土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选
枯草芽孢杆菌分离及筛选鉴定实验方案
氯化钠 ５克
蒸馏水 １００毫０升
氯化钠 ５克
琼脂 １８克
4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min 灭菌
试剂： 40%NAOH(或 KOH)，肌酸。 3、 步骤：
1. 接种与培养 将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于 30 摄氏度培养 4 天。
2. 结果观察 在培养 4 天后，取培养液（约 2ml）和等量的 40%NAOH 相混合，如少量肌酸 （约 0.5—1mg），充分振荡， 2—5min 后如培养液呈红色，即为 V.P试. 验阳性， 有时须放置更长时间才出现红色反应。
ｐＨ ６．５ 121℃灭菌 20min
2、培养基：半固体培养基 3、操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于
30 培养 3—7 天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺 线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌
三、乙酰甲基甲醇实验 1、 原理：
本实验是测定芽孢杆菌 （或其他细菌） 发酵葡萄糖的变化。 有些芽孢杆菌发酵葡萄糖 产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或 2,3-丁二醇。乙酰 甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰， 后者与蛋白胨中精氨酸所含 的胍基起作用，生成红色化合物，即表示 V.P.试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸
蒸馏0 克
pH
7.0-7.2
121℃灭菌 20min
淀粉培养基
牛肉膏 ５克
以补充胍基，可加速反应。反应式如下： 2 丙酮酸—— >乙酰甲基甲醇 + 2 二氧化碳；
-2H 乙酰甲基甲醇———— >二乙酰；
+KOH
缩合 二乙酰 + NH=C(NH 2)2———— >红色化合物 2、 培养基和试剂 培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。调节 PH 6.5，每管分装
分离枯草芽孢杆菌的流程
分离枯草芽孢杆菌的流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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枯草芽孢杆菌的分离筛选
枯草芽孢杆菌的分离筛选白延琴;辛小玲;来有志;张效川;张刚娟;刘建峰;辛亚平【期刊名称】《畜牧兽医杂志》【年(卷),期】2013(032)002【摘要】本文基于从秸秆垛底层土壤中分离枯草芽孢杆菌的目的,为发酵秸秆提供菌株,从陕西杨凌农村秸秆垛中采取底层土样并进行分离.分离出11株菌,经过形态特征、生理生化特征等方法从中分离初步鉴定了3株疑似菌株.经对液态发酵条件的优化,对3株疑似菌进行液态发酵试验,以粗蛋白和粗纤维含量为标准,筛选出一株发酵效果最好的菌株b-1进行了16S rDNA序列分析,最终鉴定b-1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其同源性≥99％.【总页数】5页(P24-27,31)【作者】白延琴;辛小玲;来有志;张效川;张刚娟;刘建峰;辛亚平【作者单位】子长县畜牧兽医局史家畔畜牧兽医站,陕西子长717300;富平县畜牧兽医工作站;陕西正大有限公司;吴起县畜牧局;商南县畜牧中心赵川兽医站;陕西洛南县四皓镇兽医站;西北农林科技大学动物科技学院【正文语种】中文【中图分类】S816.6【相关文献】1.四株纳豆枯草芽孢杆菌的分离筛选与鉴定及其对瘤胃发酵的影响 [J], 李吉楠;孙鹏;赵圣国;李发弟;王加启;卜登攀2.产胞外淀粉酶枯草芽孢杆菌的分离筛选及其紫外诱变育种 [J], 谢凤行;赵玉洁;周可;张峰峰;李亚玲3.高溶纤酶活性枯草芽孢杆菌的分离筛选与鉴定 [J], 梁思宇;陆兆新;邹晓葵;张晓东4.枯草芽孢杆菌HAB-8菌株分离筛选鉴定及抑菌机理初步研究 [J], 李琪敏;周婷婷;秦春秀;何其光;缪卫国;刘文波5.枯草芽孢杆菌TLO3的全基因组测序及与枯草芽孢杆菌168和XF-1的比较基因组学研究 [J], 张小凤;黄慧敏;易根云;吴生荣;周建业;李志强;包广洁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌的培养、筛选分离和鉴别
03
枯草芽孢杆菌的筛选分离
枯草芽孢杆菌的分离纯化
制样品稀释液
取得土壤样g，放入盛 1 有99ml的无菌水锥形
瓶中，充分振荡。
培养
用移液枪将各个浓度梯度的一 3 定量稀释液接种到开始时制作 好的培养基上，用无菌刮铲涂 匀。37℃下倒置培养24小时。
加热筛选能形成芽孢的 细菌
在超净工作台中，将装有锥形瓶 2 的菌悬液加塞、包扎、摇匀后放
3
高压灭菌：将分装包扎的培养基放入 高压蒸汽灭菌锅中进行高压蒸汽霉菌， 用0.075MPa灭菌30分钟。（使用高 压蒸汽灭菌锅要注意放完冷气。灭菌 结束后等到气压降到“0”时才能打 开放气阀。）
培养基 制备
2
精确称取蔗糖30g、磷酸二氢钾4.5g、 硫酸铵2.5g、蛋白胨10g、碳酸钙 2g、酵母膏5g和琼脂20g，然后在 1000ml水中充分溶解。
道中的游离氧，造成肠道
2
低氧，促进有益厌氧菌生
长，间接抑制其它致病菌
生长。
4.
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α -
4
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤
维素酶等酶类，在消化道中与
动物体(人体)内的消化酶类一
同发挥作用。
3.
3
刺激动物(人体)免疫器官
的生长发育，激活T、B
淋巴细胞，提高免疫球
蛋白和抗体水平，增强
细胞免疫和体液免疫功
能，提高群体免疫力。
生物科学 进入人体，能100%到达大小肠，抑
制致病菌，促进有益厌氧菌生长，并产生 乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑 制其它致病菌生长。提高免疫球蛋白和抗 体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能， 提高群体免疫力。合成α -淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与 动物体(人体)内的消化酶类一同发挥作用。
枯草芽孢杆菌实验报告
微生物技术综合实验年级：13级生物工程（专升本）班级：学号：姓名：徐红贞指导老师：刘凤霞教授日期：二零一三十月五号目录1实验目的及原理 (1)1.1实验目的 (1)1.2实验原理 (1)2实验材料 (1)2.1实验仪器 (1)2.2实验试剂 (1)2.3培养基 (2)2.3.1 生长培养基 (2)2.3.2鉴定培养基 (2)2.3.3摇瓶培养基 (2)3试验方法 (2)3.1仪器的准备 (2)3.2培养基的配置 (2)3.3初步筛选及鉴定 (2)3.3.1采集土样 (3)3.3.2富集培养 (3)3.3.3稀释分离、纯化 (3)3.3.4初筛 (3)3.4复筛及鉴定 (4)3.4.1革兰染色 (4)3.5酶活力的测定 (4)3.5.1摇瓶培养 (4)3.5.2酶液稀释 (4)3.5.3酶液测定 (4)4结果分析 (5)4.1平板涂布分离 (5)4.2平板划线分离 (5)4.3初筛 (5)4.4复筛 (5)4.5摇瓶培养 (6)4.6酶活力测定 (6)5参考资料 (7)6附录 (8)微生物上游技术综合实验枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定1.实验目的及原理1.1实验目的（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。
（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。
（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。
（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。
（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
1.2实验原理选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。
因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。
以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。
一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。
采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。
2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。
3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。
通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。
固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。
4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。
液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。
培养时间一般为24-48小时。
5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。
一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。
6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。
纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。
二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。
枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。
2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。
常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。
3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。
4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。
土壤中枯草芽孢杆菌的分离与鉴定之细菌芽孢染色法
土壤中枯草芽孢杆菌的分离与鉴定之细菌芽孢染色法一、实验目的1.学习掌握芽孢染色法并了解芽孢的形态特征2.学习并掌握荚膜染色法并了解荚膜的形态特征3.学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验原理1.细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。
2.芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色又难以脱色这一特点而设计的。
3.所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而更能明显地衬托出芽孢，便于观察。
4.染色方法：改良后的Schaeffer-Fulton氏染色法三、实验仪器及材料1.菌种：枯草芽孢杆菌2.染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液3.仪器或其他用具：Eppendorf管架、载玻片、显微镜、电磁炉、搪瓷杯等。
四、实验步骤1.制备菌悬液：在EP管中滴两滴生理盐水，挑取2-3环菌苔加入到含生理盐水的EP管中，混合均匀。
2.染色：在EP管中滴加2-3滴孔雀绿染液，盖紧EP管，将EP管插入浮筏中，放进沸水中加热15-20分钟，加热过程需要有人看护，随时控温，防止沸水进入EP管。
3.涂片固定：取半滴经孔雀绿染色的菌悬液在载玻片的中央，用接种环将菌液涂抹均匀，将载玻片用法电风机冷风吹干，经过酒精灯火焰固定三次。
4.脱色：待玻片冷却后，水洗脱色。
5.复染：滴加数滴0.5%番红水溶液在菌膜上，染色2min，再水洗。
6.镜检：将晾干后放在显微镜下观察。
五、实验结果结果描述：大部分菌体被染成红色，少部分被染成绿色，说明有芽孢产生，但是芽孢的数量没有菌体多，芽孢被染成绿色，菌体被染成红色，由绿色芽孢的外面还包裹着一层淡红色带可知，该芽孢是内生芽孢，芽孢呈椭圆形，位于菌体的中央，是中央生的芽孢，同时可以观察到枯草芽孢杆菌的大小比平常的小得多。
枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案
枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案3班第3组周三15:30-17:00周四08:30-09:50组长：刘晨阳组员：吕宛容，韩晴，董春燕，邢爽，高倩倩，薛琳琳，邵宇婷，吴子侥枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定一、目的要求1、掌握分离、纯化枯草芽胞杆菌的方法。
2、掌握如何鉴别所得菌是否为枯草芽胞杆菌的方法。
二、实验原理芽孢杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽胞0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
其分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于其能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
其菌落变化很大，芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
芽孢杆菌能产生芽孢，芽孢具有较强的抗高温能力在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离纯化及生理生化鉴定得到芽孢杆菌。
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土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选
2013023123刘倩倩
一、实验目的
1. 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。
2. 了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。
根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。
二、实验原理
枯草芽抱杆菌属革兰氏阳性菌，芽抱0.6〜0.9 X 1.0〜1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
有的菌株是a -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中。
选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80 度的水浴处理样品1 小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。
利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3 天后，观察。
然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽抱杆菌。
再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。
三、实验材料
（1）选择培养基
本次实验进行产淀粉酶的枯草芽抱杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。
配方：牛肉膏5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠5.0g
可溶性淀粉10.0g
琼脂20g
蒸馏水1000ml
调整pH 至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。
2）溶液或试剂
牛肉膏1.25g
蛋白胨2.5g
氯化钠1.25g
可溶性淀粉2.5g
琼脂5g
碘11 克，碘原液2 毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2 克，磷酸氢二钠45.23 克，柠檬酸8.068 克，氯化钴25 克，重铬酸钾3.34 克，100 毫升0.01NHCL。
（3）仪器或其他用品
平板培养皿10 个、试管15 支、三角瓶2 个、烧杯3 个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。
四、实验步骤
倒平板f制备梯度稀释液f涂布f培养f初筛f复筛f纯化f保存
（1）实验前准备
制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。
倒平板。
把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。
（2）制备土壤稀释液
取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，产去表层5cm去
5-15cm处。
用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。
采样后应尽快分离。
振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。
放入盛有99ml 无菌水三角瓶中，常压80 度的水浴处理样品1 小时后，取出。
用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2 、10-3、10-4、10-5 不同稀释度的土壤溶液。
（3）涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5 三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3 、10-4、10-5 三管土壤稀释液中各吸取0.2ml ，小
心地滴在对应平板培养基表面中央位置。
用无菌涂布器涂布。
右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。
室温下静置5-10min ，使菌液浸入培养基。
（4）培养
将淀粉培养基平板倒置于30°C 培养箱中培养1—3d。
（5）初筛观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30°C 的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。
（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较。
）
（6）复筛
测定其淀粉酶活。
1）试剂和器材
1. 试剂：
①碘原液：称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升。
②稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用。
③2%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉2 克，加5 毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐倾入70 毫升煮沸的蒸馏水中。
继续煮沸2 分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（PH为6）。
④柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2C45.23克，柠檬酸
（C6H8O7?H2）O8.068 克，加水溶解，稀释至1000毫升。
⑤标准比色液：称取氯化钻（CoCL2?6H2）25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01N HCL，其五倍稀释作标准。
⑥样品：细菌-a淀粉酶
2. 器材
①电热恒温水浴②试管③量筒④吸量管（1ml）
3. 操作方法：
1) 取试管1支，加20毫升2%®粉，混匀，在30C水浴中，使管内温度达到30C。
2) 将淀粉酶0.5ml加到30E的淀粉液中，混匀，在30C水浴中保温，自加入记时，经5 分钟后取反应液1 毫升，加入盛有5 毫升稀碘液的试管中。
混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，记录反应进行的时间。
3) 计算。
在上述条件下，每一小时催化1 毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定为一个酶活力单位。
(7) 纯化并保存
菌种保存时一般都需要不受杂菌污染，菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。
同时，做好以下工作：
①做好菌种保存记录，注明菌种名称，分离年月日、分离者姓名、分离地点等。
②防止杂菌污染及意外事故，把菌种保存在2—3 只试管中备用。
③原始菌种妥善保存。
五、结果与分析
1. 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数
2. 枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观察鉴定结果。