免疫共沉淀研究生实验课
免疫共沉淀实验设计
免疫共沉淀实验设计免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质相互作用、蛋白质复合物的组成以及蛋白质的修饰状态。
本文将介绍一种基于免疫共沉淀的实验设计，以探究细胞中的蛋白质相互作用。
实验目的：本实验旨在通过免疫共沉淀技术鉴定目标蛋白与其他蛋白的相互作用，进一步了解细胞内蛋白质的功能和调控网络。
实验材料：1. 细胞系：选择适当的细胞系，如人类细胞株HEK293T。
2. 细胞培养基：适合细胞系的培养基，如DMEM高糖培养基。
3. 细胞裂解液制备试剂盒：含有细胞裂解液的试剂盒，如RIPA裂解缓冲液。
4. 蛋白A/G琼脂糖：用于免疫共沉淀的琼脂糖。
5. 抗体：选择目标蛋白的特异性抗体，如抗FLAG标签抗体。
6. 蛋白质电泳相关试剂：如SDS-PAGE凝胶、蛋白质分子量标准品等。
实验步骤：1. 细胞培养：将HEK293T细胞接种在培养皿中，培养至细胞密度达到80%以上。
2. 细胞裂解：将细胞用PBS缓冲液洗涤后，加入足够的RIPA裂解缓冲液，彻底裂解细胞膜。
3. 免疫共沉淀：将裂解液离心，收集上清液，加入目标蛋白的特异性抗体，并在4℃下静置过夜，使抗体与目标蛋白结合。
4. 加入蛋白A/G琼脂糖：将蛋白A/G琼脂糖加入样品中，轻轻摇动，使琼脂糖与抗体结合。
5. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤琼脂糖，去除非特异性结合的蛋白质。
6. 热变性：将洗涤后的琼脂糖加入蛋白质电泳样品缓冲液，煮沸10分钟，使蛋白质变性。
7. SDS-PAGE电泳：将样品加载到SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
8. 蛋白转印：将凝胶中的蛋白质转移到膜上，如PVDF膜。
9. 免疫印迹：用特异性抗体探针识别目标蛋白，如抗FLAG标签抗体。
10. 显色：使用合适的显色试剂，如ECL显色试剂盒，观察蛋白质带。
实验结果分析：通过免疫共沉淀实验，可以鉴定目标蛋白与其他蛋白的相互作用。
在SDS-PAGE凝胶上观察到特定的蛋白带，表明目标蛋白与特异性抗体结合，并与其他蛋白形成复合物。
《免疫共沉淀》课件
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。
这样每100 ul溶液含1x106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5x106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4x106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800 ul。
7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。
共14次。
二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。
去除不溶物质。
2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
rna免疫共沉淀实验步骤
rna免疫共沉淀实验步骤
RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation）是一种常用于研究RNA与蛋白质相互作用的实验方法。
通过该实验可以确定RNA分子与特定蛋白质的结合情况，从而揭示RNA在细胞内的功能及调控机制。
下面将介绍RNA免疫共沉淀实验的步骤。
1. 细胞培养和处理，首先，将感兴趣的细胞系培养至适当的密度，然后进行处理，如添加药物、激素或其他刺激剂，以诱导RNA 与蛋白质的相互作用。
2. 交联，将细胞用交联剂（如甲醛）进行交联，以稳定RNA与蛋白质的相互作用。
3. 细胞裂解，将交联后的细胞裂解，并用裂解缓冲液溶解细胞膜，释放细胞内的RNA与蛋白质。
4. 免疫沉淀，将特异性抗体与蛋白A/G琼脂糖磁珠或琼脂糖珠结合，形成抗体-琼脂糖复合物。
然后将裂解液与抗体-琼脂糖复合物共孵育，使特定蛋白质与其结合的RNA被抗体-琼脂糖复合物沉淀下来。
5. 洗涤，经过免疫沉淀后，对琼脂糖磁珠进行多次洗涤，以去除非特异性结合的RNA和蛋白质。
6. RNA的提取，用三氯化锑或其他方法从琼脂糖磁珠上提取RNA。
7. RNA的分析，提取的RNA可以通过RT-qPCR、Northern blotting等方法进行定量或质量分析，从而确定RNA与特定蛋白质的结合情况。
通过RNA免疫共沉淀实验，研究人员可以揭示RNA与蛋白质的相互作用，从而深入了解RNA在细胞内的功能及调控机制。
这一实验方法对于研究RNA的生物学功能和疾病机制具有重要意义。
免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀实验原理及方法实验原理：实验步骤：1.细胞培养和样品收集：将需要进行免疫共沉淀的细胞株培养至适当的密度，接种到培养皿中。
细胞生长至适当的程度后，进行诱导或处理，然后收集样品。
2.细胞裂解：将收集到的细胞样品进行裂解，以释放细胞内的蛋白质。
可以使用裂解缓冲液来破坏细胞膜，并释放细胞内蛋白质。
可以添加蛋白酶抑制剂来防止蛋白质降解。
3.抗体预处理：将抗体与载体蛋白质混合，形成抗体-载体复合物。
载体蛋白质可使抗体更容易结合，并增强免疫共沉淀的效率。
4.抗体结合：将抗体-载体复合物加入到裂解的细胞提取物中，使其与靶蛋白相互结合。
对于一些低表达或低丰度的蛋白质，可以使用前处理来提高抗原的浓度。
5.免疫沉淀：将抗体结合的蛋白质复合物使用特定的技术进行沉淀，如使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠沉淀。
可以通过离心或洗涤的方式分离复合物。
6.溶解复合物：将沉淀得到的复合物进行溶解，以获得蛋白质样品。
可以使用洗脱缓冲液将复合物从沉淀物上释放出来。
7. 分析复合物：使用各种方法对蛋白质样品进行分析，如SDS-、Western blotting、质谱分析等。
这些分析方法可以帮助鉴定免疫共沉淀物中的蛋白质。
1.简便快速：相对于其他的蛋白质相互作用检测方法，免疫共沉淀方法的操作相对简单，减少了操作步骤和时间。
2.高特异性：使用抗体作为识别蛋白质的工具，具有高度特异性，可以用于检测特定的蛋白质交互作用。
3.可定量性：免疫共沉淀方法可以通过改变沉淀条件来进行定量研究，如优化抗体和载体蛋白质的浓度，改变洗涤条件等。
4.多样性：免疫共沉淀可以与其他技术（如质谱分析等）相互结合使用，从而得到更加全面的分析结果。
尽管免疫共沉淀是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，但也存在一些限制，如需要特异性较好的抗体、样品准备以及沉淀物的纯化等。
因此，在使用免疫共沉淀方法时，需要根据具体的研究目的和实验条件进行合理的设计和操作，以获得可靠和有意义的结果。
深层次了解免疫共沉淀(CoIP)
一、免疫共沉淀实验免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP），是以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
区别于IP实验，CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）二实验过程1、提取蛋白。
2、在细胞裂解液中加入抗X的抗体。
3、孵育后再加入ProteinA或G（于Agarose或magneticbeads等介质上）。
若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体一ProteinA或G"4、经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开°（xy抗原、x抗体）。
5、westernblot分析，质谱分析。
三、CO-IP特征优点：1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。
2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。
3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
局限性：1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；3、必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果四、实验的关键1、实验最需要注意点就是抗体的性质。
特别是多抗的特异性是问题。
2、为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。
3、考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
4、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
五、注意的问题：1、裂解液(1)、细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂(NP40或TritonX-100)。
免疫共沉淀实验方案
免疫共沉淀实验方案一、实验试剂和材料Dynabeads® Protein G(novex by life technologies)PBS pH7.4(含0.01%Tween-20)0.1M Na-phosphate（Washing Buffer）50mM Glycine pH2.8(Elution Buffer)二、实验步骤（一）准备磁珠1.将瓶子倾斜旋转5min左右，使瓶中磁珠悬浮；2.吸取50ul磁珠液于离心管中；3.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；4.从磁铁架上取下离心管；（二）结合抗体1.加入200ul用PBS(含0.01%Tween-20)稀释的抗体；2.室温旋转孵育10min;3.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；4.从磁铁架上取下离心管，用200ul PBS(含0.01%Tween-20)温和吹吸并重悬磁珠-抗体复合体；（三）免疫沉淀抗原1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；2.从磁铁架上取下离心管，加入抗原样品并温和吹吸，重悬磁珠-抗体复合物；3.室温旋转孵育10min，使抗原结合到磁珠-抗体复合物上;4.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；5.用washing buffer 3次洗涤磁珠-抗体-抗原复合物，弃上清；6.用100ul washing buffer重悬磁珠-抗体-抗原复合物，并将磁珠悬浮液转移到干净的离心管中，以避免蛋白抗原粘附在管壁上。
（四）洗脱抗原1.将离心管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清；2.加入200ul Elution Buffer至离心管中，温和吹吸并重悬磁珠-抗体-抗原复合物；（不要吹打出气泡）3.室温旋转孵育2min；4.将离心管置于磁铁架上，并将洗脱液（含有洗脱的抗原、抗体）转移到干净的离心管中，用于后续的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析。
免疫共沉淀研究生实验课
tag旳位置。将tag构建到蛋白旳N端还是C端，也是一种潜在 旳能够影响coIP成果旳原因。例如，分泌蛋白旳N端一般有 分泌信号肽，假如将tag构建到N端，则外分泌时会被信号肽 酶连同信号肽一起切除；所以这时必须构建在C端。再如， 多数蛋白旳C端是疏水区，有旳时候将tag构建在C端会影响 蛋白原来旳空间构造，如恰好C端同步是相互作用旳构造域， 某些时候还可能被遮蔽，从而干扰相互作用。所以，一般构 建质粒旳时候是N端、C端tagged同步分别构建，以备万一。
将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min ； 吸收上清液到新EP管中，每管加1μg 对照兔IgG，同步加入Protein
A agarose，4℃转鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min； preclear及其作用 一抗和相应起源旳normal mouse, rat, rabbit or goat IgG中有相同或 相同旳成份(如无关IgG) , 用一抗相应起源旳IgG与蛋白裂解液和 protein A－agarose能够清除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质旳 非特异吸附, 二是能够清除蛋白液中与protein A－agarose非特异结 合旳物质。做 preclear 旳IgG 是不针对特异性抗原旳。 琼脂糖珠旳选择 SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做旳凝胶。
4. 超声和冻融旳影响
诸多市售或自制旳裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等 手段提升裂解效率（超声要慎用，可能破坏弱旳相互作用）。
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采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相 互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种 细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。不能用高浓度的变 性剂（0.2％SDS)。 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶 抑制剂，低温下进行实验。 Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在 做磷酸化的信号转导时需添加。
蛋白的相互作用
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• Standard Techniques Glutathione-S-Transferase Fusion Proteins Affinity Tags Tandem Affinity Purification (TAP) Tags Strep-Tag III Quantitative Proteomics Chemical Crosslinking Two-hybrid Yeast Phage-display
2.使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG
3. 抗体用量的控制：1-4μg（通常用2 μg ）
免疫共沉淀
（co-immunoprecipitation）
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背景
• 据估计，人体中大约总共可产生500,000种蛋白，而单个细 胞可以产生 10,000 种。
• 在这些蛋白中，80%不是以独立的方式存在的，而是存在 于一个蛋白复合体中。
• 蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中，我们形象地 称之为通过节点（nodes）连接的枢纽（hubs）。
实验目的
• 学习并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法， 了解免疫共沉淀结果分析。
• 了解与免疫共沉淀相关的实验及进展
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概念及用途
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为
基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是
确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的
有效方法。
金标准
用途：测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也 可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
• Universal Verification of Interaction Techniques Co-Immunoprecipitation Confocal Microscopy
• Biophysical Verification of Interaction Techniques Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) GFP-Protein Proximity Imaging Microscopy (GFP-PRIM) Mass Spectroscopy (MS) Atomic Force Microscopy (AFM) Surface Plasmon R免e疫s共o沉n淀an研c究e生(实S验P课R)
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将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min ； 吸取上清液到新EP管中，每管加1μg 对照兔IgG，同时加入Protein
A agarose，4℃转鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min； preclear及其作用 一抗和相应来源的normal mouse, rat, rabbit or goat IgG中有相同或 相似的成分(如无关IgG) , 用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和 protein A－agarose可以去除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质的 非特异吸附, 二是可以去除蛋白液中与protein A－agarose非特异结 合的物质。做 preclear 的IgG 是不针对特异性抗原的。 琼脂糖珠的选择 SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
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抗体的选择：
1. 使用明确的抗体：实验最需要注意的就是抗体的性质。抗 体不同和抗原结合能力也不同，免疫细胞化学染色能结合 未必能用在IP反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗 的特异性是问题，确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉 淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有 助于避免污染的发生；
加入35 μl Protein A agarose，4℃转鼓转2h (10min) ； 1000g 4℃ 离心5min，PBS洗3次，加入40μl 2×SDS
Sample Buffer（125mM Tris•Cl pH6.8, 4%SDS, 20%Glycerol, 100mM DTT, 0.02%溴酚蓝）沸水浴中煮沸 5min； Western Blot检测样品，剩余样品-20℃保存。
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实验原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许 多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白 质 x 的抗体免疫沉淀 x，那么与 x 在体内结合的蛋白质 y 也 能沉淀下来。
YY
binding
wash
elution
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转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。 加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l，4℃ 转鼓过夜(10min)；
孵育液体积的控制：考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗 原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少则不能溶 解抗原，过多则抗原被稀释。
实验步骤
人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿，培养大约 90%以上融合后，倒掉培养液，PBS洗3次；
加入1ml Lysis Buffer（20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM βGlycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase，pH 7.5），冰上放置30min，裂解细胞；