胸苷激酶 1(TK1) 及其在临床肿瘤学中应用

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素标记胸苷或 BrdU 的方法，需要在活细胞中进行，仅仅是限于研究工作和有限的患者检测，而 且，流式细胞计的技术不可能鉴别细胞周期中 G0-G1 期的增殖细胞和非增殖细胞。加之， S 期细 胞 成 分 复 杂 ， 也 不 可 能 用 流 式 细 胞 计 的 技 术 分 离 恶 性 肿 瘤 细 胞 和 良 性 肿 瘤 细 胞 (5-6) 。
(四).胸苷激酶 TK1 与细胞周期调控
细胞周期的定义是指一个细胞分裂为 2 个细胞的过程， 这过程需要的 DNA 合成的 4 中核甘酸之一， dTTP。其必需前体物之一，dTMP 的合成是通过一系列复杂生物合成途径进行的，称为体内合成途径 (de novo synthesis) ， 起 始 于 细 胞 中 现 有 的 原 料 ， 天 冬 氨 酸 (aspartate) 和 氨 基 铣 磷 酸 (carbamoylphosphate)，通过一系列复杂生物反应生成 dUTP，最后由胸苷酸合成酶 (thymidylate synthatase) 转化 dUDP 为 dTMP。TK1 酶并不是一必需的酶，提供体内细胞 DNA 合成所需要的前体 物 dTMP。但与体内合成途径比较，TK1 酶合成 dTMP 是直接采用细胞中核甘酸再循环方式，在增殖细 胞和肿瘤细胞中， 具有活性催化的功能的四聚体细胞质胸苷激酶(TK1)，其催化反应过程是在 ATP 作为供体和镁离子 (Mg++)参与的条件下，催化脱氧胸苷(Thd) 生成一腺胸苷酸 (TMP)，这种磷酸化 方式是唯一的通途引入 Thd 到 DNA 合成代谢中。这种方式是远远补了肿瘤细胞异常增殖时的需要的 DNA 的合成。如此，TK1 酶被称为一种嘧啶补救合成的 DNA 的关键酶 (55) 和 S-期特殊酶 (39) 。
图 1. 肿瘤细胞循环周期中 TK1 的浓度升降与 DNA 合成速度相关的模式图
通过免疫组化，基因组学和蛋白质组学等技术对组织活检样本分析，可以检测到肿瘤细胞中许 多与生长相关联的蛋白质或酶的水平异常改变,检测患者肿瘤疾病期中的异常蛋白质或酶升降水平， 进行相关性分析(1,9) ，评估肿瘤手术全切除后的效果，将给疾病复发风险和评估提供有意义临床参 数。 现使用的例如,Ki-67 和 PCNA (增殖细胞核抗原 ( Proliferating Cell Nuclear Antigen) 是一细胞周期 相关的蛋白质， 也是广谱型适用于组织化学检测细胞增殖的好的标志(9-11) 。 PCNA 出现在 G1 的晚 期和 S 期的早期， 有时在 G0 期表达为假阳性(9)， 但没有文献说明 Ki-67 与 S 期细胞增殖正相关的关 系。这两种抗体仅仅可以适用于新鲜组织和石腊包埋的组织标本，也取决于当时标本的细胞增殖比 例。采用不同的固定方法比较，但 PCNA 的灵敏度不如 Ki67(11)。 据报导有与 DNA 合成的相关的 酶，例如 DNA 聚合酶或核苷酸还原酶抗体，但尚未成功应用于临床(8) 。此外,参与细胞周期调控的 细胞周期相关激酶 (Cyclin-dependent kinase)家系，例如细胞周期蛋白 (cyclin A, B, D 和 E) 等标志 (1)，现仅限用于研究工作，上述细胞增殖的标志都不适用于血清学检测。 但在血清中检测这类异常蛋白水平的变化，具有重要临床意义。基于肿瘤细胞增殖标志的理论 基础是由于肿瘤细胞失出正常细胞生长调控导致细胞恶性增殖，这一理论引导研究开发一种无损伤
A
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图 2.人 TK1 空间结构图。P 环和套索闭环，N 和 C 端位置显示在人 TK1 单体结构图 A 黄色示镁原子，灰色示锌原子。 B 图示人 TK1 四级结构 (53)。
TK1 在组织或细胞萃取液中在 4℃环境是不稳定的，可能与 TK1 4 聚体结构降解有关，如进行
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TK1 活性检测，需要 2-4 小时内尽快进行，如在 4℃保存样品超过 12 小时，活性将下降 50%左右。 如保存在-20℃以下，TK1 活性可以稳定 1-3 星期。纯化的重组人 TK1 需要保存在-80℃冷藏环境。 但 TK1 在血清是稳定的，在-20℃以下可以可保存 5 年以上，可稳定的检测 TK 活性和含量，仅有一 报导认为其稳定可能原因是，TK1 在血清中是与其它蛋白质形成一大分子稳定的复和物 ，分子量为 70 万(54)。关于血清 TK1 的结构和性质仍然是不清楚的，其中包括这酶在细胞内被破坏或者是由细 胞以活性或非活性的状态被分泌出去。 有关血清胸苷激酶特点和结构理论问题仍待进一步深入研究。
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胸苷激酶研究的历史 早在 60 年代，1956 年的报告指出，DNA 合成之前，TdR 摄入细胞并转化为 TMP 必须有磷酸化激 酶催化 (16)。1958-60 年代，在真核 (17-21)和原核生物(22)分离和部分的纯化 TK 酶以后，确认 了这磷酸化反应过程是必须有 TK 酶的催化。研究了不同来源组织的细胞 TK 的酶的特徵，活性与增 殖度的关系(23-29) ， 并发现病毒 TK 有特定的编码(30-31)。 人细胞中 TK 以两种同功酶的形式出现， 由于其中一种同工酶大量存在于胚胎，分别称为胚胎 TK(Fetal TK)和成人 TK(Adult TK)，其后研究 发现胚胎 TK 是与细胞的分裂相关，存在于细胞质中，反之，成人 TK 存在于线粒体中，它的表达与 细胞周期无关。 将前者称为细胞质胸苷激酶， 后者为线粒体胸苷激酶， 分别简称为 TK1 和 TK2(32-34)。 在 70 年代中期，公布了这 2 种 TK 同工酶的基因在染色体的定位，TK1 基因定位在于染色体 17q23.2 –q25.3,靠近半乳糖激酶(35)，TK2 基因定位于染色体 16q22–q23.1(36)。已报导 TK 基因经常表现 为多型。推测，辐照剂量等原因影响染色体不平衡，增进了这个核苷酸酶进人补救途径，可能是致 癌的基本原理之一(37-38)。70 年代以来至今，TK 酶的研究引起了广泛的关注，特别是 TK1 与细胞 增殖的密切相关特徵，在非增殖细胞和健康人血清中，含量极微或检测不到,但在恶性肿瘤患者中伴 随着肿瘤细胞的急剧增殖而升高。认为 TK1 可以作为一种好的血清学细胞增殖标志来检测增殖细胞 的增殖活性，适用于恶性肿瘤的细胞增殖度检测。目前涉及 TK 各个方面研究已有1 十分相关的文献以及我们瑞典 TK1 研究组研究报告，综述关于 TK1 生物化学 基础研究，与细胞周期调控机理，TK1 与病毒系，TK1 肿瘤实验学，TK1 检测方法，TK1 抗体制备和 临床应用研究。
(三). 胸苷激酶 1 酶结构 上世纪八十年代，人 TK1 的基因的编码区域的 cDNA 已经分子克隆 ，并且完成了序列分析 (39-40)。纯化的人宫颈癌(HeLa)其单体的转录编码为分子量 2.4 万并具高度保守区域的核苷激酶 (39)，TK1 全酶是分子量为 9.6 万的四聚体(41-43), 类同于人淋巴瘤)TK1 酶 (44-45)和人 TK1 酶 的家系(46) 等。免疫电泳表明 TK1 的为一单带的 4 聚体 (47-49)。等电点为 8.3-8.5 (47，50-51)。 自 1985 年来瑞典 TK1 研究组 Eriksson 等致力研究 TK1 的分子结构 (52-53)表明，人和支原体(54) TK1 四聚体和单体与人 TK1 十分相近 。TK1 酶的四聚体的晶体结构于 2004 年公布(53)。这酶的四聚 体中每一单体α螺旋/β折叠区域组成与 ATP 酶家系类似，有一 p-环 (p-loop) 是 TK1 酶活性调节 区域，即底物反应区域。 但四聚体中β折叠区域有一锌原子与β折叠区域连接，在这β-丝状带折 叠的底部，干链变宽成为一个套索闭环 (lasso-loop), 是 dTTP 负责 TK1 活性反馈抑制调节的的区 域 (图 2)。由于物种进化来源，TK1 这套索环结构是不同于其他的脱氧核甘酸激酶。
(二).胸苷激酶的概念
胸苷激酶的命名 胸苷激酶(TK)的酶学命名为 ATP: thymidine 5´-phosphotransferase, EC. 2.7.1.21，腺苷三 磷酸:胸苷 5 -磷酸转移酶，EC.2.7.1.21, 简称 胸苷激酶 TK，是一种嘧啶补救途径的激酶 (15)， 在 ATP 为供体和镁离子 (Mg++)参与的条件下 ，催化脱氧胸苷 (thymidine Thd) 为一腺胸苷酸 (TMP)(15)。
Sven Skog,Ellen He, Ji Zhou et. Al., in:
李春海，肿瘤标志学基础与临床， 李春海。 第 57 章：
胸苷激酶 1(TK1)及其在临床肿瘤学中应用, 2008.
军事医学出版社，2008
一. 胸苷激酶 1(TK1)生物学特性
(一). 胸苷激酶 1 是细胞增殖性激酶 癌症是导致人类死亡的杀手。死亡人数每年在增加。尽管近年来化疗，手术，放疗和内分泌 治疗等，已经有了很大的进步，但远远不可能达到肿瘤的根治，并有复发和转移的可能。因此， 早期的发现和早期的治疗将给予患者康复最佳的福音 癌症是一种细胞异常增殖疾病。当正常细胞生长调控失控，导致细胞恶性增殖，称为癌细胞。 按照现有研究，癌细胞异常或失控的增殖是由于正常细胞的某种或多重突变的与增殖相关的基因 引起的，因此，正常细胞中与生长相关的基因突变最终的导致相关的癌蛋白的过度表达，阻抑蛋 白的缺失或突变蛋白产物表达，并伴随一系列与细胞生长相关的酶和蛋白质调节失控.近十年， 调 控正常细胞生长相关的生物学进程细节已研究地更为详尽。使我们更深入的理解了细胞周期，细 胞凋亡和信号传导细节，包括细胞周期调控和细胞增殖过程中的胞质分裂素酶类及细胞周期相关 激酶类，血清生成素和细胞粘连素与正常细胞生长，肿瘤细胞增殖，以及正常细胞凋亡途径如何 控制细胞的增殖之间的关系。 另外，我们对这些基因涉及到生物学过程的机理以及它们的蛋白质产物表达也有了更好的认 识。特别是胞质分裂素和生长因子受体相互反应，在细胞增殖和分化调控过程中是如何通过信息 传导途径进行的；原癌肿瘤蛋白质，抑制蛋白质，和转录因子等是如何通过信息传导途径，进行 信息调节，即如何调节细胞活素和生长因子，直至激活基因组和进行蛋白质质合成。所有这些信 息将帮助我们分析致癌基因以及相关的各种异常生长状况，并使我们理解为什么正常细胞失去正 常生长调控，导致肿瘤细胞恶性增殖的原因 (1)。 由于体内恶性肿瘤细胞的增殖不是按照正常细胞的 2 倍体分裂方式，根据这种无休止恶性分 裂的肿瘤细胞特征，建立了肿瘤细胞增殖标志的理论基础。早在上世纪 50-60 年代，通过体外培 养细胞，观察到胸苷(Thymidine, 简称 Thd)参与到 DNA 合成(1-3)。放射性同位素标记的胸苷 (放 射自显影) 或胸苷的类似物可以检测肿瘤细胞中 DNA 合成速度，发现细胞 DNA 的复制仅仅限定 在细胞周期一特定时期，即称为 S 期 (Synthetic phase) (1)，见 图 1。 这种同位素标记方法检测 肿瘤细胞中 DNA 合成速度，计数细胞周期中 S 期细胞数增殖的比例，已被应用于检测细胞的增 殖速度，可用于对患者肿瘤细胞增殖度的检测和评估患者预后的十分有意义的参数 (3-6)。S-期细 胞增殖指数高预示患者肿瘤预后差，一例检查为高恶性度早期复发膀胱癌患者，其 S 细胞指数高 达到为 46.9%(9)。以后采用胸苷的类似物溴代尿苷(BrdU)的摄入法以及它的抗体应用到流式细胞 DNA 检测仪 (4-8)， 定量检测 DNA 合成的速度与 S 期细胞增殖的速率相关性。但使用这种同位