提取金荞麦愈伤组织总RNA的一种有效方法

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℃ 1 min，然后经历 22 个循环: 95 ℃ 15 s，68 ℃ 6 min。循环结束后至 4 ℃ 。取 5 μL LD-PCR 产物， 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳检测。 3 结果与分析 3. 1 RNA 质量的凝胶电泳及分光光度检测 以金 荞麦愈伤组织为试材，提取总 RNA，用 0. 8% 的非 变性琼脂糖凝胶电泳检测，可见从 4 种金荞麦愈伤 组织 提 取 的 总 RNA 的 28S rRNA 亮 度 约 为 18S rRNA 的 1. 5 ～ 2. 0 倍，说明提取过程中没有降解现 象发 生 ( 图 1 ) ，紫 外 分 光 光 度 检 测 A260 / A280 在 1. 9 ～ 2. 0，说明 RNA 纯度较高。
［稿件编号］ 20100802002 ［基金项目］ 农业部野生植物保护项目( 2130135) ; 重庆市自然科 学基金项目( CSTC 2005881154) ; 西南大学研究生科技创新基金项 目( kb2009016) ［通信作者］ * 李名扬，教授，博士生导师，主要研究方向为植物生 物技术，Tel: ( 023 ) 68250086，Fax: ( 023 ) 68251250，E-mail: limy @ swu. edu. cn
图 2 金荞麦红色愈伤 RNA 反转录为 cDNA 电泳
第 36 卷第 6 期 2011 年 3 月
Vol. 36，Issue 6 March，2011
3. 3 其他方法提取的效果 作者在大量的前期工 作中使用其他多种常规方法提取金荞麦愈伤组织 RNA，不同方法提取金荞麦红色愈伤组织总 RNA 的 电泳图对比( 图 3) ，结果表明如异硫氰酸胍法、冷酚 法、热酚法等均无法得到较高纯度的金荞麦愈伤组 织 RNA 或降解严重，甚至根本得不到 RNA，实验中 常用的多种 RNA 提取试剂盒，也无法对金荞麦愈伤 组织进行有效提取。而在提取总 RNA 时最常被报 道使用的 Trizol 试剂在金荞麦愈伤组织 RNA 提取 中也表现不佳，这主要是由于植物组织富含多糖、多 酚，经过细胞培养后，糖类和酚类化合物剧增［8］，特 别是金荞麦愈伤组织中的多糖多酚含量比其他的植 物组织更高。而多糖的许多理化性质与 RNA 相似， 很难将它们分开，在沉淀 RNA 时很容易产生多糖的 胶状沉 淀，难 溶 于 水。同 时 多 糖 会 抑 制 许 多 酶 活 性［9］。金荞麦还富含一些其他次生代谢产物，尤其 富含“原花色素类”化合物，该化合物是一类易氧化 的酚类物 质，氧 化 后 与 RNA 不 可 逆 的 结 合，影 响 RNA 的分离纯化［10-11］。这些都严重干扰了金荞麦 愈伤组织总 RNA 的有效提取。
图 1 金荞麦愈伤组织总 RNA 电泳
3. 2 RNA 的反转录质量 RNA 的反转录质量是检 测 RNA 质量的重要指标之一，作者将获得的 RNA 进行反转录，并用 PCR 技术检测其反转录质量，结 果表明，RNA 可以被成功反转录，并且反转录的 cDNA 呈现弥散条带，长度范围较广( cDNA 的大小主 要分布在 500 bp ～ 5 kb) ，说明 RNA 纯度高要求。
［关键词］ 金荞麦; 愈伤组织; 总 RNA 提取
金荞麦 Fagopyrum cymosum ( Trev. ) Meisn 是蓼 科 Polygonaceae 荞麦属多年生草本植物，是一种营 养丰富并具有重要药用价值的资源植物。作为我国 重要的传统中药材，金荞麦的块根活性提取物( 主 要为类黄酮次生代谢产物) 具有显著的抗癌、抑制 肿瘤细胞侵袭和转移，以及消炎抗菌等重要作用，是 多种重要的抗癌药物和癌预防药物( 如复方金荞麦 颗粒、金荞麦片、和威麦宁胶囊等 ) 的主要成分之 一［1-3］。
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提取金荞麦愈伤组织总 R李名扬1*
( 1. 西南大学 园艺园林学院，重庆市花卉工程技术研究中心， 南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715; 2. 湖州市农业科学研究院，浙江 湖州 313000)
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酯 ( DEPC) 为 Sigma 产品。琼脂糖为 Promega 公司 产品。 2 方法 2. 1 金荞麦愈伤组织总 RNA 的提取 采用 CTAB 法结合 LiCl 沉淀的方法，在 5 mL RNA 抽提 buffer 加入 2% 终体积的 β-巯基乙醇后，65 ℃ 温育 15 min。 取 0. 65 g 愈伤组织放入盛有温育后的 RNA 抽 提 buffer 的研钵中，迅速研磨( 不加液氮) 。转移至 10 mL 离心管中振荡，65 ℃ 温育 10 min。加入等体积 氯仿-异戊醇抽提 2 次( 离心 10 000 r·min － 1 ，4 ℃ ， 10 min) ( 抽提时在冰上静置 10 min) 。取上清于一 新的 10 mL 离心管中，加入 1 /4 体积 10 mol ·L － 1 LiCl 混匀，4 ℃ 过夜。离心( 10 000 r·min － 1 ，4 ℃ ， 20 min) ，弃上清，将沉淀溶于 500 mL 的 RNase-free 的水中，并转移至 1. 5 mL 离心管。加入等体积酸酚 ( pH 4. 2) -氯仿-异戊醇( 25∶ 24∶ 1) 抽提 2 次( 离心 10 000 r· min －1 ，4 ℃ ，10 min) ( 抽 提 时 室 温 静 置 5 min) 。取上清于一个 1. 5 mL 离心管中。加 2 倍体积 无水乙醇，－ 70 ℃ 沉淀 30 min。10 000 r·min －1 ，4 ℃ ，离心 15 min 弃上清。加入 70% 乙醇漂洗 1 次。 吹干乙醇后，加入 100 mL 的 H2 O( DEPC) ，充分溶解。 2. 2 总 RNA 质量检测 提取的总 RNA 纯度用紫 外分光光度检测，完整性用 0. 8% 非变性琼脂糖凝 胶电泳检测，质量合格的总 RNA － 70 ℃ 保存。 2. 3 RNA 的反转录和 RT-PCR 分析 将 获 得 的 RNA 用 DNaseI ( RNA free) 消化，去除 DNA 污染， 然后进行反转录与 PCR。具体步骤参照 cDNA 一链 合成试剂盒 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit( MBI，K1622) 使用手册进行。第 1 链的合成，在 PCR 反应管中顺次加入 2 μL 总 RNA，1 μL SMARTIV Oligomucleotide，1 μL，CDS III /3’PCR Primer，1 μL DEPC-H2 O，混匀，稍离心，然后于 72 ℃ 保温 2 min，冰浴 2 min 后加入: 2 μL 5 × First-Strand Buffer，1 μL DTT ( 20 mmol·L － 1 ) ，1 μL dNTP Mix ( 10 mmol· L － 1 each) ，1 μL PowerScript Reverse Transcriptase，抽吸混匀，稍离心，于 42 ℃ 下反应 90 min ( PCR 仪中进行) ，冰上终止第 1 链合成。取第 1 链 产物 7 μL 依 次 加 入 75 μL Dionized H2 O，10 μL 10 × Advantage 2 PCR Buffer，2 μL 50 × dNTP Mix，2 μL 5'PCR Primer，2 μL CDSⅢ /3'PCR Primer，2 μL 50 × Advantage 2 Polymerase Mix，置于 PCR 仪上，采 用长距离 PCR 技术扩增双链cDNA。反应条件为 95
·L － 1 的 NaAc，简化了配制提取试剂的程序，排除了 NaAc 溶液引入 RNA 酶的可能性，减少了 RNA 降解 机率，达到了良好的效果。
图 3 不同方法提取金荞麦红色愈伤总 RNA 电泳
4 讨论 本实验方法的最大特点就是将材料直接加入到
RNA 抽提液中进行研磨。这样做有 2 个优点。首 先，从培养皿中取出的新鲜愈伤组织含有大量的水 分，如果直接加液氮研磨会很快结冰，影响研磨的效 果，甚 至 无 法 研 磨。 其 次，就 是 将 材 料 直 接 加 入 到 RNA 抽提液中，减少材料在空气中暴露的时间，从 而最大限度地减少 RNA 被降解和酚类被氧化的可 能性。另外在用乙醇沉淀 RNA 时，没有加入 3 mol
蛋白质合成的角度对金荞麦不同愈伤组织类黄酮含 量差异形成的原因进行探索，以期为进一步的悬浮 培养提供指导，因此首先需要获得高质量的 RNA。 目前尚未见有关于金荞麦愈伤组织 RNA 提取的报 道，作者试用多种方法提取金荞麦愈伤组织 RNA 效 果不理想。而本实验采用的 CTAB 法结合 LiCl 沉 淀的改良方法从金荞麦愈伤组织提取的 RNA 可以 满足多种分子生物学研究的需要，为进一步的研究 提供了快速、高效、高质量的 RNA 提取方法，也为同 类研究提供了参考。 1 材料
［摘要］ 目的: 建立金荞麦愈伤组织总 RNA 提取方法。方法: 采用 CTAB 法结合 LiCl 沉淀的改良方法提取 RNA，紫外分 光光度检测、0. 8% 非变性琼脂糖凝胶电泳检测、RNA 的反转录等评价 RNA 质量。结果: 提取的总 RNA 28S 和 18S 条带清晰， 且 A260 / A280 在 1. 9 ～ 2. 0，以提取的 RNA 为模板反转录的 cDNA 长度范围较广( 500 bp ～ 5 kb) 。结论: 该方法提取出的总 RNA 质量能满足 RT-PCR 等分子生物学操作的要求，且简单、有效、经济，可用于金荞麦愈伤组织总 RNA 的提取。
本实验室 诱 导 筛 选 的 金 荞 麦 白 色、浅 黄 色、褐 色、红色愈伤组织系。
RNA 提取所有塑料器具，如 1. 5，0. 2 mL 离心 管，1，0. 2，0. 01 mL 吸头等用 0. 1% DEPC 超纯水浸 泡过夜，121 ℃ 湿热灭菌 15 min，弃去液体，放入 37 ℃ 烘箱中干燥备用。研钵和杵子及其他玻璃用具用 洗涤剂清洗干净，蒸馏水冲洗，晾干后在 180 ℃ 烘箱 中烘烤过夜备用。RNA 抽提缓冲液配方如下: 2% CTAB，2% PVP，100 mmol · L － 1 Tris-HCl ( pH 8. 0) ，25 mmol·L － 1 sodium-EDTA ( pH 8. 0) ，2. 0 mmol·L － 1 NaCl 混匀灭菌。用前加入终体积为 2% 的 β-巯 基 乙 醇。氯 仿-异 戊 醇 ( 24 ∶ 1 ) ; 酸 酚 ( pH 4. 2) ; 10 mol·L － 1 LiCl; 无水乙醇。以上试剂均为 分析纯，购自上海生工生物合成公司。cDNA 一链 合成试剂盒 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit ( MBI，K1622) 购自深圳晶美公司，焦炭酸二乙