高效制备色谱

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高效液相色谱和超高效液相色谱

高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。

它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。

本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。

一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。

不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。

在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。

固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。

样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。

分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。

二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。

（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。

常用的注射器有手动注射器和自动进样器。

手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。

（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。

其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。

常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。

恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。

梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。

（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。

常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。

高效制备色谱

内管采样塑料管，可自己装填规胶等填
料。使用时，在管壁四周加压，大大减
少了填料颗粒之间，以及填充床管与管
壁之间空体积，从而提高了柱效。 1）流动相
对于非极性或中极性的有机合成产物，
常用硅胶柱分离。流动相应首先用己烷和特丁基甲醚，后者作为极性改性剂调节溶剂极性，且不会生成过氧化物。如果要提高选择性和改变极性，用二氯甲
样品液/溶剂
流出液
备较复杂，价格更贵。
11.9.6 应用举例
合成中的制备色谱条件选择一般应参考薄层色谱条件、快速柱色谱初分条件、分析柱色谱或小规模柱分离探索分离条件，再扩大到同类型的制备柱分离。如对复杂样品或未知样品的提取和纯化，通常采用分析柱探索分离条件，然后按规模放大分离。在一般情况下，制备色谱
剂、荧光剂等，流动相的组成要进行适当的调整。
1）制备手性色谱拆分氧氟沙星光学异构体
2）合成羟基吡咯烷类化合物的制备纯化
3 ）高效液相制备分离抗氧剂 1010 加成反应副产物
HPLC拆分氧氟沙星（氟哌酸）
国内使用外消旋的 OFLOXCIN, 而日本已开发左旋氧氟沙星（LEVOFLOXCIN）,商品名Cravit。
填料技术的沿革
去。一般小颗粒（5-10μm）用于高分离度的制备，
粗颗粒（ 30-60μm）用于超载的高容量制备。样品容量的大小与填料的用量有关，而与颗粒度的关系不大。均匀的粗颗粒填料，多用于高样品量的制备。内径 0.8-1.0cm ，填有 10μm颗粒度的填料的半制备
柱，多用于重复分Biblioteka 和提纯产品的制备。另一种类型的制备柱是径向压缩柱：
烷比较合适。
加压
1）样品前处理粗制品预先用抽提、蒸馏或重结晶等方法净化。合成产物一般用快速柱色谱粗分离。必要时，在制备色谱前加一保护柱，避免杂质损坏制备柱。

高效液相制备色谱分离抗氧剂1010加成反应副产物

ＺａＱｉｅ，ａＧｏａｇＺｏＷｅｉＪＸｕｅｈｏｗｎＦｎｌｎ，ｈｕｉａｄｊｉｕｕｙｎｉｊｎ
（ｎｌｉｌｔ，ｉｎｎｉｒｔ，ｉｊ，００２ＡａｔａＣｎｒＴａｊＵｖｓｙＴａｉ３０７）ｙｃｅｅｉｎｅｉｎｎＳｐｒｔｎｐｒｉｔｎｔｅｐｏｕｔｉａｄｉｒａｔｎａｔｘｅｔ０ｒｐｒｒｅｂｅａａｏａｄｉｃｉｏｈｂ－ｄｃｎｉｎｃｏｏｎｉｉｎ１１ｗｅｆｍｄｉｎｕｆａｏｆｙｒｓｄｔｅｉｆｏｄｏ０ｅｅｏｙｈｈｆｒａｃｐｅａａｖｌｕｃｒｍｔｒｐｙＴｅｍｃｌｃｕｅｏｔｅｐｏｕｔｗｒｄｔ－ｉｐｒｍｎｅｐｒｔｅｉｈｏａｇａｈ．ｈｃｅｉｓｕｔｓｈｂ－ｒｄｃｅｅｅｇｅｏｒｉｉｄｑｏｈａｔｒｒｆｙｓｅｒｍｎｄＩｓｅｒｍｄｅｑａｔｉｍｔｄ．ｉｂＲｃｕａｏｒｌａｖｅｈｓｅｙｐｔｎｔｈｕｉｔｅｏＫｙｒｓｉｐｒｒａｃｌｕｃｒｍｔｇａｈ，ｒｐｒｔｅｏａｇａｈ，ｒａｏ１１ｅｗｄｈｈｆｍｎｅｉｈｏａｒｐｙｐｅａａｖｃｒｍｔｒｐｙｉｎｘ０ｏｇｅｏｉｄｑｏｉｈｏｇ０
在加成反应液中，副产物的存在会影响３以上，５酯与季戊四醇的反应，１１产率下降，使００杂质增多，致使１１晶形变坏。００为研究副产物对１１的影００响，以提供分析用纯化合物，本文采用了高效液相制备色谱法分离、了部分副产物。提纯

制备型高效液相色谱的实验方法

第ｌ０卷
第４期
实验科学与技术
ＥｘｐｒｍｅｉｎｅａｄＴｅｈｏｏｙｅｉｎｔＳｃｅｃｎｃｎｌｇ
ＶｏＩ０Ｎｏ４．１．Ａｕ．ｇ２０１２
２１０２年８月
制备型高效液相色谱的实验方法
Ａｂｔａｔｒｐｒｔｅｈｇｅｆｒｎｅｌｕｄｃｒｍａｏｒｐｙｈｓｂｅｉｅｙａｐｉｄｉｄｃｎ，ｆｅｃｅｃｌａｄｆｏｓｒｃ：Ｐｅａａｉｉｈｐｒｍａｃｑｉｈｏｔｇａｈａｅｎｗｄｌｐｌｎｍｅｉｉｅｉｈｍｉａｎｄ，ｐｒｉｕｖｏｉｅｎｏａｔ－ｅｌｌｐｌａｌｅａａｅｈｇｄｅａｕｄｈｇｕｔｒｄｃｓＴｉｐｐｒｎｒｄｃｄｔｅｅｐｒｎａｈｎｆｒｐｒｔｅｈｇｒａｙａｐｉｂｅｔｓｐｒｔｉｈａｄｄｖｌｅａＪｈｐｒｙｐｏｕｔ．ｈｓａｅｔｕｅｘｅｍｅｔｅｃｉｇｏｅａａｉｉｈｃｏｎｉｉｏｈｉｔｐｖｐｒｒａｃｉｕｄｃｒｍａｏｒｐｙｉｅａａｉｎｏｏｏｈｒｌｘｌｒｄｈｗｔｅｐｔａｈｎｏｔｎ，ａｄｔｅｗａｓｏｍｐｏｉｇｅｏｆｍｎｅｌｉｈｏｔｇａｈｎｓｐｒｔｆｔｃｐｅｏ，ｅｐｏｅｏｏｓｔｕｅｃｉｇｃｎｅｔｎｈｙｆｉｒｖｎｑｏｓｄｎｓｂｌｉｓｔａｙｅａｄｓｌｅｐｏｌｍｓＴｈｔｄｎｓａｐｉａｉｎａｉｔｓｗｒｔｅｇｈｎｄｔｅｔａｉｔｏａｌｚｏｖｒｂｅ．ｅｓｔｅｔｐｌｔｌｉｅｅｓｒｎｔｅｅ．ｕｉｅｎｎ，ｃｏｂｉｅＫｅｒｓｐｅａａｉｅｈｇｅｏａｃｉｕｄｃｒｍａｏａｈ；ｅｐｒｎ；ｔｃｐｅｏ；ｍｅｈｄｙｗｏｄ：ｒｐｒｔｉｈｐｒｒｎｅｌｉｈｏｔｇｐｙｖｆｍｑｒｘｅｍｅｔｏｏｈｒｌｉｔｏ

高效液相色谱的原理

所以LC只能用高压输液泵作为流动相的动力。
5.LC的样品回收比较容易，且可规模制备；GC的样品大部分会被破坏。 6.决定GC分离好坏的主要操作条件是固定相、流动相流速和柱温；决定LC分离好坏的主要操作条件是固定相、流动相流速和流动相的组成。 7.在对付复杂样品方面，GC可采用柱温程序升温办法进行组份的分离；LC则采用梯度洗脱的办法。
液相色谱仪的结构
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
仪器的组成方面
液相色谱：
溶质在液相中的扩散系数（10－5cm2/s）很小，因此在色谱柱以外的死空间应尽量小，以减少柱外效应对分离效果的影响。
气相色谱：
溶质在气相中的扩散系数（10－1cm2/s）大，在使用填充色谱柱时，柱外效应的影响较小，但是对于毛细管色谱柱也要尽量减少柱外效应对分离效果的影响。
气相色谱
（1）气体流动相为惰性气体，不与被分析的样品发生相互作用，它仅起运载样品的作用，一般对分离结果好坏没有影响。（2）气体流动相动力粘度为10-5Pa· s，输送流动相压力仅为0.1～0.5MPa
液相色谱仪的结构
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
固定相方面：
液相色谱
（1）分离机理：可依据吸附、分配、筛析、离子交换、亲和等多种原理进行样品的分离，可供选用的固定相种类繁多。（2）色谱柱：固定相粒度小为5～10um；填充柱内径3～6mm；柱效为103 ～ 104 ，柱温为常温。
内径20～50mm，柱长50cm ～ 100cm。
检测部:通常使用紫外检测器
紫外检测器的结构与分析型一样，但流过池采用短光程的
馏分部:馏分收集器
有手动和自动之分
制备HPLC概述—制备泵的耐压
制备HPLC系统因制备柱的填料很细，

制备液相色谱技术(LC-MS)

超载(overloading)：
纯度（purity)、产量（throughput）和收益（yield）（PTY）三者的关系
浓度过载和体积过载
浓度过载
决定于流动相中的溶解度；
位于吸附等温线的“制备”区域；产量由选择性决定；固定相颗粒大小影响较低。
体积过载
决定于进样体积；
位于吸附等温线的“分析”区域；产量由柱子的直径决定；固定相颗粒需要小一些。
基于质量（Mass-based）
根据馏分的质量作为指令参数，触发馏分收集器。特点：馏分纯度高、且收益高；馏分保留时间以及色谱峰峰形改变都不会影响到馏分的纯度；参数设置方便；需配备MS检测器，设备费用投入较大。
Mass-based
当使用按质量进行馏分收集时，只有当 MSD 检测到色谱峰含有目标质量数，且该目标质量数的强度超出特定的阈值时，馏分收集才被触发。这就确保了在每次进样中只收集含目标化合物的馏分。大部分情况下只有一个馏分。
为了准确地触发馏分收集器的启动和停止，必须测定后运行时间。后运行时间可以转换成与流速无关的延迟体积。后运行时间测定方法之一：通过在流路内注射一种染料，当馏分收集器针尖出现该染料时记录时间。后运行时间＝t馏分收集器- t检测器
后运行时间测定方法之二：
在馏分收集器内装入一个检测器，该检测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流路，两个检测器都记录信号。两个检测器之间的时间差就是后运行时间。
高效制备液相色谱技术
高效制备液相色谱的原理：
色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的，那就是色谱理论。但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的。制备型色谱：要求纯度、产量和收益。

制备型高效液相色谱法及其在中药研究中的应用

制备型高效液相色谱法及其在中药研究中的应用一、本文概述制备型高效液相色谱法（Preparative High Performance Liquid Chromatography, Prep-HPLC）是一种重要的色谱分离技术，以其高效、快速、自动化的特点在多个领域，特别是中药研究中发挥着越来越重要的作用。

本文旨在全面介绍制备型高效液相色谱法的基本原理、技术特点以及其在中药研究中的应用情况。

文章将概述制备型高效液相色谱法的基本原理和操作流程，包括色谱柱的选择、流动相的优化、样品的制备和分离等关键环节。

文章将重点讨论制备型高效液相色谱法在中药研究中的应用，包括中药成分的分离纯化、质量控制、药物代谢动力学研究等方面。

文章还将对制备型高效液相色谱法在未来的发展趋势和挑战进行展望，以期为相关领域的科研人员提供有益的参考和启示。

二、制备型高效液相色谱法的基本原理与技术制备型高效液相色谱法（Preparative High Performance Liquid Chromatography，Prep-HPLC）是高效液相色谱法（HPLC）的一个重要分支，它主要用于大规模分离、纯化和制备样品。

其基本原理基于混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配平衡，通过高压泵将流动相推动，使待测样品在固定相和流动相之间不断进行吸附、解吸、再吸附的分配过程，从而实现各组分的有效分离。

制备型高效液相色谱法通常使用更粗的色谱柱和更高的流速，以实现更大规模的分离和制备。

与分析型高效液相色谱法相比，制备型高效液相色谱法更注重样品的纯度和回收率，而不仅仅是各组分的定性和定量分析。

在制备型高效液相色谱法中，选择合适的固定相和流动相至关重要。

固定相的选择应根据样品的性质和目标组分的特性来确定，常用的固定相包括硅胶、氧化铝、聚合物等。

流动相的选择则要考虑其与固定相的相容性、对目标组分的洗脱能力以及分离效果等因素。

制备型高效液相色谱法还涉及到柱层析、梯度洗脱、循环洗脱等技术。

高效液相色谱用于鹿茸中多肽的分离制备

ＴｅｐｗｓａｔｗｔＳｐａｅＧ５ｈｓｍｌａｓｒｅｉｅｈｄｘ０ａｅｅａｄｈｐ－
ｃｌｍｎｃｌｃｔｅｔｅｒｄｅｔｗｈｃｉｔｒｏｕｔｏｌｔａｉｉｇｅｉｎｓｉｎｎｏｅｈｃｖｎｈｕｗｅｅｓｌｄｔＧ－０ｌｍｎＴｅｕｔｐｐｉｅｒｄａｅｗｉｅｔｈ１ｃｕ．ｈｍｌ－ｅｔｏｉｄｔｕｏｔｉｅｗｓｒｉｂｐｅａａｉｒｖｒｄｈｓａｎｄａｐｉｅｙｐｒｔｅｅｓ－ｂｕｆｄｒｖｅｅｐａｅｇｐｒｒｎｅｕｄｒｍａｏｒｐｙＴｈｈｓｈｈｆｍａｃｌｉｃｏｔｇａｈ．ｅｉｅｏｉｑｈ
茸总多肽具有明显的抗炎症作用。我们根据多肽的特性，利用高效液相色谱法（ＰＣ从鹿茸中制备ＨＬ）
多肽。ＨＬ用ＰＣ进行分离纯化，得到两种纯多肽（１Ｐ、
Ｐ）纯化后的ＰＰ经ＰＨ法鉴定只有一种末端氨２。１２Ｔ
基酸，实验证明，１药理Ｐ肽具有抗炎活性，２Ｐ肽无活性。Ｐ肽的抗炎活性表现在对右旋糖酐性足肿胀和１
（仪器与试剂一）１仪器美国Ｂｃｍｎ４高效液相色谱．ｅｋａ３－４Ｍ
恒溶剂泵１４制备系统，１Ｍ紫外可见双通道检测器，
分离制备。
（制备分离四）采用上述色谱条件，用控制保留时间截取不同的流分，得到较满意的效果。从制备分离结果看，用反相ＨＬＰＣ进行制备，５１分钟可完成一次分离制备
分析，所得纯肽经ＰＨ双相薄层色谱分析鉴定，Ｔ结

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制备柱上柱量分析柱上柱量 ( dP )2 LP
dA
LA
制备柱流量分析柱流量 (dP )2 dA
l 大颗粒（~50μm）大直径柱，在超载状态下完成相对大量的制备
11.9.2 制备色谱模型
在制备色谱中，为提高分离量，制备色谱一般是在非线性范围内运行。非线性色谱是制备色谱的理论基础，非线性色谱方程可以用一个浓度波的运动方程表示。制备色谱的溶质的保留时间：
另一种类型的制备柱是径向压缩柱：
内管采样塑料管，可自己装填规胶等填
料。使用时Leabharlann 在管壁四周加压，大大减少了填料颗粒之间，以及填充床管与管
壁之间空体积，从而提高了柱效。
1）流动相
对于非极性或中极性的有机合成产物，
常用硅胶柱分离。流动相应首先用己烷
和特丁基甲醚，后者作为极性改性剂调
节溶剂极性，且不会生成过氧化物。如
压力、增加柱效效果好。当然，制备色谱中的分
离度比分析分离度更为重要。
R 1 ( 1) k' N
4
1 k'
当柱子在超载时，大量样品进入柱子，使得分离度、塔板数和容量因子随超载的状况而变化。在制备色谱过程中单位时间产量的提高可通过增加流速和增加柱子的载量来实现。
流速，cm/sec 图不同进样量时流速对分离度的影响
制备色谱的进样体积：
Vi
V0 (1 k'i N
)
对于k’=4，流出液组分浓度
可达0.03%--0.3%，大小与α有关。
分析分离
增加分离度
增大进样量
超载条件
最大纯化产量与容量因子的关系
11.9.3 实验条件的选择
1）柱体积与填料
液-固色谱是制备色谱中常用的一种模式，而液固色谱中流动相选择很重要。流动相首先应使制备组分有较大的溶解度，且容易从纯化后的组分中除去。一般小颗粒（5-10μm）用于高分离度的制备，粗颗粒（30-60μm）用于超载的高容量制备。样品容量的大小与填料的用量有关，而与颗粒度的关系不大。均匀的粗颗粒填料，多用于高样品量的制备。内径0.8-1.0cm，填有10μm颗粒度的填料的半制备柱，多用于重复分离和提纯产品的制备。
采用制备色谱得到的纯物质的主要杂质可能是流动相中的不溶物，如填料离解物。
11.9.4 制备色谱仪
l 输液能力达100mL/min，压力在200kg/cm2 左右 l 进样器0.5~5mL l 检测器：“缩小光程和采用分流”，如 0.2~0.5cm的UV池或RI测定 l 馏分收集器：定时收集或定体积收集 l 再循环阀和溶剂再生装置
可见，制备色谱中的“制备”这一概念指获得足够量的单一化合物，以满足研究和其它用途。制备色谱的出现，使色谱技术与经济利益建立了联系。制备量大小和成本高低是制备色谱的两个重要指标。
气相制备色谱主要用于石油化工产品和挥发性天然产物的色谱纯样品制备。
表11.9.1 仪器分析所需纯样品量
仪器
NMR FT-IR
果要提高选择性和改变极性，用二氯甲
加压
烷比较合适。
1）样品前处理
粗制品预先用抽提、蒸馏或重结晶等方法净化。合成产物一般用快速柱色谱粗分离。必要时，在制备色谱前加一保护柱，避免杂质损坏制备柱。
2）纯组分的回收
收集后的样品组分的有机溶剂一般用旋转蒸发方式除去；水分则采用冷冻干燥除去；流动相中的有机溶剂常用闪蒸方式回收。
IR UV-Vis 元素分析
MS 全面鉴定一样品结构
样品量（mg）
1-10 0.1-1
1 <1 1-10 0.01-1 10-50
分离度
分析速度
分离样品量
思考：这三个指标是相互制约达的，不同分离目
的有不同要求。请具体分析：
1）分离分析
2）制备分离
评价制备色谱效率的主要指标是单位时间内分离纯物质的量，以纯组分量和该组分保留时间之比表示，定义为产率。另一指标是最大允许分离样品体积，它决定于固定相的负荷和色谱柱尺寸。
一般的分析型高效液相色谱仪可以换上内经在 10mm的半制备柱完成一定的制备任务。
塔板高度，mm
1E-5
1E-4
1E-3 1E-2
样品量
图样品量对塔板高度和容量因子的影响
容量因子
表11.9.2 制备色谱和分析色谱的比较
制备色谱
分析色谱
分离目的单位时间内获得符获得混合物中各组分合纯度的物质量的信息（定性定量）
色谱模型非线性色谱
线性色谱
仪器设备制备柱、高流量、高压稳流、高精度进
积小，但样品浓度超过吸附等温线的线性范围，出现的
峰型不对称，峰前沿陡峭而后部拖尾；体积超载是指
进样体积比较大，样品浓度恒定，应限制在吸附等温线的线性范围内，洗脱的峰型高、对称或是个大平顶。
制备条件的选择，包括上柱量、容量因子、选择性以及柱效。Knox和Pyper研究指出，分离纯化
的基本参数是得到最大的选择性和高浓度的制备物质。在高浓度下，无论是溶质超载还是体积超载都保证了制备产量的提高。但体积超载要比溶质超载得到的产量低。高浓度的质量超载，在分离过程中避免了大体积引起的峰的扩张，在制备色谱中具有更大的优点。
11.9 高效制备色谱
（High Performance Preparative Chromatography）
任何一种分离方式均可用于制备目的，色谱和电泳也不例外（注意实际效果！）。本章仅介绍常用的液相色谱方法。
制备色谱是指采用色谱技术制备纯物质，即分离、收集一种或多种色谱纯物质。而利用高效液相色谱分离足够量的混合物，并把分离所得的各组分逐个收集起来，得到高纯度的样品，称为高效液相制备色谱。
大进样、低检测样、高灵敏检测（高
（高通量）
重现性）
液相色谱制备纯物质的目的：结构鉴定，生物和毒理试验，以及某些珍贵或难分离单组分物质的生产。
11.9.1 制备色谱分离的一般考虑
任何制备分离的色谱模型都和分析分离的模型
相类似。在制备色谱中，容量因子取决于样品量。
如果柱子在超载的状态下工作，增加柱长比降低
t R tp t 0[1 G(1
bC ot P )2 ] Gt 0
可见，许多流行于分析型液相色谱的概念或参数在制备色谱中不太适用。使用这些结论容易被引入歧途。如：分离度、柱效柱和峰型的对称性在讨论制备色谱最佳化时往往很少考虑。
制备色谱的三种运行模式
多组分
主成分
微量组分
超载有溶质超载和体积超载两种。溶质超载是指柱体