大豆未成熟种子子叶节不定芽再生的初步研究
大豆叶发育的研究进展
大豆叶发育的研究进展作者：周彦辰杨学珍来源：《种子科技》2021年第18期摘要：近20年来，我国大豆需求量不断攀升、进口额持续扩大，成为对外依存度最高的农产品之一。
叶片形态作为大豆重要外观特征和农艺性状，既影响日光捕获效率，又影响“氮”库的吸收效率，可调节产量。
因此，对叶发育过程和激素、环境影响因素进行总结，有助于解析大豆叶片调控网络，对加速基于理想株型的育种选择进程、提高大豆单产具有重大意义。
关键词：大豆;叶片发育;激素;环境影响文章编号：1005-2690（2021）18-0013-02 中国图书分类号：S565 文献标志码：B1 概述大豆（Glycine max（L.）Merr.）起源于我国，是四大粮食作物之一，对中华民族的繁衍生息和东方饮食文化的形成发挥了不可替代的作用[1]。
大豆本身蛋白质和脂肪含量丰富，可通过土壤微生物固定氮，也是豆科植物研究的模范植物。
在当今世界，大豆是粮、油、饲、蔬菜兼用的重要农作物，种植面积仅次于小麦、水稻和玉米等經济粮食作物，而贸易额则高居各种农产品之首。
大豆叶片正常均为三出复叶，叶片形状对阳光穿透力、光照吸收、CO2固定和光合效率有直接影响，进而影响作物产量和品质特性[2]。
通过对叶发育过程及影响叶发育的内部环境因素进行综述，为构建叶发育调控网络打下良好基础，对大豆株型改良有重要意义。
2 叶发育过程大豆是典型的双子叶植物，其叶片形态发育共分为4个阶段。
首先，以茎尖分生组织（SAM）的外周区域（PZ）起始发育成叶原基[3]。
其次，在叶片原基的萌发之后，以维体轴极性为基础发生远端生长，并建立近轴-轴和近轴-远端轴。
再次，叶片沿中-外轴（始于边缘附近）生长，将叶片与叶柄区分开，主要分化成叶柄、叶片和托叶等各个组织。
最后，随着边缘分生组织发育停止，整个叶片开始细胞增殖和向外扩张，致使远端和侧部叶片整体扩张。
在部分双子叶植物中，叶片附着在茎上的连接为叶柄。
如拟南芥，在叶基附近产生托叶，保护正在发育的幼叶，并在叶片发育早期作为植物激素生长素的来源。
大豆愈伤组织诱导及再分化的影响因素探索
化,因此不同植物 对 光 照 强 度 也 有 不 同 要 求。 大 豆 在
体细胞胚胎发生诱 导 过 程 中 对 光 照 的 要 求 不 太 严 格,
可以是黑暗,也可 以 采 用 12~24h 光 照,光 照 强 度 的
[ ]
变化范围也较宽,在 50~6000l
另外,取材季节、外植体的大小与灭菌效果及存活率存
基中的生长素和细胞 分 裂 素 的 相 对 浓 度 有 关,当 生 长
在一定关联,在合适时间如生长旺季取样,试验材料的
素/细胞分裂素比值 高 时,促 进 根 的 分 化;比 值 低 时 则
消毒效果、成活率、诱导率及增殖率往往比在生长末期
促进芽的分化;而当 两 者 平 衡 时 则 会 一 直 处 于 愈 伤 组
分以及激素种类配比 选 取 不 同,大 豆 愈 伤 组 织 的 诱 导
导分化的成功率高,有 的 部 位 极 难 脱 分 化 或 再 分 化 率
以及再生也会相应呈现不同的效果。培养条件对大豆
组织培养的作用也 不 容 忽 视。 因 此,深 入 探 索 大 豆 组
很低。雷 海 英 等 [3]以 晋 豆 19 号 为 材 料,选 取 子 叶 节、
因
刘思言等 [9]以吉农 28、吉农 27、吉农 17 三个基因型大
2.
1 培养基的影响
2.
1.
1 培养基营养组分的影响
豆子叶节作为外植体进行植株再生的研究,结果表明,
培养基 是 外 植 体 赖 以 生 存 的 基 质。 培 养 基 的 种
类、营养组分以及培 养 基 的 状 态 等 也 关 系 着 组 织 培 养
关键。
导效果依次递减,说 明 胚 轴 是 比 较 适 合 的 外 植 体。 再
农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究
V ol 131,N o 12pp 1170-176 Feb 1,2005作 物 学 报ACT A AG RONOMICA SI NICA第31卷第2期2005年2月 170～176页农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究李桂兰1,2 乔亚科1 杨少辉2 靳朝霞2 李明刚2(1河北科技师范学院,河北昌黎066600;2南开大学分子生物学研究所,天津300071)摘 要:直接以农杆菌转化系统为平台,以栽培大豆(G lycine max L 1)吉林35、中黄28、南农、铁丰29、铁丰30和开育12的子叶节为外植体,用LBA4404农杆菌(含pPC 2K S A 质粒)研究了影响大豆子叶节转化的因素。
结果表明,大豆品种之间转化存在着差异,吉林35转化率最高,平均转化率为2116%,单次最高转化率达6112%;中黄28次之,平均转化率为119%,单次最高转化率达3133%;南农转化率为1105%;铁丰29居第4位,转化率为0195%;铁丰30和开育12无转化植株。
用4d 苗龄的子叶节,农杆菌浸染30min ,共培养3d 比较合适。
萌发培养基和不定芽诱导培养基对转化率的影响存在交互作用,对于吉林35来说,大豆萌发培养基(G )和不定芽诱导培养基(Y )的最佳组配方式为G 2+Y 1(转化率6112%)和G 1+Y 2组合(转化率5126%)。
农杆菌介导的转化系统中,转化植株的筛选方式对转化率影响很大,筛选培养初期,采用比较低的筛选浓度,在继代培养过程中逐次提高筛选压力,可以获得较好的转化效果。
关键词:大豆;根癌农杆菌;子叶节;转化中图分类号:S565,Q78Study of the Agrobacterium 2mediated T ransformation Systems of Soybean Cotyle 2donary N odeLI G ui 2Lan 1,2,QIAO Y a 2K e 1,Y ANG Shao 2Hui 2,J IN Zhao 2X ia 2,LI M ing 2G ang 2(1H ebei Normal Univer sity o f Science &Technology ,Changli 066600,H ebei ;2Institute o f Molecular Biology ,Nankai Univer sity ,Tianjin 300071,China )Abstract :Suitable soybean genetic trans formation system has not been established by now 1The factors in fluencingAgrobacterium 2mediated soybean cotyledonary node trans formation were studied in this research so as to im prove the trans 2formation frequency of soybean 1The results showed that the trans formation frequency was different am ong cultivars of soy 2bean 1Jilin 35was the highest in trans formation rate ,Zhonghuang 28was the second and followed by Nannong and T iefeng 29,and there was no trans formed plant in T iefeng 30and K aiyu 121The average and the highest trans formation rate were 2116%and 6112%for Jilin 35,and 119%and 3133%for Zhonghuang 28,respectively (T able 1)1The suitable seedling age was about 4days 2old (Fig 15)and the appropriate duration of in fection and co 2culture with Agrobacterium were about 30m inutes and 3days respectively (Fig 14)1There was an interaction between the germ ination medium and shoots regenera 2tion medium for trans formation frequency 1The better combination pattern of germ ination medium and shoots regeneration medium were G 2+Y 1(trans formation rate was 6112%)and G 1+Y 2(trans formation rate was 5126%)in this research (Fig 16)1The screening method had a significant effect on increasing the trans formation frequency of the Agrobacterium 2me 2diated trans formation system (T able 2)1K anamycin was used as a screening agent in this study 1H igher trans formation rate was obtained by using the screening m odel S1which the kanamycin concentration increased gradually from 60mg ΠL to 100mg ΠL when subculture in the shoots regeneration stage 1It was suggested that the lower concentration of screening agent should be used in the earlier screening stage ,then the higher concentrations increased gradually in the later stages 1K ey w ords :S oybean ;Agrobacterium tumef aciens ;C otyledonary node ;T rans formation 早在1984年,Deblock 和H orsch 就进行了大豆转基因研究[1],1988年Hinchee 首先以农杆菌介导法获得大豆转基因植株[2],现在抗除草剂转基因大豆虽然已经商品化,但大豆转化的频率仍很低,重复基金项目:河北省自然科学基金(301295);国家863资助(2002AA213061);河北省科技攻关项目;河北科技师范学院博士基金。
大豆胚芽尖再生体系的建立及转基因初步研究
大豆胚芽尖再生体系的建立及转基因初步研究摘要：建立了吉林小粒1号的胚芽尖再生体系，对胚芽尖､子叶节､胚轴作为外植体的重生芽发生频率及主要影响因素进行了比较｡结果表明，胚芽尖重生芽发生频率高，再生时间短，对卡那霉素敏感，合适的筛选浓度为100 mg·L－1｡以吉林小粒1号胚芽尖为外植体，将植物表达载体w10通过农杆菌(LBA4404)导入吉林小粒1号，在农杆菌中孵育6 h，筛选培养基上重生芽发生频率高，成功获得了再生植株｡关键词：大豆组培；胚芽尖；子叶节；胚轴A Pilot Study of An Soybeans Embryonic Tip Regeneration SystemAbstract：In order to improve the quality of Jilinxiao No．1，the embryonic tip regeneration system was set up according to the method of Wei－Zhi－ming．The differences of the multiple shoot frequency amang embryonic tip，cotyledonary node and hypocotyl segment was compared with statistic analytical method．The result indicatd that embryonic tip had the highest frequency multiple shoot and the shortest time to get it．The embryonic tip was sensitive to kanamycin and the suitable concentration was 100 mg·L－1．The high frequency multiple shoot could be gained when the embryonic tip was incubated in LBA4404 for 6 h．The regeneration plants of Jilinxiaoli1 transformed the w10 with the embryonic tip by LBA4404 were obtained．Key words：soybean tissue culture；embryonic tip；cotyledonary node；hypocotyl segment建立一个良好的组培再生系统，是大豆遗传转化成功的前提｡目前研究再生频率比较高的再生体系有子叶节､胚轴和胚芽尖[1，2]｡由于子叶节具有取材不受季节限制､诱导再生快､转化突变率低等优点，得到了广泛的应用｡Zhou等[3－8]用子叶节为受体分别将几丁质酶基因､Bt基因､玉米转座子Ac基因，SMV－CP基因等转入Peking等大豆品种中｡但也存在再生频率低､受基因型限制､转化株的嵌合体等问题｡胚轴作为外植体，是目前研究应用较多的农杆菌转化受体，有许多成功的转化事例｡早在1983年陈云昭等就以大豆上胚轴和下胚轴为外植体培养出再生植株[9]｡徐香玲等[4，5]和苏彦等[7]分别将Bt基因，SMV－CP基因､几丁质酶基因通过农杆菌介导法以胚轴为受体转入吉林29和中黄4号等品种中，但其仍然存在诱导再生植株频率低､重复性差､转化效率低等缺点｡胚芽尖作为大豆组培外植体是由Liu等[10]2004年首次研究报道的｡Liu等[10]用大豆胚芽尖､胚轴､子叶节分别作为外植体进行GUS基因的遗传转化｡发现胚芽尖的重生芽发生效率达到87．7%，而子叶节和胚轴分别为40．3%和56．4%｡并且胚芽尖利用农杆菌转化系统可以得到15%的转化效率，是一个新的具有高转化效率的再生体系[10]｡目前还没有其他关于胚芽尖再生系统的报道，也没有关于大豆品种吉林小粒1号组培体系的报道｡为了利用转基因技术有效地提高吉林小粒1号的品质性状，本研究选用大豆品种吉林小粒1号为试验材料建立胚芽尖再生体系，并对以上3种再生体系在各种影响因素下的重生芽发生频率进行了比较，期望为吉林小粒1号品质性状的改良提供转化平台，并对大豆的遗传转化效率的提高提供新的依据｡1材料与方法1．1试验材料大豆品种吉林小粒1号(由国家种质资源中心提供)｡1．2外植体的准备在超净台中先用75%的酒精处理1~2 min，然后用次氯酸钠(80%无菌水+20%次氯酸钠)消毒40 min，无菌水冲洗4~6次，再用无菌水浸泡3 h后，把水倒掉，放在滤纸上吸干｡胚芽尖：将消毒好的种子放在MSB5(表1)培养基中暗培养 2 d，转到MSB5(0．2 mg·L－1 6－BA，0．2 mg·L－1 IBA)培养基中培养5~10 d｡取上述无菌苗，切除子叶和第1片叶子，得到暴露的胚芽尖分生组织，作为外植体备用｡子叶节：将消毒好的种子，放在1/2MSB5(1 mg·L－1 BAP和100 μmol·L－1乙酰丁香酮)培养基上培养5 d后，沿水平方向将子叶下的胚轴切开(大约离子叶下3~5 mm)备用｡胚轴：种子灭菌后，放到MSB5(1．0 mg·L－1 BAP)培养基上培养1 d，将上胚轴(大约1 cm长)从种子上切离下来备用｡1．33种外植体重生芽频率比较由于再生频率是大豆遗传转化体系重要因素｡因此，我们对大豆吉林小粒1号，分别利用胚芽尖､子叶节､胚轴3种再生体系进行再生，每种外植体取样100，分装15皿｡统计长有3个或以上重生芽的愈伤数量，与总的愈伤数量比较，计算重生芽频率，取3次重复平均值｡1．43种外植体重生芽发生时间比较我们对大豆吉林小粒1号胚芽尖､子叶节､胚轴3种转化体系进行了再生时间的比较，每种外植体取样100，分装15皿，分别于分化培养基上培养5､10､15､20､25 d时进行大于3个重生芽的外植体数量进行统计，与总的外植体数量比较，计算重生芽频率，取3次重复平均值｡1．5吉林小粒1号胚芽尖再生体系的建立参考Wei等的方法，将胚芽尖外植体放在MSB5培养基上，培养24 h后，将胚芽尖向上插入MSB5(6 mg·L－1 BAP和100 μmol·L－1乙酰丁香酮)培养基中，25℃光照18 h/黑暗6 h，培养10 d后转接到新鲜培养基1次，待重生芽长到2~3 cm时，转到生根培养基1/2MSB5(0．2 mg·L－1 BAP，1．0 mg·L－1 IBA)上，16 h光照/8h黑暗，培养至长成植株，正常光照培养[10]｡1．63种外植体卡那霉素筛选浓度的确定卡那霉素(Kanamycin)是组培中常用的筛选指标，浓度过低引起假阳性增加后期检测的工作量，浪费成本｡而浓度过高，则再生频率低｡为此，我们将胚芽尖､子叶节､胚轴3种外植体重生芽再生培养基的Kanamycin筛选浓度设定为10､20､30､40､50､70､80ʍ 80;100 mg·L－1，3周后统计大于3个重生芽的外植体数量，与总的外植体数量比较，计算重生芽频率，取3次重复平均值｡1．7不同侵染时间对胚芽尖重生芽频率的影响将含有植物表达载体w10的农杆菌LBA4404在YEB+K中培养过夜｡在50 mL YEB培养基中重培养至OD600达1．3~1．5｡3 000 r·min－1离心10 min，菌体用1/2MSB5洗1次，用1/2MSB5(3 mg·L－1 BAP和100 μmol·L －1乙酰丁香酮)，调整OD600至0．5｡将胚芽尖外植体放在含有3%蔗糖､0．6%植物凝胶和3．5 mg·L－1 BAP的MSB5培养基上24 h｡外植体放入农杆菌的悬液中分别孵化0．5､1．0､1．5､3．0､6．0､12．0 h，每个时间段孵化外植体60个，分别将其放在6皿铺有滤纸的1/2MSB5(6 mg·L－1 BAP 和100 μmol·L－1乙酰丁香酮)培养基上(pH值5．8)，25℃，黑暗培养5 d｡外植体转移到含0．6%植物凝胶的固体培养基上1/2MSB5(0．2 mg·L －1 BAP，0．2 mg·L－1 IBA，300 mg·L－1噻孢)放置5～7 d｡然后，将外植体转移到选择培养基1/2MSB5(0．2 mg·L－1 BAP，0．2 mg·L－1 IBA，300mg·L－1噻孢，300 mg·L－1羧苄，100 mg·L－1卡那)上光照培养，两周后统计大于3个重生芽的外植体数量，与总的外植体数量比较，计算重生芽频率，重复3次取平均值｡1．8农杆菌转化吉林小粒1号再生植株的获得方法同1．7(将外植体放入农杆菌悬液中孵化6 h)，待抗性芽长到2~3cm时，转到生根培养基上1/2MSB5(0．2 mg·L－1 BAP，1．0 mg·L－1 IBA，300 mg·L－1噻孢，300 mg·L－1羧苄，25 mg·L－1卡那)16 h光照/8 h黑暗，培养至长成植株，正常光照培养｡2结果与分析2．13种外植体重生芽频率比较大豆吉林小粒1号3种外植体重生芽频率的比较结果见图1｡由结果我们可以得知胚芽尖的重生芽频率最高达到95%，子叶节的重生芽频率其次为81%，胚轴的重生芽频率相对较低为78%｡这说明对于大豆品种吉林小粒1号而言外植体的重生芽频率胚芽尖>子叶节>胚轴｡2．23种外植体重生芽发生时间比较能够快速产生重生芽也是好的再生体系的一个评价因素｡因此我们对吉林小粒1号，3种外植体的重生芽发生时间进行比较(表2)，结果表明胚芽尖重生芽发生频率达到最高的时间出现在15 d左右，而子叶节和胚轴均出现在25 d左右，这说明胚芽尖的重生芽发生时间较短，优于子叶节和胚轴｡2．3吉林小粒1号胚芽尖再生体系的建立利用胚芽尖作为外植体，在MSB5培养基上，培养24 h后，转入MSB5(6 mg·L －1 BAP和100 μmol·L－1 乙酰丁香酮)培养基中，15 d左右成功获得了大豆品种吉林小粒1号的重生芽，将重生芽转到生根培养基1/2MSB5(0．2 mg·L－1 BAP，1．0 mg·L－1 IBA)上，15 d左右开始生根(图2)，1个月左右全部生根，将生根的再生苗打开瓶口炼苗 3 d后，洗去根部培养基，移栽到盆中长成植株｡2．43种外植体卡那霉素筛选浓度的确定3种外植体重生芽再生培养基的Kanamycin筛选浓度设定为10､20､30､40､50､70､80ʍ 80;100 mg·L－1，3周后统计重生芽数量结果见表3｡表3结果表明，Kanamycin浓度达到80 mg·L－1时，3种外植体重生芽数量均为0，因此，我们认为100 mg·L －1为合适的Kanamycin筛选浓度｡2．5不同侵染时间对胚芽尖体系重生芽发生频率的影响不同侵染时间对胚芽尖外植体的重生芽发生频率影响不同，结果(表4)表明，吉林小粒1号胚芽尖随着侵染时间的不同而在抗性培养基上重生芽发生频率不同，最适侵染时间为6 h｡2．6吉林小粒1号转基因植株的获得我们利用农杆菌(LBA4404)侵染法将w10(带有植物抗病基因)导入大豆品种吉林小粒1号，得到再生植株86棵(图3)，经初步鉴定得到转基因阳性植株｡初期转基因植株的生长状态与非转基因植株相同，随着大豆生育期的延长，转基因植株的生长状态逐渐表现差异，有的偏矮或叶片偏小，也得到了部分长势良好且与非转基因对照农艺性状相同的植株，为下一步研究转入基因的功能打下了基础｡3结论与讨论本研究以大豆胚芽尖为外植体，在MSB5加入6 mg·L－1 BAP和100 μmol·L －1乙酰丁香酮，以及1/2MSB5加入0．2 mg·L－1 BAP和1．0 mg·L－1 IBA培养基上，建立了高效快速的吉林小粒1号大豆组培再生体系｡并利用农杆菌LBA4404介导法将构建好的植物表达载体w10转化吉林小粒1号，获得了再生植株｡同时，对吉林小粒1号的胚芽尖､子叶节､胚轴3种外植体在再生频率､再生时间､Kanamycin筛选浓度，农杆菌不同侵染时间对重生芽再生频率的影响进行了研究｡结果表明，吉林小粒1号重生芽再生频率胚芽尖>子叶节>胚轴；再生时间胚芽尖优于子叶节和胚轴；Kanamycin最适筛选浓度为100 mg·L－1；最适农杆菌侵染时间为6 h｡。
农杆菌介导大豆未成熟子叶节的遗传转化
农杆菌介导大豆未成熟子叶节的遗传转化钟磊;王林红;乔亚科;崔姗姗;纪展波;李桂兰【摘要】以冀豆7号未成熟子叶节为转化受体,研究外植体取材时间、低温预处理、共培养温度及光照时间对农杆菌介导大豆转化抗性芽的影响.结果表明,以开花后60～66 d进行外植体取材的子叶节产生的抗性芽数量较多；共培养温度26℃,光照时间24 h/d有利于抗性芽产生,而外植体4℃低温预处理不利于抗性芽产生.分析不同品种抗性芽诱导率发现,不同基因型未成熟子叶节抗性芽发生率不同,其中以豫豆22,冀豆7号和品系12的抗性芽诱导率较高.【期刊名称】《河北科技师范学院学报》【年(卷),期】2013(027)001【总页数】4页(P1-4)【关键词】大豆;农杆菌介导;未成熟子叶节;抗性芽诱导【作者】钟磊;王林红;乔亚科;崔姗姗;纪展波;李桂兰【作者单位】河北科技师范学院生命科技学院,河北秦皇岛,066600【正文语种】中文【中图分类】S565.103.52大豆是公认的较难进行遗传转化的植物之一。
农杆菌介导的大豆遗传转化是最早被开发出来并且是目前应用最广泛的一种转基因技术［1］，该法具有操作简单，费用低廉，可插入基因片段大，不容易发生重排等优点。
农杆菌转化所用的外植体主要有子叶节［2～6］、无菌苗的茎尖［7］、未成熟胚子叶［8］、上胚轴和初生叶［9］、子叶［10］、成熟胚的胚尖［11］、未成熟胚体细胞胚［12］等，而对利用未成熟大豆种子子叶节的转化研究报道则较少。
笔者以不同大豆品种的未成熟种子子叶节为转化受体，研究其遗传转化影响因素，为提高大豆遗传转化效率提供依据。
1 材料和方法1.1 材料供试大豆品种:冀豆7号，豫豆22，九农26，郑97196，品系10，品系12。
植物表达载体:pX6PTF1(河北农业大学张彩英研究员提供)［13］。
1.2 方法1.2.1 外植体的制备选取开花后不同发育时期的大豆豆荚，清水冲洗表面，体积分数为0.75的酒精消毒1 min，无菌水冲洗1次，质量浓度为1.0 g/L的氯化汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗3次。
大豆再生体系的研究进展
“黑生101”大豆子叶节再生体系的建立
表 １ 再 生 培 养基 组 成 及 培养 条 件
２ 结 果 与分 析
２ １ ” 生 １ １ 大豆种 子预培 养和 暗培养 ． 黑 ０”
将 消毒好 的大豆种 子分别接 种到 ４种含 有不 同浓 度 （ ｍｇ Ｌ ０ ４ ／ ，． ｍｇＬ，． ｇ Ｌ ６一Ｂ ０ ／ ，． ｍｇ Ｌ ０ ８ ／ １２ ｍ ／ ） Ａ 激素 的 Ｇ Ｍ培 养基 的三角 烧 瓶 中 ， 接种 时 将 种 子胚 ３ ５部 分 插 入培 养 基 中． ２ ￣ 光 Ｎ／ 暗 （ ６ ／ ／ 在 ６Ｃ、 黑 １ｈ ８ ） 替条件下进 行培 养 ，ｄ观察 “ ｈ交 ６ 黑生 １ １ 大豆种子 萌发情 况． ６ ０” 第 ｄ在 ４种 预培 养基 中 ， 已有 萌 发 都 的种 子（ １ ） 但是 ， ４种含 有不 同浓度 ６一Ｂ 图 Ａ． 对 Ａ预 培养 基 中萌发 的种 子数 据进 行统 计 分 析发 现 ， 在 预培 养基 中是 否添加 ６一Ｂ Ａ激素 ， “ 生 １ １ 大豆 的萌发 率有 较大 的影 响（ ２ ． 对 黑 ０” 表 ） 经统 计分 析显示 ： 预培 养基 中添加 ６一Ｂ 能够 极显 著提高 “ Ａ， 黑生 １ １ 大 豆种子 的萌发率 ． ０” 在预培养基 中分别 添加 ０ ４ ／ ０ ８ ｇ Ｌ １ ２ ／ Ｂ 对“ ． ｍｇＬ，． ｍ ／ ，． ｍｇ Ｌ６一 Ａ， 黑生 １ １ 大豆种 子萌 发率 进行 统 ０”
维普资讯
第３ 卷第４ ７ 期
２００８年 ８月
上海师范大学学报 （ 自然科学版 ）
Ｊｕ ａ ｏ ｈ ｎｈｉ ｏｍａ Ｕ ｉ ｒｔ（ ａ ｒｌ ｃｅｃｓ ｏ ｒ ｌ ｆ ａｇ ａ Ｎ ｒ ｌ ｎｖ ｓｙ Ｎ ｔ ａ Ｓｉ ｅ） ｎ Ｓ ｅｉ ｕ ｎ
文献综述1
大豆组织再生体系建立摘要：大豆组织再生体系的建立，对大豆育种及大豆遗传转化都具有重要意义，和5%的NaClO二次消毒法进但大豆再生的效率却不高。
本文研究确定了使用Cl2行种子消毒，确定大豆子叶节发芽时在基本培养基的基础上添加 2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA。
确定了大豆生根的最佳浓度是加入0.1mg/L的IBA，并且使用下胚轴、子叶进行愈伤组织的诱导，但还未诱导出芽和根，还有待进一步研究。
关键词：大豆种子；子叶节；植物激素；再生引言大豆中富含蛋白质及油脂还有一些其它的矿物质和维生素，它是主要的油料作物和植物蛋白的来源，是一种高蛋白，高脂肪的作物，营养价值和经济价值都很高。
大豆制品是人们生产生活不可或缺的食物，大豆制品更是风靡全球，走入寻常百姓家。
但是，大豆受虫害，农药影响严重，同时由于我国大豆生产规模小、效益低、大豆品质参差不齐，导致我国的大豆生产远远落后于国内其他粮食作物的发展。
所以我们对大豆的再生体系进行研究，生产高产的大豆植株。
目前，对大豆的研究很多，但是大豆再生的效率依然很低。
为此，本课题主要研究大豆再生体系的建立，通过对子叶节、下胚轴、子叶等不同外植体进行再生体系的研究，探索适合大豆分化的激素浓度及培养基成分，可以高效地规模化地再生大豆植株，为大豆遗传转化以及转基因大豆的规模化生产奠定研究基础。
1 大豆及其简介大豆(Glycine max(L．)Merrill)属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n=40)植物，在世界各国广泛种植【1】。
它起源于中国，后相继传入日本、欧洲和美国等，其种子(大豆)是人类主要的植物性蛋白质来源，也是重要的家畜饲料和工业原料，具有很大的医学价值[2-3]。
为此，人们对大豆的组织培养进行了广泛研究。
20世纪60年代，人们曾采用大豆的各种外植体进行培养，而再生效率普遍较低，且重复性较差，20世纪80年代以来，大豆再生体系的建立获得了很大的进展。
大豆子叶节再生影响因素的研究
大豆子叶节再生影响因素的研究
大豆子叶节再生是指在适当的条件下，大豆植株能够通过切割或损伤后再生新的叶节。
这一过程受到多种因素的影响，以下是对大豆子叶节再生影响因素的研究。
1. 切割位置：研究发现，切割位置对大豆子叶节再生影响显著。
通常来说，靠近植株顶部的切割位置会有更高的再生能力。
这可能是因为顶部植株组织更加幼嫩且富含植物激素，有利于新叶节的再生。
2. 切割方式：切割方式也对大豆子叶节再生产生影响。
研究人员发现，采用V型切割法比U型切割法更有利于大豆子叶节
的再生。
这可能与V型切割法创造了更大的创伤面积和切割
面积有关，进而刺激了再生过程。
3. 植株生长阶段：大豆子叶节再生能力在不同生长阶段会有所不同。
研究表明，大豆在生长初期和生长末期的再生能力较强，而在生长中期则较弱。
这可能与植物组织的分化程度和植物激素水平有关，需要进一步的研究来解释其中的机制。
4. 外界环境因素：外界环境因素也对大豆子叶节再生产生影响。
光照、温度和湿度等环境因素都会影响叶节再生的速度和数量。
较高的光照和适宜的温湿度条件有助于促进再生过程。
总之，大豆子叶节再生受到切割位置、切割方式、植株生长阶段和外界环境因素等多种因素的共同影响。
这些因素的研究有
助于深入理解大豆植物再生的机制，并为提高大豆子叶节再生效率提供科学依据。
小豆不定芽诱导及再生体系的建立
小豆不定芽诱导及再生体系的建立引言小豆（Glycine max L.），又称大豆，是世界上重要的粮食作物之一。
小豆富含蛋白质、脂肪及多种营养成分，具有广泛的用途，被广泛种植于全球各地。
小豆的生长过程中受到各种生物和环境胁迫的影响，为了提高小豆的抗逆性和栽培效率，研究人员一直在致力于培育适应不同环境的小豆新品种。
而离体培养技术则成为培育抗逆小豆品种的重要手段之一，通过这一技术可以实现对小豆的遗传改良和快速繁殖。
在离体培养过程中，小豆的不定芽诱导及再生体系一直是制约其发展的关键因素之一。
一、小豆的不定芽诱导不定芽是植物体内一种能够定向分化为新植物体的生长点，是进行组织培养的重要前提。
对小豆不定芽的诱导，一直是研究人员关注的焦点之一。
目前，常用的小豆不定芽诱导方法有叶片法、愈伤组织法和悬浮细胞法等。
叶片法是指通过从小豆植株上取下新鲜叶片，并将其置于含有适当植物生长调节物质的培养基上，促进小豆叶片上形成不定芽。
愈伤组织法是指将小豆愈伤组织培养在含有适当植物生长调节物质的培养基上，促进愈伤组织分化成不定芽。
悬浮细胞法是指将小豆悬浮细胞培养在含有适当植物生长调节物质的培养基上，促进悬浮细胞形成不定芽。
二、小豆再生体系的建立虽然已经有了多种小豆不定芽诱导及再生体系的建立方法，但是在实际应用中仍然存在一些问题和不足。
优化小豆不定芽诱导及再生体系，提高诱导率和再生率，对于小豆离体培养技术的推广和应用具有重要意义。
在优化小豆不定芽诱导及再生体系时，可从以下几个方面进行考虑：1. 培养基成分的优化：培养基中的植物生长调节物质、糖类、氨基酸、维生素等成分的比例和浓度对小豆不定芽诱导及再生起着重要的调控作用，因此需要对培养基成分进行细致的优化。
2. 培养环境的控制：培养温度、光照强度、湿度等环境因素对小豆不定芽诱导及再生体系的建立起着重要的影响，需要根据实际情况进行合理的控制。
3. 植物激素的应用：通过植物激素的外源添加或者内源调控，可以促进小豆不定芽的诱导和再生，因此需要合理地应用植物激素来调控小豆不定芽的形成和分化。
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BA 浓度为 未成熟种子子叶节不定芽诱导的影响 。 结果表明： 冀豆 12 最佳取材时间为开花后 60 ～ 66 d， 最佳 61. 0 ～ 1. 5 mg · L － 1 ， 6BA 浓 度 为 出 芽 率 达 96. 67% ～ 100% 。 中 黄 13 最 佳 取 材 时 间 为 开 花 后 49 ～ 65 d， 1. 5 mg·L － 1 ， 出芽率达 93. 33% ～ 100% 。冀豆 12 和中黄 13 未成熟种子子叶节的出芽率比成熟种子子叶节分别提 高 4% 和 10% 。 关键词：大豆； 未成熟种子子叶节； 诱导
60 、 66 d 取其未成熟 分别在冀豆 12 开花后 51 、 种子， 接种在诱导培养基上， 获得不定芽诱导率分 94. 8% 、 95% 。51 ～ 60 d 不定芽诱导 别为 76. 6% 、 率直线上升， 此后不定芽诱导率保持平稳， 到 66 d 时， 出芽率仅提高了 0. 2% （ 图 1 ） 。 冀豆 12 以开花 后 60 ～ 66 d 为适宜取材时间段。分别在中黄 13 开 45 、 49 、 65 d 取材， 花后 42 、 出芽率分别为 55. 3% 、 49. 5% 、 67. 4% 、 73. 3% （ 图 2 ） 。 因此， 利用未成熟 种子子叶节进行丛生芽诱导的最佳取材时期， 冀豆 12 为开花后 60 ～ 66 d， 中黄 13 为开花后 49 ～ 65 d。
大豆品种 Varieties 冀豆 12 Jidou 12 6BA 浓度 Concentration of 6BA / mg·L － 1 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 中黄 13 Zhonghuang 13 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 外植体数 Explants 90 90 90 90 90 110 100 100 100 100 出芽率 Budding rate /% 87. 33 90. 67 92. 00 85. 33 88. 67 38. 50 58. 50 64. 13 81. 25 61. 13 平均出芽数 Average of shoots 1. 15 1. 62 1. 88 1. 73 1. 70 0. 75 1. 09 1. 37 1. 89 1. 06
［1218 ］
。
相对于水稻， 玉米， 烟草等作物， 大豆是目前公 认的较难进行遗传转化的植物， 主要是因为大豆的 再生率较低， 高效大豆再生体系的建立是大豆遗传 转化的基础。目前， 大豆再生所用的外植体主要有 子叶节
［45 ］ ［6 ］ ［7 ］ ， 无菌苗的茎尖 ， 未成熟胚子叶 ， 上 ［8 ］
（ Life Science and Technology College，Hebei Normal University of Science and Technology，Changli 066600 ，Hebei，China）
Abstract： Immature seed cotyledons nodes of Jidou 12 and Zhonghuang 13 were used as explants to research the effect of 6BA concentration，time of obtaining materials and degree of seeds development on the proportion of shoots regeneration from immature seeds cotyledons nodes． The result showed that the best time of obtaining materials of Jidou 12 was 60 － 66 d after flowering ，the optimal concentration of 6BA in multiple shoots induction medium was 1. 0 － 1. 5 mg·L － 1 ， and the proportion of shoots reached 96. 67% － 100% ． The best time of obtaining materials of Zhonghuang 13 was 4965 d after flowering，the and the proportion of shoots reached optimal concentration of 6BA in multiple shoots induction medium was 1. 5 mg · L － 1 ， 93. 33% － 100% ． Proportion of shoots by immature seeds cotyledons nodes were higher than mature seeds cotyledons nodes by 4% and 10% for Jidou 12 and Zhonghuang 13 ，respectively． Key words： Soybean； Immature seeds cotyledon node； Induction
第 30 卷 2011 年
第3 期 6月
大 豆 科 学 SOYBEAN SCIENCE
Vol. 30 Jun．
No. 3 2011
大豆未成熟种子子叶节不定芽再生的初步研究
王卢平， 乔亚科， 李桂兰， 钟 磊， 崔姗姗， 纪展波
（ 河北科技师范学院 生命科技学院 ， 河北 昌黎 066600 ）
摘
BA 浓度、 要：以冀豆 12 和中黄 13 的未成熟种子子叶节为外植体 ， 研究了 6取材时间和种子发育程度对大豆
中图分类号：S565. 1
文献标识码：A
9841 （ 2011 ） 036905 文章编号：1000-
Shoots Regeneration of Cotyledon Node from Soybean Immature Seeds
WANG Luping，QIAO Yake，LI Guilan，ZHONG Lei，CUI Shanshan，JI Zhanbo
2. 3
未成熟种子发育程度对不定芽诱导的影响 取冀豆 12 和中黄 13 不同发育阶段的未成熟种
－1 BA 的诱 制备外植体， 接种在含 1. 5 mg · L 6子，
导培养基上。 随着种子发育未成熟种子的出芽率 和平均出芽数都逐渐增加。 冀豆 12 豆荚长度达到 5. 45 cm 时， 种子长度 1. 57 cm， 此时种子颜色由绿 色变为黄色， 未成熟种子出芽率和平均出芽数都显 著增加， 出芽率达到 100% ， 平均出芽数也达到最高 （ 2. 57 个） 。中黄 13 豆荚长度达到5. 87 cm 时， 出芽 率显著提高（ 表 2 ） ， 此时， 豆荚及种子呈现黄色。
1
1. 1
材料与方法
供试材料
1. 1. 1
胚轴和初生叶 豆子叶节
［5 ］
， 子叶
［9 ］
， 成熟胚的胚尖
［10 ］
等。 大
大豆品种 冀豆 12 （ 河北省粮油作物所 ） ， 中黄 13 （ 中国农科院） ， 种植在河北科技师范学院试
是遗传转化中应用最普遍的外植体， 子
［11 ］
叶节是成熟的大豆种子通过萌发后获得的。 对未 成熟大豆种子子叶节的再生系统研究则很少 。 大豆未成熟子叶外植体诱导体细胞胚已经有很多
370
大 豆 科 学
3期
1. 2 1. 2. 1
试验方法
2. 2
取材时间对大豆未成熟种子子叶节不定芽诱 导的影响
外植体的制备 大豆开花后， 定期取田间 75% 的酒精处理 未成熟大豆豆荚， 用水冲洗表面，
30 s， 再用 0. 1% HgC1 2 浸泡消毒 8 min， 在超净工作 台上， 剥去种皮， 将 2 片未成熟子叶从子叶节处纵 向切开， 用解剖刀将下胚轴切断。 每粒未成熟种子 获得 2 个未成熟种子子叶节外植体。 1. 2. 2 芽诱导 将上述获得的外植体近轴面朝上 16 h 光照 /8 h 接种到诱导培养基中。 （ 25 ± 1 ） ℃ ， 黑暗培养， 每隔 15 d 继代 1 次。30 d 后统计外植体 的出芽率。 出芽率 （ % ） = （ 出芽外植体数 / 外植体 总数 ） × 100 ； 平 均 出 芽 数 = 总 芽 数 / 外 植 体 总 数 （ 个） 。 1. 3 数据统计 采用 Microsoft Office Excel 2003 进行数据整理 分析。
表1 BA 浓度对大豆未成熟种子 不同 6 子叶节出芽率的影响 Table 1 Effects of 6 BA concentration on 图2 中黄 13 未成熟胚取材时间对出芽率的影响 Fig. 2 Effect of pods picking time on budding rate of Zhonghuang 13 Budding rate of immature seeds cotyledon node
2
2. 1
结果与分析
6BA 浓度对大豆未成熟种子子叶节不定芽诱 导的影响
图1 冀豆 12 未成熟种子取材时间对出芽率的影响 Fig. 1 Effect of pods picking time on budding rate of Jidou 12
BA 浓度逐渐升高， 在一定范围内， 随着 6大豆 BA 浓度在 未成熟种子子叶节出芽率随之升高。60 ～ 1. 0 mg·L － 1 范围内， 随着激素浓度的升高， 冀豆
大豆是世界上重要的粮食和油料作物， 也是主 要的工业原料。多年来， 研究者通过传统的杂交育 并 种和现代的转基因手段对大豆的性状进行改良， 取得了重要成果。 尤其是随着基因工程技术的发 展， 大豆转基因技术也取得了快速发展
［13 ］
， 但是通过未成熟子叶直接诱导丛生芽的 途径未见报道。大豆未成熟种子与成熟种子相比， 研究 其发育状态， 生理状态都有很大差别， 该文主要对 大豆未成熟种子子叶节不定芽诱导条件进行了研 究， 旨在建立高效的不定芽再生系统， 为大豆转基 因提供应用基础。