活化
摇瓶种子 培养
厚层通风 发酵
种子罐扩 大培养
粗制品 沉淀 收集滤液 过滤
烘干 抽提 麸曲
离心洗涤沉淀ຫໍສະໝຸດ 风干粉碎精制品
实验步骤
1.培养基 的制备 与灭菌
三、实验步骤
• （一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详 教材）加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水 定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽 糖含量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线.（二）酶液制备：称取 1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸 馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心 管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数min搅动1次，使其充分提 取。然后在3000rpm下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水 定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。（三）酶活力 的测定：取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）进行操作。（四） 结果计算：淀粉酶活力=C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲 线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应 所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。
淀粉酶活力的测定方法
淀粉酶活力的测定方法淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。
不同来源的淀粉酶，性质有所不同。
植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。
α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。
Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。
单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。
β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca 2+及Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min可使其钝化。
通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α + β）淀粉酶总活力，然后在60 ℃加热15 min ，钝化β-淀粉酶，测出α -淀粉酶活力，用总活力减去α - 淀粉酶活力，就可求出β- 淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的3- 氨基-5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
1 酶活测定方法（1）标准曲线的制作(见下表)①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。
②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。
取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。
并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。
表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值试剂 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（mL）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 H2O（mL） 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麦芽糖含量（mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 OD520(2)粗酶液淀粉酶活力测定①待测粗酶液的制备：发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体，在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。
实验一α-淀粉酶活力的测定
结果处理与计算
数据处理
根据实验数据，我们计算了酶活力、 反应速率等参数。
图表绘制
我们使用图表展示了实验结果，以便 更直观地分析数据。
结果分析
酶活力比较
通过比较不同浓度酶液的酶活力，我们可以得出酶活力与酶浓度 之间的关系。
反应速率分析
通过分析反应速率，我们可以了解酶促反应的动力学特征。
结论总结
综合以上分析，我们可以得出实验一α-淀粉酶活力测定的结论， 并为其应用提供依据。
用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定各管 的吸光度值。
数据记录与处理
01
记录实验数据，计算α-淀粉酶活力。
02
根据实验数据绘制标准曲线和酶 活性曲线。
04
结果分析
数据记录
实验数据
在实验过程中，我们记录了不同浓度 酶液处理后的反应时间、温度、pH值 等数据。
实验误差
在实验过程中，我们尽量减小误差， 如使用精确的测量工具、多次测量取 平均值等。
05
实验总结与讨论
实验总结
01
实验原理
本实验通过测定α-淀粉酶催化淀粉水解生成可溶性糖的速率，从而确定
酶活力的大小。
02 03
实验步骤
准确称取适量淀粉和底物溶液，加入试管中，加入适量酶液，在适宜温 度下恒温水浴一定时间，然后加入碘液和氢氧化钠溶液终止反应，最后 用斐林试剂进行滴定。
实验结果
通过滴定结果计算出α-淀粉酶活力的大小。
DNS溶液
称取3，5-二硝基水杨酸6.3g，溶解于50mL蒸馏水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液 16.8mL，再加入20%酒石酸钾钠溶液10mL和2mol/L硫酸溶液20mL，混合均匀后 加热至80℃，不断搅拌，直至溶液呈透明。冷却后用蒸馏水定容至100mL，避光保 存。
实验一α淀粉酶活力测定
缓冲液
④
5 mL
淀粉液
20 mL
混合液
2.0 mL
⑥
酶液
0.5 mL
50mL
10 mL 溶解
煮沸
冷却 100 mL
30 s
⑦
60 s
⑤
1. 5 mL
碘液
90 s 120 s
0.5 mL
60℃ 60℃,5 min
60℃
180 s 210 s
[实验结果计算]
α-淀粉酶活力
1 g酶粉(或l mL酶液)在60℃、pH6.0条件下， 以1 h(60 min) 液化可溶性淀粉的克数(或毫克数)为1酶活 力单位，即1IU，单位为可溶性淀粉量(g) /mL·min。
实验一α-淀粉酶活力的测定
[实验性质]验证性实验 [实验学时]2学时 [实验目的](1)掌握淀粉酶糖化淀粉的原理； (2)掌握淀粉酶的性质及作用；
[实验原理]
α-淀粉酶催化淀粉水解生成小分子可溶性糊 精和少量的麦芽糖、葡萄糖，这些产物与碘 反应呈现不同的颜色。通过呈色反应，可了 解底物的降解速率，并以此可反映酶活力。
α-淀粉酶制剂的酶学特性及其应用
概述：中温α-淀粉酶采用枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)经 深层发酵提炼而成。广泛应用于酒精、啤酒、味精、淀粉糖、 发酵工业的液化以及纺织、印染退浆等。
原理：能水解淀粉分子中的α-1.4葡萄糖苷键，任意切断成长 短不一的短链糊精及少量的低分子糖类，直链淀粉和支链淀 粉均以无规则的形式进行分解，从而使淀粉糊的粘度迅速下 降，即“液化”作用，故又称液化酶。
中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材 料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。 2. 报告书的篇幅要求2000字以上。 3. 参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。 4. 提交时间限为每周一 下午3点。先交到课代表，由课代表汇 总之后按时送到任课老师办公室。 5. 领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。
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13、遵守纪律的风气的培养，只有领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿