一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化原理步骤及要注意的事项
免疫组化原理步骤及要注意的事项免疫组化是一种常用的细胞和组织学检测方法，通过利用免疫学原理，使用特异性抗体对目标分子进行检测，主要应用于分析蛋白质分子的表达，可以帮助研究者了解不同细胞和组织中蛋白质的分布和功能，对于疾病的诊断和治疗也具有重要意义。
下面将介绍免疫组化的原理、步骤及要注意的事项。
原理：免疫组化是利用特异性抗体与抗原发生特异性反应的原理来进行的。
主要包括两种反应：免疫定位反应和信号测定反应。
-免疫定位反应：通过组织抗原表面与抗体的结合，将目标分子定位于细胞或组织的特定位置。
-信号测定反应：将已定位的抗原-抗体复合物进行颜色或荧光标记，发出可见信号，用于检测和记录。
步骤：免疫组化的主要步骤包括标本制备、抗原修复、非特异性反应阻断、一抗染色、二抗染色和显微镜观察。
1.标本制备：选择合适的组织样本，常用的样本有组织切片、细胞涂片和细胞悬液。
样本制备主要包括取材、固定、包埋等步骤，其中固定是关键步骤，常用的固定剂有福尔马林、乙酸乙酯和交联剂等。
2.抗原修复：组织样本在固定过程中往往会导致抗原的空间结构改变和蛋白质交联，使其成为免疫组化的目标结构。
为了恢复抗原的免疫反应性，常常需要进行抗原修复，包括酶解法、消化法、热解法等。
3.非特异性反应阻断：为了减少非特异性结合，需要采取一些措施来阻断非特异性背景信号。
常用的方法包括用蛋白质阻断剂进行封闭、用牛血清白蛋白或BSA预处理等。
4.一抗染色：在经过上述步骤之后，用特异性抗体与目标抗原结合，构成抗原-抗体复合物。
为了增强抗原-抗体的结合力，常采用多种放大手段，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或二级抗体等。
5.二抗染色：一抗与抗原结合后，用特异性二级抗体进行检测，二级抗体上带有标记物（如荧光素、酶等），对抗原-抗体复合物进行定位。
6.显微镜观察：通过显微镜观察，检测特定信号的强度和位置，同时进行结果的记录和分析。
注意事项：-选择合适的抗体：免疫组化的关键在于合适的抗体选择，需要选择高度特异性和高亲和力的抗体。
免疫组化实验结果分析
免疫组化实验结果分析在免疫组化实验中，结果分析是一个关键的步骤，它能够帮助研究者准确评估目标分子的表达情况。
通过对免疫组织染色结果的观察和分析，我们可以了解到免疫反应的程度和位置，从而为研究提供有力的依据和指导。
本文将围绕免疫组化实验结果的分析展开讨论。
1. 实验结果描述在开始分析之前，首先要对实验结果进行描述。
描述应当包括样本编号、实验日期、染色报告等基本信息，并对结果进行文字描述，如颜色的强度、分布情况、阳性细胞数量等。
此外，还可以结合图像或照片进行结果展示，以便更直观地表达实验结果。
2. 染色结果的分析根据染色结果的颜色强度和阳性细胞的分布情况，可以分析免疫反应的程度和位置。
通常，颜色较深且阳性细胞较多的区域表示目标分子的高表达区域，而颜色较浅或无阳性细胞的区域则表示其低表达或无表达区域。
通过对颜色和阳性细胞数量的定量分析，可以量化目标分子的表达水平，并与其他样本进行比较和分类。
3. 阳性细胞计数和分布情况在免疫组化实验中，阳性细胞的计数和分布情况是结果分析的重要指标之一。
通过对染色结果图像的定量分析，可以计算出阳性细胞的数量，并使用统计学方法对不同样本之间的差异进行比较和验证。
此外，还可以通过细胞计数的分析，了解阳性细胞在组织中的分布情况，从而为目标分子的功能和作用机制提供线索。
4. 结果的统计学分析除了定性和定量分析，还可以使用统计学的方法对结果进行进一步的分析。
例如，可以计算平均值、标准差和标准误等统计指标，并进行方差分析和t检验等统计检验，以评估不同样本之间的显著性差异。
此外，还可以使用聚类分析、主成分分析等多元分析方法，对大规模的实验结果进行系统整理和分类。
5. 结果的生物学意义和临床应用最后，要将实验结果的分析归纳到生物学意义和临床应用上。
通过对目标分子的表达情况进行分析，可以了解其在生理和病理过程中的功能和作用机制，进而为相关疾病的预防、诊断和治疗提供新的线索和靶点。
此外，还可以将实验结果的分析与其他实验数据进行综合，构建更完整和准确的分子机制模型。
实验结果免疫组化结果解读
实验结果免疫组化结果解读
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织中特定蛋白质表达的技术。
通过对组织切片进行染色，可以观察到特定蛋白在组织中的分布和表达水平。
在解读免疫组化结果时，需要考虑以下几个方面：
1. 样本准备，首先需要确认样本的质量和处理是否符合实验要求。
样本的保存和处理对免疫组化结果至关重要，因为不恰当的处理可能会导致蛋白质的降解或者失活，影响最终的结果。
2. 阳性对照，在解读免疫组化结果时，需要对照阳性对照组织切片，确保实验条件和试剂的有效性。
阳性对照通常是已知含有目标蛋白的组织切片，用于验证实验条件和试剂的有效性。
3. 组织结构，观察组织切片的整体结构和形态，确保实验过程中组织的完整性和准确性。
免疫组化结果需要在正确的组织结构基础上进行解读，以排除可能的伪阳性或伪阴性结果。
4. 染色结果，观察组织切片的染色结果，包括颜色强度、分布和细胞定位。
根据染色结果的强弱和分布情况，可以初步判断目标
蛋白在组织中的表达水平和分布情况。
5. 数据分析，将染色结果进行定量分析，通常使用图像分析系统或者手动计数的方式进行。
通过定量分析可以得到目标蛋白的表达水平，进一步验证免疫组化结果的可靠性和准确性。
6. 结果解读，根据样本准备、阳性对照、组织结构、染色结果和数据分析，对免疫组化结果进行综合解读。
需要考虑目标蛋白在组织中的表达水平和分布情况，结合实验条件和其他实验结果进行综合分析。
综上所述，解读免疫组化结果需要综合考虑多个因素，包括样本准备、阳性对照、组织结构、染色结果、数据分析和综合解读，以确保结果的准确性和可靠性。
如何判定免疫组化结果的注意事项
如何判定免疫组化结果的注意事项免疫组化，这个名字听起来很高大上，乍一看可能让你觉得好像离你很远，但它和我们生活中的小细节息息相关。
尤其在做一些疾病的检测时，这项技术的作用可不小。
而如何判定免疫组化结果呢？嘿今天我就带大家聊聊那些你应该知道的“注意事项”，免得在读结果的时候一脸懵逼。
放心，通俗易懂，绝对不让你觉得像在听天书。
一、咱得弄清楚什么是免疫组化免疫组化，说白了，就是通过抗体和抗原的特异性反应，找出组织或细胞里某些特定的蛋白质。
对，就是这么神奇的事儿。
想象一下，你在一个大大的舞会上找一个穿红裙子的人，免疫组化就像是你手里拿的那张“红裙子”的邀请函，帮你一眼就找到了目标。
话说回来，这个“红裙子”的效果可得靠谱，免疫组化结果判定起来也是有不少“门道”的。
搞懂了基本原理，再看结果才不至于抓瞎。
二、抗体的选择真不能马虎第一条，小心选抗体！抗体，哎呦，听着就像是个神秘的生物武器。
事实上，它的作用可是至关重要的。
你选错了抗体，相当于你给了一张假票，让它去找你想要的蛋白质——结果，什么都没找着，甚至误伤无辜。
选择抗体时，首先要了解它的特异性，这点至关重要。
别以为“抗体”这俩字好像很简单，实际上它要精准地认出那个小小的蛋白质，像侦探找证据一样，不能有一丝偏差。
只要选对了抗体，后面那一切就能顺理成章了。
三、结果的判断细节很重要就是大家最头疼的结果判断啦。
免疫组化的结果并不是看一个“是”或“不是”那么简单。
它讲究的是“阳性”还是“阴性”，而且不仅如此，还得看染色的强度、位置和分布。
比如染色的强度不够，就像灯泡发出的光太弱，想看看东西可难了；如果某个区域染得特别重，那么你得考虑这个位置的蛋白质是不是过量表达了。
哦，对了，还有染色的范围！要是染色结果只在某个小区域，可能说明目标蛋白仅在局部区域存在，结果怎么能就这么草草得出呢？然后就是分型问题。
某些时候，结果的呈现可分为多种类型：细胞质染色、细胞核染色、甚至细胞膜染色。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。
该技术的原理基于抗体与其特异性抗原结合的特性。
下面将详细介绍免疫组化的步骤。
第一步，固定组织：将待检测的组织或细胞固定在载玻片上。
常用的固定剂包括甲醛和乙醛，可通过浸泡、喷洒或滴加等方式施加在组织上，使细胞和蛋白质保持其形态和结构。
第二步，脱水：将固定的组织经过一系列浓度逐渐升高的酒精溶剂中处理，以去除水分，使组织逐渐与酒精混合。
第三步，脱脂：将组织在适当的溶剂（如二甲苯或苯）中脱脂，以去除酒精和脂质。
第四步，石蜡浸渍：将脱脂的组织浸泡在液态石蜡中，使其渗透并替代脱脂剂和二甲苯，然后固化组织。
第五步，切片：使用微tome切割固化的样本，制备出薄片，常见的切片厚度为4-5μm。
第六步，脱离：将切好的薄片与载玻片分离，常用的方法是利用热水浸泡薄片，使其松散分离。
第七步，抗原修复：利用高温和压力的方法，如蒸汽煮沸或压力锅，对薄片上的蛋白质进行解散，以恢复其免疫活性。
第八步，阻断非特异性结合：使用一些蛋白质如牛血清蛋白、动物血清或其他蛋白质来包裹薄片上的非特异性结合位点，以减少假阳性反应。
第九步，抗体处理：将特异性抗体加到薄片上，与待检测的蛋白质结合。
抗体可以是原代抗体（直接与靶蛋白质结合）或二抗（与原代抗体结合）。
第十步，洗涤：用缓冲液洗去未结合的抗体，并去除阻断剂和非特异性结合物。
第十一步，检测：将检测试剂滴加到薄片上，以产生特定色素或荧光信号。
常用的检测方法包括酶标法（如辣根过氧化物酶法，HRP法）和荧光标记（如荧光素酶法，AP法）。
第十二步，显微镜检查：使用显微镜观察薄片上的染色结果，评估标记物的定位和表达情况。
通过上述步骤，免疫组化技术可以帮助研究人员检测并定位组织或细胞中感兴趣的蛋白质。
其广泛应用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域，为揭示疾病的分子机制和开发新的治疗手段提供了重要的工具。
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导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：“想拿高分文章，不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话：“是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。
”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲......
免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry），是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。
免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。
石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。
免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。
但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。
这实在是一件憾事。
如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。
结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。
前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）
和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。
免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。
1.对照染色
和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。
没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。
对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。
一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。
2.定位
抗原表达必须在特定部位。
如LCA应定位在细胞膜上；CK 应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。
不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。
有可能是非特异性染色或者假阳性。
不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。
3.半定位
现在一般用图像分析系统进行定量。
如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。
因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。
免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。
以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和
亮绿色耀眼荧光。
弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。
至少随机观察5-10个HPF。
然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值1.5者为(+++)。
4.
图像分析仪
如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析仪。
图像分析仪类型很多。
这里就不一一介绍了。
其实毛博最想隆重推荐的是一款图像分析软件：Image J。
毛博当年在米国做博士猴的时候，就是用的这款软件。
这是NIH开发的免费软件。
一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。
现在已经开发到了1.50版。
网上可以免费下载。
其界面非常简洁，如下图所示。
现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。
如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。
那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。
步骤如下：Image→Type→16-bit。
转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。
步骤如下：Image→Adjust→Threshold。
然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。
有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。
这个时候可以采用Image J的水洗功能。
步骤如下：Image→Binary→Watershed。
如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成了2个细胞。
然后，就可以正式开始分析了。
步骤如下：Analyze→Analyze Particles。
在得出最后的结果之前，
还有一些选项需要选择。
如果想要计数全部的细胞，那么Size 项里面选择“0-infinity”。
Circularity的默认值为“0.00-1.00”。
一般就取默认值。
最后的结果如下图所示。
软件自动测量了每个细胞的大小。
这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。
然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。
免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。
大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望得出自己想要的结果。
以上，毛博介绍了一些自己的心得体会。
希望广大的实验狗们都能做出自己想要的结果，早点发文章。
非特异性染色的八大原因然而，结果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种状况，好好的一张片子染得脏脏的，这就是最常见的非特异性染色。
1. 抗体问题，真的是一分钱一分货啊！
一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。
尤其是背景非特异性染色不会太深。
真是一分价钱一分货。
一抗过期也会造成杯具，所以要注意抗体的有效期。
2. 抗体浓度过高/孵育时间过长一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。
解决的办法就是预实验。
每次使用新抗体前应该多做预实验，摸索出最理想的工作浓度，不能简单地按照说明书来用。
另一个常见原因就是孵育时间过长。
解决的办法就是定时器。
加上抗体后，立刻调好定时器，提醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。
3. DAB染色时间太长/变质DAB的孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。
DAB的显色时间不是一成不变的，主要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马上冲洗。
出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。
DAB要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。
图1就冲洗的有些晚了；图2就是刚刚好，染色效果棒棒哒!
4. 内源性酶和生物素内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是一些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。
处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用50 mmol/L的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用0.9%的双氧水来灭活。
对于内源性生物素，染色前将切片浸于25 μg/mL亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
也可以24 mg/mL的卵白素封片15分钟。
5. 组织变干
一下子染太多片子的时候，容易出现这种情况。
解决的办法就是不要贪多嚼不烂。
一次少染几张。
还有就是试剂充分覆盖组织，超出组织边缘2 mm。
然后用PAP笔在组织周围画
一个圈圈，把修复液圈在里面。
避免修复液流走。
圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。
6. 浸泡时间过长
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。
这都是偷懒的做法。
但是有时候也是可以偷一下懒的。
毛博的独门秘技就是4°C冰箱。
只要把容器放在4°C冰箱里，过夜完全没有问题。
7. 清洗不充分
清洗一定要充分。
PBS液一定要双蒸水新配，用之前再次测PH值。
缓冲液用0.05 mol/L的Tris-HCL，0.15 mol/L的NaCl 即可。
如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。
8. 封闭血清问题
是否选择了正确的封闭血清。
原则是选择二抗动物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。
用PBS 稀释为3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分钟。
这里不用洗，直接甩掉即可。
毛博再贡献一个独门绝招，直接用奶粉也可以。
用5%的脱脂奶粉就可以了。
而且效果还不错。
怎么样？简单吧。
师傅领进门，造化看个人了。