TK基因可编码胸苷激酶
neo基因
neo基因
neo基因同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。
neo基因胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC，也称为鸟嘌呤）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和 GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因 Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。除了上述方法外，还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞。
骨肉瘤基因治疗研究进展
围际骨科学杂志２００９年１１月第３０卷第６期ＩｎｔＪ（）ｒｔｈｏｐ．Ｎｏｖｅｍｌ）ｅｒ２５．２００９．Ｖ０１．３０．Ｎｏ．６
骨肉瘤基因治疗研究进展
孙廓张键陈统一
摘要新辅助化疗结合手术（截肢或保肢）使骨肉瘤患者５年生存率提高至５（）％～６５％，但仍有近三分之一原发病变患者及８（）％有转移病变患者会复发，复发患者生存率近２【）年未见明显改善。近年随着分子生物学研究的发展．对骨肉瘤发生机制在分子水平有了一定认识，骨肉瘤综合治疗．尤其是基因治疗研究也有一定进展。该文就骨肉瘤基因治疗载体、抗骨肉瘤血管生成基因治疗、促骨肉瘤细胞凋亡基因治疗、骨肉瘤免疫基因治疗及自杀基因治疗等研究进展作一综述。关键词骨肉瘤；基因治疗；载体；腺病毒
骨肉瘤是骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤，尽管
新辅助化疗结合手术治疗（截肢或保肢）已可将５年生存率提高至５０％～６５％，但近ｔ分之一患者会发生肺转
移１。基因治疗是将人正常基冈或有治疗作用的荩因
（靶基因）通过载体导人人体靶细胞，以纠正基因缺陷或
发挥治疗作』｝Ｊ。达到治疗疾病目的的一种生物医学高科技疗法。近年随着分子生物学研究进展，对骨肉瘤的综
合治疗，尤其足基因治疗研究取得了一定进展。目前针
对骨肉瘤开展ｒ抗肿瘤１０Ｌ管牛成、促进肿瘤细胞凋亡及
免疫基冈治疗等多种研究。
ｌ骨肉瘤基因治疗载体
目前应用于肿瘤基凶治疗的载体，包括病毒载体和｛｝病毒载体两大类。
病毒能自然感染细胞。从而将自身的遗传物质带至
宿丰细胞，具有高效、大容避等一系列特点，目前已，“泛
用于基因治疗研究。逆转埘乏病毒（ＲＶ）具有基凶表达持
久稳定、转染效率高等优点，也足卣‘例临床基因治疗所应用的载体。ＲＶ只能感染分裂期细胞，且与宿主细胞基凶
组的随机整合町引起基冈突变等危险，故需进一步完善。
腺相关病毒（ＡＡＶ）能在辅助病毒存在的情况下有效
地表达转移性ＤＮＡ。但随着研究的深入，发现８５％的正常人存在抗～ｗ抗体，另外单链ＡＡＶ进入细胞后需转
变为双链。而此转变受很多因素的影响。因此，ＡＡＶ表达水平虽然逐渐上升，但最高表达水平仍较低一］。腺病
肝癌HSV—tk／GCV自杀基因治疗系统的增效策略
肝癌HSV—tk／GCV自杀基因治疗系统的增效策略
HSV-tk/GCV系统在临床当中的应用日趋完善，不仅应用范围越来越广泛，同时也逐渐成为了提高治疗效率的重要措施之一。但是伴随着临床应用资料的不断增加，HSV-tk/GCV系统也表现出一定程度上的缺陷，因此需要通过其他领域的共同研究对临床治疗方案进行改进与补充，将治疗效率进行强化与提高。目前的增效策略当中包括了亲和性的强化、表达水平的提高、免疫系统的协作、双自杀基因的联合使用、细胞周期的全面激活、各类肿瘤的治疗方案融合等内容。本次研究将针对HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统在肝癌当中的增效策略进行多重分析，同时对其未来的发展提出可行性建议。
标签：自杀基因；治疗系统；肝癌；基因治疗
在目前肝癌的临床治疗当中，基因治疗的方案得到了长远的发展空间，这种治疗方法的内容包括对致癌基因进行抑制，将肿瘤抑制基因予以激活，进而使得肝癌细胞逐渐凋亡，或者是采用自杀基因予以临床治疗。现阶段的自杀基因治疗系统日趋多样化，其中以单纯疱疹病毒胸苷激酶/9-鸟嘌呤系统的应用领域最为广泛，尤其是对于肝癌的治疗理念已经逐渐成熟[1]。但是到目前为止，肝癌患者采用该系统进行治疗后并未发现治愈的临床效果，因此亟待需要大量的方法与措施对自杀基因治疗系统进行进一步的完善，使其在临床当中的治疗效率提高至最大化。
1 HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的基本原理
Ganciclovie是一种单纯的无毒物质，通过磷酸化作用后可以转化为毒性GCV-TP，不仅以三磷酸为主要形式，同时还能在DNA的复制过程当中与dGTP之间形成一种竞争，进而插入DNA。其中3′-羟基的欠缺将会导致DNA链在后续的变化当中无法形成磷酸二酯键，进而终止病毒DNA链的继续延伸，起到了抑制肝癌细胞继续扩散与病毒DNA的复制、增殖作用[2]。胸苷激酶TK为人体神经系统当中隐藏的单纯疱疹病毒1所表达的产物，能够作为GCV进行单磷酸化的一种催化剂，促进毒性GCV-TP的转化效率。基于这种理念，绝大多数的医疗机构在进行相关项目的科研当中采用HSV-tk/GCV组合系统对肝癌进行基因治疗，但是由于对于HSV-tk/GCV的细胞死亡诱发机制尚不明确，因此一直在临床治疗当中无法取得决定性的突破与进展，部分相关学者与专家认为在HSV-tk/GCV的组合系统当中对细胞内部片段DNA进行处理的过程当中，有可能导致细胞基因系统产生较为显著的混乱现象，进而起到诱发并加快细胞凋亡的作用。最近的临床应用资料表明，HSV-tk/GCV作用于淋巴组织当中的囊状癌细胞时，有可能通过caspase-3通路诱发癌细胞的凋亡。
研究线粒体DNA表观遗传学进展
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研究线粒体DNA表观遗传学进展
1 mt DNA表观遗传学修饰及其作用
1.1 mt DNA表观遗传学修饰酶
DNA甲基化通常抑制基因启动子的活性, 从而影响基因的稳定性, 在哺乳类动物mt DNA也存在5-甲基胞嘧啶 (5m C) 和5-羟甲基胞嘧啶 (5hm C) , 其甲基化亦存在于Cp G二核苷酸之外的区域。
1971年在线粒体内发现含有形成5m C所必需的DNA甲基转移酶 (DNMT) , 表明mt DNA可能含有5m C[3]。随后证据表明, 哺乳动物mt DNA存在5m C, 而mt DNMT1是靶向线粒体序列的核编码DNMT1内源性等位基因, mt DNMT1负责mt DNA胞嘧啶的甲基化, 并参与对mt DNA转录因子的表达调控[4,5]。
除mt DNMT1外, DNMT3A和DNMT3B也参与线粒体表观遗传学调控作用, 具有氧化还原依赖性DNA的去羟甲基化能力, 在特定情况下, 能够将5hm C去羟甲基化[6]。DNMT3A/3B旁系同源物DNMT3L能与DNMT3A/3B相互作用而促进mt DNA发生甲基化。5m C转换为5hm C需要TET酶 (TET1~3) 和Fe2+依赖加双氧酶的催化, TET后续催化5hm C转换成5-甲酰胞嘧啶 (5-f C) 和5-羧基胞嘧啶 (5-ca C) , 这是2种衍生的表观遗传产物, 能够在胸腺嘧啶-DNA糖基化酶和碱基切除修复途径中使5hm C还原为胞嘧啶 (甲基化循环) 。
1.2 线粒体表观遗传修饰产物
1.2.1 mt-5m C:
mt DNMT1表达以及由mt DNA编码RNAs的水平受mt-5m C的影响。mt DNMT1改变会影响mt DNA轻链和重链转录表达, 并与重链上的NADH脱氢酶亚基1
(ND1) 转录增强及与轻链上ND6的mRNA表达降低有关, 可能因为mt-5m C能对基因启动子产生抑制作用, 或某种替代机制能够增强基因表达。mt DNA重链第2个启动子的转录受到线粒体转录因子A (TFAM) 的抑制, 而mt-5m C可能影响TFAM的转录位点和后续转录反应[7]。mt-5m C在重链保守区域 (CSB-Ⅲ) 中的启动子区域, 位于D-loop的5末端, 在重链复制过程中影响RNA引物[8]。mt
血清胸苷激酶1检测及其在肿瘤治疗监测和预后中的作用
・１０２２・广东医学２００８年６月第２９卷第６期ＧｕａｎｇｄｏｎｇＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌＪｕｎ．２００８，Ｖ０１．２９，Ｎｏ．６
血清胸苷激酶１检测及其在肿瘤治疗监测和
预后中的作用
陈曲波１刘瑞萍１黄惠１李强１张健媛１郑松柏１李倩琚１荆宁２郑丽２
１广东省中医院检验科（广州５１０１２０）；２华瑞同康生物技术（深圳）有限公司（广东深圳５１８１０１）
【摘要】目的探讨胸苷激酶ｌ（ｓＴＫｌ）在肿瘤诊断和预后判断中的价值。方法利用免疫印迹增强化学发光法检测肿瘤患者组、良性疾病组和正常对照组的血清ｓＴＫＩ浓度及阳性率。结果ｓＴＫＩ诊断肿瘤的灵敏度是
７４．１％，特异度是９７．３％；肿瘤患者组ｓＴＫＩ浓度为０．９９～４０．６３ｐｍｏｌ／Ｌ，平均浓度为４．７０ｐｍｏｌ／Ｌ，阳性率７４．１％，明显高于良性疾病组（浓度为Ｏ．５４—７．１４ｐｍｏＬ／Ｌ，平均浓度为１．７０ｐｍｏｌ／Ｌ，阳性率１８．１％）和健康人对照组（浓度为Ｏ．１４—２．１５ｐｍｏｌ／Ｌ，平均浓度为０．５３ｐｍｏｌ／Ｌ，阳性率２．７３％），差异有显著性（Ｐ＜０．００１）；肿瘤患者未经治疗组、治疗效果不佳组与治疗缓解组ｓＴＫＩ平均浓度比较，差异有显著性（Ｐ＜０．００１）。结论血清胸苷激酶ｌ是肿瘤诊断和预后判断的有价值的指标。【关键词】胸苷激酶ｌ肿瘤标志物免疫印迹增强化学发光法
肿瘤是当今世界严重威胁人类健康和生命的一种
细胞异常增殖性的恶性疾病。长期以来人们致力于寻
找一种能够尽早检出恶性肿瘤的指标，并在将血液或
体液、组织液中已经发现的一些物质称之为肿瘤标志
物（ｔｕｍｏｒｍａｒｋｅｒ，ＴＭ）。胸苷激酶１（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ
一１，ＴＫｌ）是一与细胞ＤＮＡ合成及细胞增殖密切相关
的关键酶，其水平在细胞周期的合成前期Ｇ１和合成期
Ｓ期交界处开始升高，直至Ｓ期和合成后期Ｇ２期交界
处达到高峰。由于ＴＫｌ水平与细胞生长状态相关，故
ＴＫＩ可作为一种细胞增殖标记物来检测细胞的增殖活
TK1检测项目指导手册
. . . ..
.. .
.s. . ..
... 第一部分 项目运行意义概述
胸苷激酶1简称TK1，是一种国际公认的细胞增殖特异性标志物；它参与DNA补救合成途径,是DNA合成的特殊标志酶。临床上,可用于监测和评估体细胞的异常增殖速度。
健康人细胞多处于静止状态（非增殖细胞），血清中的TK1酶含量极微，而随着增殖类疾病的发生，尤其是肿瘤、组织异常增生类疾病，细胞发生过度增殖，血清中TK1酶的含量出现显著升高，超过健康人平均水平2倍甚至100倍以上。所以，通过检测血清中TK1浓度水平的变化，能够敏感地发现细胞增殖异常，动态评估细胞增殖发展趋势，为提前干预治疗高风险癌前病变，遏制肿瘤进程提供重要信息。
在瑞典卡罗琳斯卡大学(诺贝尔医学和生理学奖评审机构)二十多年的研发基础上,华瑞同康生物技术（）与瑞典Karolinska大学TK1研究团队共同研制出高灵敏度的胸苷激酶1（TK1）细胞周期分析试剂盒及CIS系列化学发光数字成像仪，该系统是世界上唯一用于临床检验血清中TK1浓度的产品，其特异性高于95%,对各类增殖性疾病的综合检测灵敏度高于70%。
该系统已在多临床领域得到较为广泛地应用：
1、独立的肿瘤预后因子：多国家，多机构的研究表明，TK1是优选的预后评估指标，可作为独立的肿瘤预后因子；
2、动态评估手术、放化疗效果：能够对各种实体肿瘤（例如：肺癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，食道癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌等）以及白血病和淋巴癌患者的治疗效果进行评估，为治疗方案的改善提供参考；
肿瘤的基因治疗(综述)
肿瘤的基因治疗
《摘要》 随着分子生物学的发展，肿瘤基因治疗实验研究和临床应用都有了很大进步。本文就抑癌基因治疗，免疫基因治疗，药物敏感基因（自杀基因）治疗，多药耐药基因治疗，肿瘤血管基因治疗五种策略，从其理论基础和相关实验研究进展进行了分析。
《关键词》 肿瘤 基因治疗
恶性肿瘤传统疗法如放疗、化疗、手术治疗的局限性促使人们寻找新的抗肿瘤方法。现已证明，肿瘤的发生与某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变导致细胞增殖分化和凋亡失调有关。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。基因治疗具有特异性、敏感性以及明确的作用机制等诸多优点, 使其在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用
目前，肿瘤基因治疗的主要途径包括：抑癌基因治疗，免疫基因治疗，药物敏感基因（自杀基因）治疗，多药耐药基因治疗，肿瘤血管基因治疗等。
1 抑癌基因治疗
抑癌基因（tumor suppressor gene）又称抗癌基因（antioncogene）指正常细胞内存在的、能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。研究表明几乎一半人类肿瘤都存在抑癌基因的失活，因此可将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞，去补偿和代替突变或缺失的抑癌基因、逆转肿瘤细胞的表型、抑制癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡，以达到治疗的目的。野生型p53基因是目前研究最多的抑癌基因。，p53 有参与细胞周期调控；抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达，从而抑制肿瘤血管生成；降低mdr1/P-gp 的表达，上调TopoⅡa 的表达，逆转耐药性；增加放、化疗对肿瘤细胞的杀伤力。刺激机体的特异性抗肿瘤免疫反应等作用。研究发现,人类恶性肿瘤中至少有50%发生了p53 基因突变。恢复p53 的活性需要将野生型p53 引入到肿瘤细胞中， 通过腺病毒（载体）选择性地复制和降解将突变型p53消除，将突变型p53 修复为野生型，稳定p53，激活其他p53 家族成员来代替突变型p53 以及激活p53的野生活性，在体外、动物实验和临床前期研究已经达到预期效果。此外， P53 靶向治疗也存在一些问题。例如，如何消除野生型p53 对肿瘤的次级选择， 而不是下游区缺陷途径。
病理性瘢痕基因治疗的研究现状通
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病理性瘢痕基因治疗的研究现状通
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【关键词】 增生性瘢痕;瘢痕疙瘩;基因治疗;细胞因子
病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，目前国内外的研究尚未能很好地揭示其发病机制，临床防治也存在较大困难，成为了医学研究的难点和重点问题之一。近年来，随着基因工程技术的研究进展，病理性瘢痕的基因治疗成为研究的热点，现就其研究现状综述如下。
1 细胞因子基因疗法
目前的研究表明，各种细胞因子对创面愈合和瘢痕防治的作用不同，通过基因转染、基因敲除等手段，针对这些细胞因子的作用进行干预，可以达到防治瘢痕的目的。
1.1 转化生长因子β(TGF-β) TGF-β在瘢痕形成及发展中起着非常重要的作用[1]。Choi等[2]以反义TGF-β1核酸转染动物伤口，结果发现在给予反义寡核苷酸转染抑制TGF-β功能后，伤口瘢痕形成显著减少。liu等[3]用含有截短型TGF-β Ⅱ型(tTGF-βR Ⅱ)受体的腺病毒转染新生大鼠背部线性伤口，检测结果表明腺病毒介导的tTGF-βR Ⅱ可促进创伤愈合，减少瘢痕形成。 DOC格式论文，方便您的复制修改删减
Ashcroft等[4]证实Smad3 缺陷的小鼠上皮再生加快，瘢痕形成减少。Gao等[5]证实针对Smad 2的小干扰RNA转染能减少瘢痕疙瘩成纤维细胞的I、Ⅲ型胶原分泌。提示通过对TGF-β下游分子Smad进行干预，也能对抗TGF-β促瘢痕形成作用。
1.2 肝细胞生长因子(HGF) HGF可抑制肝纤维化组织中TGF-β1的产生，增强胶原酶的活性。Ha 等[6]以腺病毒载体将人的HGF转染兔耳增生性瘢痕，结果显示实验组瘢痕明显缩小，胶原成分也较对照组减少，而且有更多的毛囊和汗腺结构出现。
1.3 结缔组织生长因子(CTGF) CTGF在肝、肾、等器官纤维化中具有重要作用，是TGF-β的下游分子，能促进成纤维细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达[7]。
鸭瘟病毒强、弱毒株TK基因的克隆与序列测定
第２６卷第１期 ２００８年２月 石河子大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） Ｖｏ１．２６ Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２００８
文章编号：１００７—７３８３（２００８ Ｊ０１—０ｏ６４一ｏ４
鸭瘟病毒强、弱毒株ＴＫ基因的克隆与序列测定
谢秀兰 ，杨发龙 ，李阳友 ，岳华
（１西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都６１００４１；２川北医学院微生物与免疫学教研室，四川南充６３７０００； ３ ＪｌＩ￣ＩＬＮ学院实验动物中心，ｌ￣ｌＪｌｌ南充６３７０００）
摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的鸭瘟病毒 基因核苷酸序列，设计并合成了１对引物，分别扩增鸭瘟病毒标准强 毒株（ＤＰＶ＿Ｆ３４）和鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株（Ｃ－ＫＣＥ）的 ｒＫ基因，将它们分别克隆人ｐＢＳ－Ｔ载体，转化ＴＯＰ１０大肠杆 菌，对阳性的重组质粒进行序列测定。结果表明：ＤＰＶ—Ｆ３４与ＤＰＶ Ｃ－ＫＣＥ的 基因长度均为１０７７ｂｐ，编码３５８个氨 基酸，二者的核苷酸与氨基酸组成具有很高的同源性，分别为９９．４％和９８．９％。 关键词：鸭瘟病毒；ＤＰＶ—Ｆ３４；Ｃ—ＫＣＥ；ＴＫ基因；克隆；序列测定 中图分类号：￥８５８．３２ 文献标识码：Ａ
鸭瘟（Ｄｕｃｋ ｐｌａｇｕｅ）是由鸭瘟病毒（Ｄｕｃｋ ｐｌａｇｕｅ ｖｉｒｕｓ，ＤＰＶ）引起的鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种 急性、热性、败血性传染病…１。鸭瘟病毒又称为鸭肠
炎病毒（Ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｅｓ，ＤＥＶ），在分类上属于疱
疹病毒科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ），ｄ一疱疹病毒亚科（Ａｌｐｈａ ｈｅｒ－ ｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ），具体属的定位还不清楚。目前对鸭瘟病
毒基因结构及功能的研究还比较滞后，仅有部分毒
株的ＵＬ６，ＵＬ７基因、聚合酶基因、ＴＫ基因、ＧＨ基因 的克隆和测序见报导ｌ２，３ｊ。胸苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉ—
鸭瘟病毒TK基因及其编码蛋白的生物信息学分析
安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＡｎｈｕｉ ．Ｓｃｉ．２００７，３５（３１）：９９３５—９９３６ 责任编辑陈娟责任校对俞洁 鸭瘟病毒ＴＫ基因及其编码蛋白的生物信息学分析 宋得华 ，潘华奇２ ，黎应胜 ，杨宇泽２（１．甘肃省定西市临洮农业学校，甘肃临洮７３０５ｏｏ；２．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 ７３００７０；３．甘肃省临洮县畜牧兽医局，甘肃Ｉ临洮７３０５００） 摘要运用生物信息学方法，对鸭瘟病毒 基因的基本元件和 ＴＫ蛋白的理化性质、结构、功能进行分析。明确了 基因启动子、转录 起始位点、编码区、ＰｏｌｙＡ的位置；发现ＴＫ蛋白的二级结构以ａ螺旋为主，属于混合型蛋白，在结构和功能上与疱疹病毒胸苷激酶高度相 似。生物信息学分析结果说明，鸭瘟病毒 Ⅸ蛋白具有疱疹病毒胸苷激酶的活性，鸭瘟病毒７Ｋ基因可能为鸭瘟病毒的非必需毒力基因。 关键词鸭瘟病毒；ＴＫ基因；ＴＫ蛋白；结构；功能；生物信息学分析 中图分类号Ｑ７ 文献标识码Ａ 文章编号０５１７—６６ｌｌ（２Ｏ∞）３ｌ一０９９３５—０２ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｒｍｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｕｃｋ ｌｎａｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ ＴＫ Ｇｅｎｅ ａｎｄ ＴＫ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＯＮＧ Ｄｅ－ｈｕａ ｅｔ ａｌ（Ｌｉｎｔａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｈｏｏｌｓ ｉｎ Ｄｉｎｇｘｉ Ｃｉｔｙ ｏｆＧａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌｉｎｔａｏ，Ｇａｎｓｕ ７３０５００） ・ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｄｕｃｋ Ｐｌａｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ ＴＫ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＫ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｉｎｆｏｍ￣ｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ，ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ＰｏＩｙＡ ０ｆ ＴＫ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ；ｍａｎｙ ａ－ｈｅｌｉｘ ｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＴＫ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴＫｗａｓｍｉｘｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ ｈａｄ ａｈｉ曲ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍ— ｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｍｍｔｉｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＤＰＶ ＴＫ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｒｎｐｋｘ ｖｉｒｕｓ，ＴＫ ｇｅｎｅ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｎｏｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＤｕｃｋＰｌａｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ；ＴＫ ｇｅｎｅ；ＴＫ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ｂｉｏｉｎｆｏｍ￣ｔｉｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ 鸭病毒性肠炎俗称鸭瘟，是由鸭瘟病毒（Ｄｕｃｋ Ｐｌａｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ，ＤＰＶ）引起的一种急性、败血性传染病。该病在我国普 通发生和流行，给养鸭业带来了重大的经济损失。鸭瘟病毒 属于ａ疱疹病毒亚科，其基因组结构与其他ａ疱疹病毒相似， 为双股线性ＤＮＡ。约为１８０ ｋｂＬ 。 胸苷激酶（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ＴＫ）基因是疱疹病毒的主要 毒力基因之一，也是大多数疱疹病毒复制的非必需基因 Ｊ。 研究表明，由 基因编码的胸苷激酶是胸腺嘧啶合成补救 途径中的关键酶 Ｊ。 基因的缺失可使毒株毒力下降和潜 伏感染能力降低 Ｊ。故可以利用基因技术，敲除病毒的 基因，从而使病毒毒力下降，但不改变其免疫原性。第一次 问世的基因工程疫苗就是缺失 基因的伪狂犬病疫苗＿４Ｊ。 此外， 基因可作为自杀基因转染肿瘤细胞，导致肿瘤细胞 死亡，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的＿５Ｊ。因此研究鸭瘟病毒 ＴＫ基因的结构与功能有重要的现实意义。笔者通过生物信 息学方法对鸭瘟病毒 基因的结构及其编码蛋白进行分 析，以期为分子生物学诊断、基因疫苗研制及肿瘤治疗提供 理论依据。 １材料与方法 １．１鸭瘟病毒ＴＫ基因序列参见文献［６］，选择包含完整 基因的１ ８８４ ｂｐ为研究对象。 １．２ ＴＫ基因的结构预测 利用Ｇｅｎｓｅａｎ预测基因的开放阅 读框；利用Ｐｒｏｍｏｔｅｒ２．０和Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ２种程序预测 基因的启动子；利用Ｔｆｓｉｔｅｓｃａｎ程序预测 基因的转录因子 结合位点。 １．３ ＴＫ基因编码蛋白的理化性质、结构与功能的预测应 用ＰｒｏｔＰａｒａｍ、Ｃｏｍｐｕｔｅ ｐＩ／Ｍｗ、ＤＮＡＳｔａｒ等程序对ＤＰＶ ＴＫ基因 编码蛋白质理化性质进行分析；应用ＰＨＤｓｅｃ、ＰｒｏｔＳｃａｌｅ、ＳＯＰＭＡ 和ＤＮＡＳｔａｒ预测其编码蛋白的二级结构；应用Ｓｃａｎ Ｐｒｏｓｉｔｅ、 ＳＭＡＲＴ、ＰＰｓｅａｒｃｈ、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ分析Ｔｌ（蛋白序列中的基序和结 作者简介宋得华（１９７８一），男，甘肃临洮人，助理讲师，从事分子病 毒学研究。＊通讯作者。 收稿日期２００７－０３．２１ 构域；应用ＰＳＯＲＴ、ＴＭＨＭＭ２、０和Ｓｉｇ￣ａｐ３．０等程序对 蛋 白细胞定位、跨膜区、信号肽及核定位信号等进行预测。 ２结果与分析 ２．１ ＴＫ基因的结构 Ｇｅｎｓｃａｎ预测分析表明，第５３３ ｂ （ｂａ￣）Ｎ １ ６１１ ｂ间的１ ０７７ ｂ为一完整ＯＲＦ，而其后第１ ６２９ ｂ 到１ ６３４ ｂ为其 ｙＡ ｓｉｎ列。Ｐｒｏｍｏｔｅｒ２．０预测发现，第５００ ｂ 为转录起始位点；Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ程序预测发现，３条预测 值较高的启动子候选序列，分别在２９８～３４８ ｂ、３９０～４４０ ｂ、４１４ ～４６４ ｂ。Ｔｆｓｉｔｅｓｃａｎ软件的预测分析发现，ＴＫ基因上游存在 多种转录因子的结合序列，主要集中在１００～２００ ｂ和４００～ ４７０ ｂ ２个区域。 ２．２ ＴＫ基因编码蛋白的理化性质、结构与功能 ２．２．１ ＴＫ蛋白的理化性质。预测结果显示，ＰＫ蛋白的分子 结构式为ｃ１ ８¨Ｈ２ ８４ｏＮ４９２ ０５３３ Ｓ２１，理论ｐｌ值为５．６２，分子量为 ４．０７０ ６７×１０４，脂肪系数为８４．２５。在体外半衰期为３０ ｈ，不稳 定系数为４３．７７，属于不稳定型蛋白质。ＴＫ蛋白有１４个明显 的亲水区，依次为１～１３、３１～４７、６０～７１、７５～９２、１２０～１２９、１３０ ～１３９、１６７～１７３、１８０～２００、２２３～２３９、２４２～２５５、２６１～２７０、２８０～ ２９６、３１３～３３５、３４２～３８５肽段。依据Ｅｍｉｎｉ原则预测，ＴＫ蛋白 表面暴露区可能位于蛋白质表面的区域是３２～４２、６０～６７、７４ ～８４．１２０～１２７、１３４～１３８、１６７～１７２、１８０～１９６、２３１～２３８、２４４～ ２５６、２６２～２６９、３４５～３８５肽段。依据氨基酸残基带电情况，预 测在ＴＫ蛋白多肽链上９～４４、７９～８６、１８７～２２４、２４８～２７７、２８８ ～３０３肽段主要为正电荷区，而４５～７８、１７０～１８５、２２６～２４５、 ２７９～２８６、３０５～３３８肽段主要为负电荷区。柔韧性分析显示， ＴＫ蛋白有多个柔韧性区域，依次为３０～铝、７４～９２、１１９～１３６、 １６６～１９７、２２９～２８５、３１３～３２９肽段，提示ＴＫ蛋白可折叠成复 杂的三维结构。 ２．２．２ ＴＫ蛋白的二级结构。３种程序对ＴＫ蛋白二级结构 的预测结果基本相似，即ａ螺旋结构为４９．１６％、 折叠结构 为７．２６％、随机卷曲序列为４３．５８％。根据Ｂｕｒｋｈａｒｄ 的理论 （蛋白质或蛋白结构域分为以下几类：全ａ型蛋白，％Ｈ＞４５％ 且％Ｅ＜５％；全 型蛋白，％Ｈ＜５％且％Ｅ＞４５％；ａ—