土壤纤维素酶测定方法
土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶一、试剂：1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。
2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。
3）还原糖试剂：试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。
试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。
试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。
4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。
二、仪器设备恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶三、操作步骤取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。
同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。
取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。
吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。
加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。
标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。
土壤中纤维素二糖水解酶检测方法
土壤中纤维素二糖水解酶检测方法
土壤中纤维素二糖水解酶是一种重要的酶类，它在土壤有机质分解和循环过程中起着关键作用。
检测土壤中纤维素二糖水解酶的方法通常包括以下几个方面：
1. 酶活性测定，这是最常用的方法之一，通过测定土壤样品中纤维素二糖水解酶的活性来评估其在土壤中的水平。
常见的测定方法包括使用对羟基苯甲酸或对羟基苯甲酰乙酰乙酰胺等底物，在一定条件下测定酶活性的变化。
2. 分子生物学方法，利用PCR技术或实时荧光定量PCR技术检测土壤样品中纤维素二糖水解酶基因的存在和丰度。
这些方法可以提供关于土壤微生物群落中相关基因的信息，从而间接评估纤维素二糖水解酶的水平。
3. 酶联免疫吸附测定法（ELISA），ELISA技术可以用于定量土壤样品中纤维素二糖水解酶的含量，通过特异性抗体与酶结合进行颜色反应，从而测定酶的浓度。
4. 同位素标记法，利用同位素标记的底物来跟踪土壤中纤维素
二糖水解酶的活性，通过测定同位素标记的底物代谢产物的丰度来评估酶的活性水平。
5. 土壤微生物组学方法，利用高通量测序技术对土壤微生物群落进行分析，从中获取有关纤维素二糖水解酶相关微生物的信息，以此间接评估酶的水平。
综上所述，检测土壤中纤维素二糖水解酶的方法涉及到酶活性测定、分子生物学方法、酶联免疫吸附测定法、同位素标记法和土壤微生物组学方法等多个方面，综合运用这些方法可以全面准确地评估土壤中纤维素二糖水解酶的水平。
最新相关土壤酶测定方法(综合)
土壤蛋白酶活性测定(茚三酮比色法)实验试剂：1、pH7.6的0.05mol/L的tris—HCL缓冲液(三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液):50ml0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷与27.5ml0.2mol/L的盐酸混合,稀释成200ml。
2、2%酪酸钠溶液:称取2g 酪酸钠,加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液,沸水浴处理5min,待膨化后加入pH7.6的tris—HCl缓冲液约80ml,继续沸水浴处理,直至完全溶解,用同样的缓冲液定容至100ml。
3、Tris—HCl—CaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/Ltris—HCl缓冲液配制的0.01mol/L的CaCl2溶液。
4、0.6mol/L乙酸铅溶液。
5、草酸钠—乙酸混合溶液:每1000ml0.26mol/L的草酸钠溶液含有240.7ml0.2mol/L的乙酸。
6、茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂:称取2g茚三酮,0.02g 抗坏血酸,溶于100ml无水乙醇。
7、0.2%KIO3溶液。
8、pH5.8乙酸—乙酸钠缓冲液:94 ml0.2mol/L乙酸钠与6ml0.2mol/L乙酸混合。
9、0.01%甘氨酸标准溶液:1g甘氨酸溶于1000ml水,再稀释10倍。
10、甲苯。
以上试剂均为分析纯。
实验仪器:基本仪器如试管、烧杯等、离心机、分光光度计、刻度试管、水浴锅、电子天平、移液管实验步骤1、标准曲线的绘制①分别吸取50 、100、150、200、250、300μl0.01%甘氨酸标准溶液,置于10 ml刻度试管中(浓度分别相当于NH2 0.107、0.213、0.320、0.426、0.533、0.639μg/ml),加入2mlpH5.8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液②加入1.5ml 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂,混合均匀,沸水浴加热16min③取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀,用蒸馏水定容至10ml,1h内在570nm处比色测定吸光值;以氨基氮(NH2)的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。
纤维素酶活测定
【实验目的】1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法2、巩固使用分光光度计【实验材料】1、3、5—二硝基水杨酸显色液；2、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；3、标准葡萄糖溶液（1mg/mL）。
【实验步骤】1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,同样定容至25ml。
在550nm 处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线（见表一）。
2、空白管的测定：取1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。
其它操作同样品管。
3、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液，冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25毫升，混匀，550nm测OD值（见表二）。
实验结果：见表一、表二：表一标准曲线的测定表二样品的测定图一：标准葡萄糖光吸收曲线结果分析：拟合所得的标准曲线为：Y=7.439×10-4X-0.00243。
拟合度为0.99917。
由样品的A值，可得三份溶液的葡萄糖含量分别为：652.5ug，648.5ug，653.9ug。
所以平均含量：651.6ug。
纤维素酶活力单位=651.6/0.01×30=2172 ug/mg×min【思考与讨论】1、在测定时为使各样品和空白管处理一致，应同时加入试剂，同时放入水浴中，同时取出水浴，以使反应得进行程度一致。
2、在测溶液的OD值之前，应将溶液摇匀，摇匀的方法是用保鲜膜蒙住试管口，然后来回震荡试管。
土壤酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN 的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL 置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内在分光光度计上于578nm处比色。
土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)
一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。
在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。
所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。
纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。
3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L；0.2mol/L 醋酸钠溶液16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L；取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液。
4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。
5）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。
它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。
土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。
人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。
本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。
三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。
培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容。
土壤纤维素酶活性测定试剂盒说明书(分光光度法)使用说明
土壤纤维素酶活性测定试剂盒说明书(分光光度法)货号:BC0150规格:50管/24样产品说明：S-CL主要来源于土壤微生物，S-CL催化农作物秸秆产生的葡萄糖是主要的碳源营养物质。
本产品采用3.5－二硝基水杨酸法测定S-CL催化纤维素降解产生的还原糖的含量。
试剂组成：试剂一：甲苯10mL×1瓶，4℃保存；（自备）试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂四：液体15mL×1瓶，4℃保存；标准品：粉剂×1支，4℃保存，含10mg无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入1ml 蒸馏水溶解，配制成10mg/ml葡萄糖溶液备用，4℃可保存1周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。
标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mg/ml。
加样表和测定步骤：对照管测定管标准管风干土样（g）0.250.25-试剂一(μL)125125-煮沸15min（盖紧）振荡混匀，室温放置15min-试剂二（μL）250250-试剂三（μL）10001000-蒸馏水（μL）250250-振荡混匀，40℃水浴糖化1h后，煮沸15min（盖紧，防止水分散失）,得糖化液糖化液(μL)505050试剂四(μL)150150150混匀，沸水浴中煮沸显色15min（盖紧，防止水分散失），冷却蒸馏水（μL）105010501050混匀，540nm处蒸馏水调零，测定吸光值A，样品管计算ΔA=A测定管-A对照管标准曲线的建立：540nm处蒸馏水调零，读标准管吸光值A。
以浓度（y）为纵坐标，吸光度A（x）为横坐标建立标准曲线。
活力计算：根据标准曲线，将ΔA带入公式中（x）计算样品浓度y（mg/mL）。
单位的定义：每天每g土样中产生1mg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
S-CL活力（U/g）＝y×V反总÷W÷T=156×yT：反应时间，1h=1/24d；V反总：反应体系总体积：1.625mL；W：样本质量，0.25g。
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纤维素酶活性测定
一、试剂：
1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。
2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。
3）还原糖试剂：
试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。
试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。
试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。
4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。
二、仪器设备
恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶
三、操作步骤
取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。
同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。
取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。
吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。
加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。
标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。
c) 空白：
无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。
无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。
四、结果计算
土壤纤维素酶活性（µg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt
式中C为样品的葡萄糖含量（µg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；dwt为烘干土壤质量（g）
五、注意事项
（1）此方法较适用于林地土壤，耕地土壤的测定结果一般较低。
（2）氰化钾为剧毒试剂，接触皮肤的伤口或吸入微量粉末即可中毒死亡。
与酸接触分解能放出剧毒的氰化氢气体，与氯酸盐或亚硝酸钠混合能发生爆炸。
（3）盐分、铵离子、银、草酸锰、氧化物以及氟等含量较高时，会干扰葡萄糖的测定。
因此，建议稀释滤液。
（4）培养时加甲苯与不加甲苯的测定结果一般没有显著性差异。
（5）测定还原糖时需严格控制体系的pH值，加入还原糖试剂A和还原糖试剂B 后，pH 值应该高于10.5，加入还原糖试剂C之后，pH值则应低于2。
（6）含氰化物的溶液可以在碱性条件下用H2O2氧化处理，或者加入强碱性次氯酸盐，反应24小时后，再用大量水冲入废水系统。