医学真菌实验室检查法

First Hospital, Research Center for Medical Mycology, Peking University
a IFI = Invasive Fungal Infections
IFD早期诊断关键
病原学证据
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微生物学证据-临床诊断
• 镜检： • 以下任一病灶处查见丝状菌： • □痰 □肺泡灌洗液 □支气管刷片 □窦道
吸出物 • 培养： • 以下任一病灶处培养见丝状菌：□肺泡灌洗液
□支气管刷片 □窦道吸出物 • 抗原检测： • G试验（血清） • GM试验（血浆、血清、BALF、CSF）
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IFD发生率>诊断率
侵袭性真菌感染发病率/检出率 侵袭性真菌感染归因死亡率
31%
12.3%
36.8%
另一项尸检结果发现
住院时检测1
¾ IFD患者
73%
生前未得到
确切诊断
尸检结果*2
* 1999-2003年,对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示
Pagano et al. Hematologica. 2006;91:1068-1075 Chamilos et al. Hematologica.2006;91:986-989
• CRBSI的判断
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例: 下呼吸道标本
• 包括深部痰液，支气管吸取物，肺泡灌 洗液。
• 标本采集：清洁口腔后采集清晨第一口 痰液。采用外科方法进行支气管毛刷取 样和采集肺泡灌洗液。唾液或24小时痰 液都不能用来进行真菌培养。
标本采集与处理
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标本采集及处理
采集部位消毒： 1.一步法：葡萄糖酸氯己啶作用30s，或70%
异丙醇消毒后自然干燥。 2.三步法：(1) 70%乙醇擦拭静脉穿刺部位，
操作步骤：
标本滴加载浮液后 ，加盖玻片镜检。 先用低倍镜（遮去 强光）观察有无菌 丝和孢子，然后用 高倍镜观察孢子和 菌丝的形态、位置 、大小和排列、产 孢结构等特征，以 提示真菌种属。
结果解释： 无菌部位取材标本涂 片阳性提示真菌感染 可能。非无菌部位取 材标本涂片阳性时应 结合临床其他检查。 注意：真菌菌丝、孢 子或芽孢有一定折光 性，勿将纤维、细胞 等误认为真菌。
• 标本处理：2小时内室温送检；若不能及 时送检，则4℃保存。较黏稠的标本需要 使用消化液处理，2000g离心10分后取沉 渣接种。
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不合格标本
• 标本标识与申请单不符，标识错误或没有标识； • 标本未按规定采集于无菌容器或容器选择不恰当； • 采集标本时未按规定作消毒或清洁创口； • 标本采集量过少； • 标本保存方式不恰当或保存时间超过规定； • 血培养瓶中有凝块； • 血培养瓶破碎，损坏，渗漏或过效期； • 血培养瓶数不够； • 稀薄唾液或低倍镜下上皮细胞数大于10个； • 采集尿液标本未清洁会阴部及尿道口。
待干30s以上；(2) 1%-2%碘酊从穿刺点向外 画圈消毒至消毒区域直径达3cm以上，作用 30 s或10 %碘伏60 s；(3) 70 %乙醇脱碘：对 碘过敏的患者，用70%乙醇消毒60s，待乙 醇挥发干燥后采集标本。
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真菌标本的镜检
• 湿片制备 • Calcofluor white • 墨汁 • 染色:
Giemsa，Gram
• 组织病理
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主要内容
• 标本采集及处理 • 形态检查 • 培养检查 • 真菌培养鉴定 • 非培养诊断方法
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中华人民共和国卫生行业标准
侵袭性真菌病临床实验室诊断 操作规范解读
8
IFD诊断及治疗策略
Ben, et al. Clin Infect Dis. 2008; 46:1813–21
早期诊断和治疗已成为当今医学
领域共同关注的重大问题!
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真菌感染的病死率高
Kume, et al. Med Mycol 2011;52:117-127 First Hospital, Research Center for Medical Mycology, Peking University
(N=15)
(N=7)
(N=14)
†
Adapted from Pagano L, et al. Haematologica. 2006;91:1068-1075.
(N=310)
† Others: • Scedosporium spp. (N=3) • Acremonium spp. (N=2) • Cladosporium spp. (N=1) • Penicillum spp. (N=1)
微生物学证据-确诊
• 镜检： • □无菌病灶处 □病理片 • 培养： • 以下任一无菌病灶处培养阳性： • □脑脊液 □组织 □无菌病灶引流液 • □血（酵母菌、镰刀菌等，曲霉除外） • 肺泡灌洗液、颅窦标本、尿中培养出丝状菌不能
确诊 • 抗原检测：隐球菌抗原
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直接镜检—酵母细胞
马尔尼菲青霉病
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组织细胞内酵母细胞
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形态学特征
• 酵母样孢子：提示酵母菌； • 酵母样孢子和假菌丝：提示念珠菌； • 有荚膜的酵母样孢子：提示隐球菌； • 透明、有隔菌丝，约45˚角分枝，鹿角样提示曲霉； • 透明、无隔或少隔菌丝，菌丝宽大，约90˚度分枝提
示毛霉目真菌； • 棕色或黑色菌丝或孢子：提示暗色丝状真菌。
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规范了各类标本采集与处理
– 血液 – 骨髓 – 静脉导管 – 无菌体液 – 尿液 – 脓液、引流液、创面分泌物及窦道 – 下呼吸道标本（深部痰液，支气管吸取物，
肺泡灌洗液） – 眼部标本（角膜刮片、玻璃体液等） – 组织标本
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马尔尼菲青霉病
临床所见
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念珠菌病-直接镜检
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真菌显微镜检查
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形态学检查
Operating Procedures for Laboratory diagnosis of Invasive Fungal Diseases
(2014-5-报批稿)
起草单位：中国医学科学院北京协和医院、 北京大学第一医院 复旦大学附属华山医院
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组织病理学
念珠菌病
隐球菌病—直接镜检
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医学真菌实验室检查法
北京大学第一医院、真菌和真菌病研究中心 李若瑜
2015.6.6,山东济南
mycolab@126.com
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真菌感染流行现状与 诊断策略
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例:血液
• 标本采集：推荐在抗真菌药物使用前，发热初期或寒战 期取静脉血或骨髓液。采集血液后立即注入血培养瓶内 并轻轻摇匀。至少采集2套。标本与培养基比例为1/101/5（必须包括需氧瓶或真菌专用瓶）。
• 标本处理：2小时内常温送检。若不能及时送检，则常温 保存。评估导管相关性血流感染（CRBSI）时，如患者 已拔管，应采集2套外周血进行培养，同时做导管尖 Maki法半定量培养。如患者尚未拔管，应至少采集1套 外周血培养，同时尽快采集等量的导管血进行培养。
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血液系统恶性肿瘤患者的霉菌感染
• 一项从1999到2003年间对意大利18个血液病房11,802名患者的回顾性研 究显示：
– 64.3% (N=346/538) IFIa 由霉菌引起 – 曲霉感染占90% (N=310/346)
条件致病性真菌无处不在!
源自文库
侵袭性真菌病发病不断上升
免疫受损宿主面临威胁
First Hospital, Research Center for Medical Mycology, Peking University
Liu et al. Chin J Med. 2003; 83: 399-402
Martin et al. New Eng J Med. 2003;348:1546
真菌感染的诊断
临床诊断
病史 体检 影像学
实验室标本
活检组织, 血液, CSF, BAL, 痰, 尿, 胸水, 腹水, 插管尖端等.
显微镜检
培养和鉴定
血清学
抗原、抗体、分子学
取决于感染部位合适的 标本取材
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