人用狂犬病疫苗Vero细胞制备标准操作规程
vero细胞灭活疫苗生产流程
vero细胞灭活疫苗生产流程Vero细胞灭活疫苗是一种常见的疫苗制备方法，以下是其生产流程的相关参考内容：第一步：病毒分离和培养首先，需要从感染病人体内或其他受感染物质中分离出目标病毒株。
这可以通过对病人样本进行处理、传代和筛选得到。
然后，将所得病毒株接种到一种称为Vero细胞的培养物中，这是一种来自非洲绿猴肾脏的细胞系。
第二步：病毒扩增和收获在与Vero细胞的培养中，病毒将感染并复制。
在感染发生后的一定时间内，细胞培养物中会积累大量病毒颗粒。
这时，通过监测病毒的生长曲线和细胞的病毒感染率，确定合适的时间点进行收获。
第三步：病毒灭活收获病毒后，需要对其进行灭活处理，以确保疫苗的安全性。
常见的灭活方法包括化学灭活和物理灭活。
化学灭活是通过加入一种化学物质，如甲醛或β-晶状糖蛋白醛缩合物，来破坏病毒颗粒的结构和功能。
物理灭活可以通过热处理或放射线照射来破坏病毒核酸或蛋白质。
第四步：疫苗制剂的形成灭活后的病毒需要与其他辅助成分结合形成疫苗制剂。
这些成分可能包括佐剂（如氢氧化铝）、防腐剂（如2-苯氧乙醇）、稳定剂（如蔗糖）和缓冲剂（如磷酸盐缓冲液）。
添加这些成分有助于提高疫苗的稳定性、抗原性和保存性能。
第五步：疫苗包装制剂后的疫苗需要进行包装，以确保其在运输和储存过程中的稳定性。
通常，疫苗会被分装到玻璃瓶或注射器中，并在包装过程中进行灭菌处理。
在包装和存储过程中，疫苗需要控制在适当的温度范围内，以保持疫苗的活性。
第六步：质检和批准在疫苗生产的每个阶段都需要进行质量控制和质检。
这包括对感染病毒、灭活处理、制剂和包装进行测试，以确保疫苗的纯度、安全性和有效性。
只有通过了全面的质检和评估流程后，疫苗才能获得相关的批准和上市许可。
总结：以上就是Vero细胞灭活疫苗生产流程的相关参考内容。
这个流程涵盖了病毒分离和培养、病毒扩增和收获、病毒灭活、疫苗制剂的形成、疫苗包装以及最终的质检和批准过程。
这些步骤共同确保了疫苗制备的安全性和有效性，并为疾病的预防和控制提供了可靠的工具。
人用狂犬病疫苗(Vero 细胞)
人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）Renyong Kuangquanbing Yimiao(Vero Xibao)Rabies Vaccine for Human Use（Vero Cell）本品系用狂犬病病毒固定毒接种Vero细胞，经培养、收获、浓缩病、病毒灭活、纯化后，加入适宜的稳定剂后制成，用于预防狂犬病。
1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2 制造2.1 生产用细胞生产用细胞为Vero细胞。
2.1.1细胞的管理及检定应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
各细胞种子批代次应不超过批准的限定代次。
取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。
2.1.2 细胞制备取工作细胞库中的1支或几支细胞管，细胞复苏、扩增至接种病毒的细胞为一批。
将复苏后的单层细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，分散成均匀的细胞，加入适宜的培养液混合均匀，置37℃培养成均匀单层细胞。
2.2毒种2.2.1名称及来源生产用毒种为狂犬病病毒固定毒CTN-1V株、aGV株或其他经Vero细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。
2.2.2种子批的建立应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。
各种子批代次应不超过批准的限定代次。
狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在Vero细胞上传代建立工作种子批传代次数应不超过35代，aGV株在Vero细胞上传代建立工作种子批传代次数应不超过15代。
2.2.3种子批的检定主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行 2.2.3.1-2.2.3.4项检定。
2.2.3.1鉴别试验用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。
将毒种作10倍系列稀释，取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合，同时设立正常血清对照组，试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只，每只脑内接种0.03ml，观察14天，中和指数应不低于500。
2020年版药典狂犬疫苗vero细胞残留dna标准
2020年版药典狂犬疫苗vero细胞残留dna标准1. 引言1.1 概述近年来，疫苗安全性成为公众关注的焦点之一。
在疫苗生产过程中，细胞培养是一个重要环节。
随着细胞培养技术的发展，vero细胞作为一种常用的细胞株广泛应用于狂犬疫苗生产中。
然而，vero细胞作为宿主细胞，在生物制品中可能残留其DNA，这引起了对药物安全性的担忧。
因此，针对vero细胞残留DNA 进行严格的标准设立势在必行。
1.2 文章结构本文将首先介绍狂犬病与相关疫苗的概况，并对vero细胞及其应用进行简要介绍。
随后，文章将重点探讨DNA残留在药物中的重要性，特别着眼于vero细胞残留DNA对药物安全性的影响。
然后，我们将详述2020年版药典针对狂犬疫苗Vero细胞残留DNA标准制定过程以及标准内容概述，并阐述该标准实施所具有的重要意义。
接下来，我们将介绍当前常规检测方法并探讨新兴技术在狂犬疫苗中的应用，同时还会提及实验室实践与挑战。
最后，我们将对整篇文章进行总结，并展望未来的研究方向。
1.3 目的本文旨在全面了解2020年版药典针对狂犬疫苗Vero细胞残留DNA制定的标准，并探讨该标准的重要性和实施意义。
通过对目前常规检测方法和新兴技术的介绍，使读者对狂犬疫苗中vero细胞残留DNA检测有更深入、全面的了解，并为该领域未来科学研究提供展望。
2. 背景介绍：2.1 狂犬病与疫苗：狂犬病是一种由狂犬病毒引起的急性传染病，能够影响脊椎动物，包括人类。
这种致命的疾病主要通过受感染的动物的唾液传播给人类，通常是由于被感染动物咬伤或抓伤导致。
为了预防和控制狂犬病的传播，在过去几十年中，针对这种致命疾病的预防措施得到了显著改进。
目前，最广泛使用的是注射式人用或动物用狂犬伏特加（Vero 细胞）灭活苗。
该苗使用灭活的、培养于Vero细胞上的呈阳性衣壳RNA质粒副本（抗原）。
这种灭活苗在预防和管理潜在暴露给人类和其他动物的威胁方面发挥着关键作用。
冻干狂犬病人免疫球蛋白+冻干人用狂犬病疫苗(vero 细胞) 技术说明书
冻干狂犬病人免疫球蛋白Donggan Kuangquanbing Ren MianyiqiudanbaiHuman Rabies Immunoglobulin，Freeze-dried 本品系用人用狂犬病疫苗免疫供血浆者,采集含高效价狂犬病抗体的血浆，经低温乙醇蛋白分离法，或经批准的其他分离法分离纯化，并经病毒灭活处理制成。
含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 原料血浆2.1.1 血浆的采集和质量应符合“血液制品生产用人血浆”的规定。
采用批准的人用狂犬病疫苗和免疫程序进行免疫。
免疫后血样用酶联免疫法或蚀斑法或小鼠脑内中和试验测定抗体效价，原料血浆混合后抗体效价应不低于10 IU/ml。
2.1.2 低温冰冻的血浆保存期应不超过3年。
2.1.2 每批应由100名以上免疫供血浆者的血浆混合而成。
2.1.3 组分Ⅱ、组分Ⅱ+Ⅲ沉淀或组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀应冻存于-30℃以下，并规定其有效期。
2.2 原液2.2.1 采用低温乙醇蛋白分离法或经批准的其他分离法制备。
原液生产过程中不得加入抗生素或防腐剂。
2.2.2 经纯化、超滤、除菌过滤后即为狂犬病人免疫球蛋白原液。
2.2.3 原液检定按3.1项进行。
2.3 半成品2.3.1 配制制品中可加适宜的稳定剂。
按成品规格以注射用水或人免疫球蛋白原液稀释狂犬病抗体效价不低于100IU/ml，并适当调整pH值及钠离子浓度。
2.3.2半成品检定按3.2项进行。
2.4 成品2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装及冻干应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
分装后应及时冰冻，冻干过程制品温度不得超过35℃，真空封口。
2.4.3 规格每瓶含狂犬病抗体100IU、200IU、500IU。
狂犬病抗体效价不低于100IU/ml。
应为经批准的规格。
2.4.4 包装应符合“生物制品包装规程”规定。
SOPSC049-04冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)维持液及培养液配制标准操作规程
冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）维持液及培养液配制标准操作规程1 范围本标准适用于车间维持液及培养液的配制。
2 职责操作人员：严格按照该标准操作规程进行生产。
3 内容3.1 操作前的检查3.1.1 计量器具是否完好，性能与称量要求相符，并在检定有效期内。
3.1.2 检查水、电、气供应是否良好，纯化水及注射用水是否检验合格。
3.1.3 人员检查洁净室温度、湿度、压差是否符合要求。
3.1.4生产操作人员检查质量部门出示的尘埃粒子、沉降菌的检测报告是否符合相关规定，并在有效期内。
3.1.5 应对上一个班次的生产清场进行检查后，有QA下发的清场合格证，方可进行操作。
3.1.6检查高压灭菌柜、电子天平等设备状态标志，设备是否“完好”、“已清洁”。
3.1.7检查所需文件记录齐备，无与本批无关的指令及记录，无与本批无关的物料。
3.1.8 QA确认符合生产条件后，在批记录中签名准许生产。
3.1.9 及时填写并悬挂生产状态卡。
3.2 操作前的准备3.2.1 设备与材料的准备电子天平配液罐搅拌器pH计印度瓶量筒烧杯3.2.2 物料的准备199培养基灭能小牛血清人血白蛋白碳酸氢钠硫酸庆大霉素溶液注射用水3.3 配制过程3.3.1 维持液配制注射用水+199培养基+人血白蛋白+碳酸氢钠3.3.1.1 方法一：印度瓶配制3.3.1.1.1 将配制维持液所需的物品放在局部百级下的操作台上。
3.3.1.1.2 在火焰的保护下，用不锈钢止血钳启下原倍199培养液的瓶塞。
（10倍浓缩199培养液用灭菌的注射用水稀释成原倍199培养液）3.3.1.1.3靠近酒精灯火焰处，启下人血白蛋白的瓶塞，将人血白蛋白加入到原倍199培养液的瓶体中，摇匀。
3.3.1.1.4 靠近酒精灯火焰处。
启下7.5%碳酸氢钠溶液的瓶塞，用吸管吸取7.5%碳酸氢钠溶液加入到原倍199培养液的瓶体中，用pH计测试溶液pH值应在7.6～7.8范围内。
3.3.1.1.5在火焰的保护下，将单头分液管线安装在配制完的维持液的瓶口上，轻摇印度瓶将液体混合均匀。
狂犬疫苗生产工艺
狂犬疫苗生产工艺狂犬疫苗是一种用于预防狂犬病的疫苗，它是通过制备、培养和灭活狂犬病病毒并进行灭活制剂的制备来实现。
狂犬疫苗的生产工艺如下。
首先，需要准备狂犬病病毒株。
目前常用的狂犬病毒株有血清媒介的毒株和组织培养的毒株。
在生产中，选择某一株病毒，通过传代培养和扩增来获得病毒种子。
接下来，需要将病毒株接种到合适的细胞种子上。
常用的细胞种子包括鸟胚细胞、绵羊肾细胞和Vero细胞等。
将病毒株接种到细胞种子后，保持一定的温度、PH值和营养液条件下进行培养。
当病毒感染细胞后，需要经过一定的时间来扩增病毒的数量。
此时应定期检测细胞内是否存在有效的病毒感染。
当细胞内病毒感染达到一定水平后，需要对细胞进行破碎以释放病毒。
一般的方法有冻融法、超声波法和酶解法等。
破碎后，通过离心和过滤等方法来获得病毒液。
获得病毒液后，需要对病毒进行灭活。
常用的灭活剂有用酸亚硫酸、β-普萘酚和乙醚等。
灭活的时间和灭活剂的浓度等关键因素需要进行严格的控制，以确保病毒完全失活。
完成灭活后，病毒液需要进行精制和纯化。
常用的方法有沉淀法、硝酸盐法、硫酸铵法和超滤法等。
通过这些方法可以去除污染物和无效成分，从而得到纯净的病毒灭活制剂。
最后，将纯化的病毒灭活制剂进行配制和包装。
一般将其加入到适当的稳定剂中来延长疫苗的保质期，并使用适当的容器进行包装和密封。
以上就是狂犬疫苗的生产工艺概述。
狂犬疫苗生产工艺需要在严格的细胞培养和病毒操作条件下进行，以确保病毒的纯净性和有效性。
在生产过程中，需要严格控制各个环节的参数和操作，以确保疫苗的质量和安全性。
冻干狂犬病人免疫球蛋白+冻干人用狂犬病疫苗(vero 细胞) 技术说明书
冻干狂犬病人免疫球蛋白Donggan Kuangquanbing Ren MianyiqiudanbaiHuman Rabies Immunoglobulin，Freeze-dried 本品系用人用狂犬病疫苗免疫供血浆者,采集含高效价狂犬病抗体的血浆，经低温乙醇蛋白分离法，或经批准的其他分离法分离纯化，并经病毒灭活处理制成。
含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造2.1 原料血浆2.1.1 血浆的采集和质量应符合“血液制品生产用人血浆”的规定。
采用批准的人用狂犬病疫苗和免疫程序进行免疫。
免疫后血样用酶联免疫法或蚀斑法或小鼠脑内中和试验测定抗体效价，原料血浆混合后抗体效价应不低于10 IU/ml。
2.1.2 低温冰冻的血浆保存期应不超过3年。
2.1.2 每批应由100名以上免疫供血浆者的血浆混合而成。
2.1.3 组分Ⅱ、组分Ⅱ+Ⅲ沉淀或组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀应冻存于-30℃以下，并规定其有效期。
2.2 原液2.2.1 采用低温乙醇蛋白分离法或经批准的其他分离法制备。
原液生产过程中不得加入抗生素或防腐剂。
2.2.2 经纯化、超滤、除菌过滤后即为狂犬病人免疫球蛋白原液。
2.2.3 原液检定按3.1项进行。
2.3 半成品2.3.1 配制制品中可加适宜的稳定剂。
按成品规格以注射用水或人免疫球蛋白原液稀释狂犬病抗体效价不低于100IU/ml，并适当调整pH值及钠离子浓度。
2.3.2半成品检定按3.2项进行。
2.4 成品2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装及冻干应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
分装后应及时冰冻，冻干过程制品温度不得超过35℃，真空封口。
2.4.3 规格每瓶含狂犬病抗体100IU、200IU、500IU。
狂犬病抗体效价不低于100IU/ml。
应为经批准的规格。
2.4.4 包装应符合“生物制品包装规程”规定。
冻干人用狂犬病疫苗(Vero 细胞)
冻干人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）Donggan Renyong Kuangquanbing Yimiao(Vero Xibao) Rabies Vaccine for Human Use（Vero cell）， Freeze-dried本品系用狂犬病病毒固定毒接种于Vero细胞，经培养、收获、浓缩、灭活病毒、纯化后，加入适宜稳定剂冻干后制成，用于预防狂犬病。
1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2 制造2.1 生产用细胞生产用细胞为Vero细胞。
2.1.1细胞管理及检定应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
各种子批代次应不超过批准的限定代次。
取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。
2.1.2 细胞制备取工作细胞库中的1支或几支细胞管，细胞复苏、扩增至接种病毒的细胞为一批。
将复苏后的单层细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，分散成均匀的细胞，加入适宜的培养液混合均匀，置37℃培养成均匀单层细胞。
2.2毒种2.2.1名称及来源生产用毒种为狂犬病病毒固定毒CTN-1V、aGV株或其他经Vero细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。
2.2.2种子批的建立应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。
各种子批传代应不超过批准的限定代次。
狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在Vero细胞上传代，至工作种子批传代次数应不超过35代，aGV株在Vero细胞上传代，至工作种子批传代次数应不超过15代。
2.2.3种子批的检定主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.4项检定。
2.2.3.1鉴别试验用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。
将毒种作10倍系列稀释，取适宜稀释度病毒液与等量抗狂犬病病毒特异性免疫血清混合，同时设立正常血清对照组，试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只，每只脑内接种0.03ml，观察14天，中和指数应不低于500。
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目的：制定和规范Vero细胞制备的程序，保证生产用细胞质量。
范围：人用狂犬病疫苗生产用细胞的制备。
责任：细胞组全体人员对本规程实施负责。
程序：1．材料名称规格1.1MEM 6L/瓶400ml/瓶1.2精制小牛血清400ml/瓶1.33%谷氨酰胺100ml/瓶50ml/瓶1.4庆大霉素溶液（1万单位/ml）200ml/瓶50ml/瓶1.57.5%碳酸氢钠溶液400ml/瓶50ml/瓶1.60.02%EDTA溶液400ml/瓶1.775%乙醇溶液1.83%甲酚皂溶液1.90.1%新洁尔灭溶液1.100.85%生理盐水溶液1.11注射用水（本室自制）1.12二甲基亚砜以上液体配制方法各自液体配制标准操作程序编号：2．设备2.1转瓶机45瓶/台2.24℃冰箱1台2.3-20℃组合式冰库1个2.437℃孵箱1台2.537℃恒温室2.6不锈钢止血钳子规格：20cm 16cm 2.7液氮罐2.8不锈钢工作台2.9不锈钢边台2.10不锈钢双层车2.11喷灯及管道2.12不锈钢盒子大小2.13倒置显微镜1台2.14乙醇罐2.15大不锈钢盒2.16小不锈钢盒2.17栓盒2.18安瓶封口器2.19不锈钢单层车3．器具3.1吸管 1 ml 2ml 5ml 10ml 3.2吸耳球1ml 10ml3.3250ml 瓶3.4500ml 瓶3.5100ml 瓶3.6方瓶、大方瓶3.73L瓶3.810L瓶3.9安瓶3.10分液管道3.11中试管架3.12青瓶10ml 3.13废液缸3.16方瓶不锈钢盒4．辅助材料4.1灭菌纱布4.2硫酸纸4.3绳4.6无毛布4.7胶布4.8剪刀4.9裁纸刀4.10封口膜4.11砂锯片4.12二连管（球）4.13记号笔4.14方瓶架4.15高压灭菌指示卡4.16镊子4.17脱脂棉4.18细胞计数板5．操作步骤5.1生物反应器用细胞的制备（以制备900ml细胞悬液为例）5.1.1细胞的复苏5.1.1.1物品准备5.1.1.1.14号栓、翻帽栓的准备从干燥室取出20个4号栓，装入铺好无毛布的饭盒内，从干燥室取出20个翻帽栓，装入铺好无毛布的饭盒内放入高压灭菌指示卡，盖好无毛布及盒盖，绑好。
使用前121℃60分钟高压灭菌处理。
5.1.1.1.21ml、5ml、10ml吸管的准备从干燥室取出1ml吸管放入吸管筒，准备1筒；将5ml吸管放入吸管筒，准备2筒；将10ml吸管放入吸管筒，准备2筒。
使用前180℃2小时干热灭菌处理。
5.1.1.1.3250ml盐水瓶、500ml盐水瓶、大方瓶的准备取洁净干燥的10个250ml盐水瓶、10个500ml盐水瓶、10个大方瓶，用2层硫酸纸包住瓶口，用绳绑紧，放入铺好硫酸纸的不锈钢盒内，盖上硫酸纸及盒盖，绑好。
使用前180℃2小时干热灭菌处理。
5.1.1.1.4细胞：为V134代细胞，数量1支由2人复核检查其名称，批号，代次，日期，检查合格后填写相关的领用记录方可使用。
5.1.1.2工作环境5.1.1.2.1仪器、设备运行，物品准备情况、灭菌指示卡、生产区状态都符合规定.5.1.1.2.2操作人员按《进出洁净区标准操作规程》进入万级洁净区，打开层流罩，净化30分钟。
5.1.1.3复苏液的配制配方：MEM+20%小牛血清+1%谷氨酰胺+1%庆大霉素溶液+2.5%NaHCO3配制方法：取已干热灭菌过的10ml吸管一筒，在百级操作台上将吸管筒的筒盖取下，取出10ml吸球在火上烧一下，套在10ml吸管头上，取已灭菌的250ml空瓶一个，以无菌方法将瓶口打开，将瓶口倾斜30度角放在以准备好的配液架上，然后取MEM 400ml一瓶，打开翻帽栓的外帽，将瓶口在火焰上转圈烧一下，取下翻帽栓弃入不锈钢桶中，再烧一下瓶口，一手把住MEM瓶的瓶底，瓶签朝上，瓶身倾斜30度角，另一只手拿出套有吸球的10ml吸管，注意管身不能碰到任何暴露在外的物品，在火焰的保护下以无菌操作方法吸取MEM75.5ml加入到配液架上的250ml空瓶中，然后用同样的无菌操作方法分别吸取小牛血清20ml、谷氨酰胺1ml、庆大霉素溶液1ml、NaHCO3 溶液2.5ml加入到装有75.5ml MEM瓶中，配制成100ml细胞维持液，取出饭盒内的翻帽栓，注意不能碰到翻帽栓的下部，将装有配制好的细胞生长液瓶的瓶口盖好，摇匀、备用。
5.1.1.4复苏细胞的操作步骤首先用搪瓷杯准备38℃-40℃水，然后在冰库液氮罐中取出要复苏的细胞，取细胞时需认真核对标签信息，立即放入38℃-40℃水中速溶（细胞必须在1-2分钟内完全溶解）从水中取出安瓶，用75%乙醇消毒表面，取出5ml、10ml吸管各一筒在百级工作台上，将吸管筒盖打开，取出吸球在火上烧一下，套在吸管上，取出装有翻帽栓的饭盒打开，在火焰上烧一下瓶口，放在液体架上，再取出干热灭菌的大方瓶1个，放在液体架上.用10ml 吸管向大方瓶中加入50ml液体，然后用翻帽栓将剩余液体盖好，留做换液用，用砂锯片在安瓶颈部划一下，并从划痕处掰开安瓶，用5ml吸管吸出全部细胞悬液，慢慢加入大方瓶中，同时取上清做检定，然后将大方瓶在火焰封闭下盖上栓，拧紧、摇匀。
在大方瓶上写上代次，日期，及冻存细胞的批号，将大方瓶放置在37℃恒温室静止培养过夜。
5.1.1.5清场5.1.1.5.1用过的生产用具按《进出洁净区物料管理规程》移出操作室。
5.1.1.5.2生产废弃物按《进出洁净区物料管理规程》进行。
5.1.1.5.3洁净区清洁按《洁净区卫生清洁标准操作规程》进行清洁。
5.1.1.5.4穿过的无菌服处理干净后，灭菌备用。
5.1.1.5.5填写清场记录，悬挂状态标识。
5.1.1.6复苏细胞换液5.1.1.6.1工作环境5.1.1.6.1.1仪器、设备运行，物品准备情况、灭菌指示卡、生产区状态都符合规定。
5.1.1.6.1.2操作人员按《进入洁净区标准操作规程》进入万级洁净区，打开层流罩，净化30分钟。
5.1.1.6操作步骤复苏细胞静止培养次日后，从恒温室中取出，观察细胞有无污染，并镜下观察细胞生长情况，然后拿进操作室，用火焰消毒方瓶口，再在火焰保护下开栓，将大方瓶中液体倒入搪瓷杯中，并将大方瓶放于液体架上，将5.1.1.3中配制的细胞复苏液打开，用10ml 吸管向大方瓶中加入50ml液体，火焰保护下用止血钳盖上栓，拧紧，置37℃恒温室静止培养至长满单层。
5.1.1.7清场同5.1.1.55.1.2大方瓶传大方瓶5.1.2.1物品准备5.1.2.1.14号栓、翻帽栓的准备同5.1.1.1.1。
5.1.2.1.21ml、5ml、10ml吸管的准备同5.1.1.1.2。
5.1.2.1.3250ml盐水瓶、500ml盐水瓶、大方瓶的准备同5.1.1.1.35.1.2.2工作环境5.1.2.2.1仪器、设备运行，物品准备情况、灭菌指示卡、生产区状态都符合规定。
5.1.2.2.2操作人员按《进出洁净区标准操作规程》进入万级洁净区，打开层流罩，净化30分钟。
5.1.2.3细胞消化液的配制配方：0.02%EDTA液+2.5%NaHCO3取已干热灭菌的10ml吸管一筒，在百级操作台上将吸管筒的筒盖取下，取出10ml 吸管球在火上烧一下，套在10ml吸管头上，.取以灭菌的250ml空瓶一个，将瓶口打开，将瓶口倾斜30度角放在配液架上，然后取EDTA400ml一瓶，打开翻帽栓的外帽将瓶口在火焰上转圈烧一下，取下翻帽栓弃入不锈钢桶中，再烧一下瓶口，然后一只手把住EDTA 的瓶底，瓶签朝上，瓶身倾斜30度角，另一只手拿出套有吸球的10ml吸管，注意管身不能碰到任何暴露在外的物品，在火焰的保护下吸取EDTA19.5ml，加入到配液架上的250ml 空瓶中，然后以同样的方法吸取NaHCO3 0.5ml加入到装有19.5ml EDTA瓶中，配制成20ml 消化液一瓶。
取出饭盒内的翻帽栓，注意不能碰到翻帽栓的下部，将NaHCO3瓶口盖好，然后以同样的方法将装有20ml消化液瓶瓶口盖好，摇匀备用。
5.1.2.4细胞生长液的配制配方：MEM+10%小牛血清+1%谷氨酰胺+1%庆大霉素溶液+2.5%NaHCO3配制方法：取已干热灭菌过的10ml吸管一筒，在百级操作台上将吸管筒的筒盖取下，取出10ml吸球在火上烧一下，套在10ml吸管头上，取已灭菌的250ml空瓶一个，以无菌方法将瓶口打开，将瓶口倾斜30度角放在以准备好的配液架上，然后取MEM 400ml一瓶，打开翻帽栓的外帽，将瓶口在火焰上转圈烧一下，取下翻帽栓弃入不锈钢桶中，再烧一下瓶口，一手把住MEM瓶的瓶底，瓶签朝上，瓶身倾斜30度角，另一只手拿出套有吸球的10ml吸管，注意管身不能碰到任何暴露在外的物品，在火焰的保护下以无菌操作方法吸取MEM128.25ml加入到配液架上的250ml空瓶中，然后用同样的无菌操作方法分别吸取小牛血清15ml、谷氨酰胺1.5ml、庆卡霉素溶液1.5ml、NaHCO3 溶液3.75ml加入到装有128.25ml MEM瓶中，配制成150ml细胞生长液，取出饭盒内的翻帽栓，注意不能碰到翻帽栓的下部，将装有配制好的细胞生长液瓶的瓶口盖好，摇匀、备用。
5.1.2.5细胞消化方法取5.1.1.6的3到4日后镜下观察长成单层的细胞，在火焰的保护下，用止血钳打开瓶口，将栓弃入废液缸内，然后将液体以顺畅的方式全部倒入废液缸内，液体控净后，在火焰上烧一下瓶口，放在液体架上，将5.1.3.3配制好的消化液，打开瓶口，用10ml吸管向细胞瓶内加20ml消化液，将止血钳用火烧一下，用其夹起4号栓上半部，另一只手拿起细胞瓶在火焰保护下将4号栓塞入瓶口，拧紧，然后再在火焰上烧一下瓶口处，将细胞瓶细胞面朝下放在工作台上，细胞瓶要平放，以使消化液能够完全覆盖细胞面，当观察到细胞面呈毛玻璃样或轻微裂纹时，在火焰的保护下倒掉消化液并盖上胶栓放在液体架上。
将5.1.3.4项配制好的150ml生长液，用10ml吸管向已消化好的细胞瓶中加入20ml生长液进行吹打使细胞分散均匀，使之成为细胞悬液。
并在火焰的保护下，将分散好的细胞悬液加人配制好的生长液中，盖栓摇匀。
按1：3的分种率分种至3个大方瓶中，每瓶加50ml 细胞悬液，分装时边分边摇细胞悬液瓶。
置37℃恒温室静止培养。
5.1.3大方瓶传3L瓶5.1.3.1物品准备5.1.3.1.14号栓20个、翻帽栓20个、7号栓20个的准备同5.1.1.1.1。
5.1.3.1.21ml、5ml、10ml吸管的准备同5.1.1.1.2。
5.1.3.1.3250ml盐水瓶、500ml盐水瓶、3L瓶的准备同5.1.1.1.3。
5.1.3.2工作环境5.1.3.2.1仪器、设备运行，物品准备情况、灭菌指示卡、生产区状态都符合规定。