六味地黄丸对老年小鼠造血干细胞影响的实验研究

基金项目:福建中西医结合研究院科研基金项目(No 130002905010805)作者简介:高冬(19672),女,副教授,从事中西医结合基础理论研究。

3通讯作者:宋军(19642),男,副主任医师,医学博士,从事中西医结合临床和基础理论研究。

六味地黄丸对老年小鼠造血干细胞影响的实验研究高　冬1,2,郑良朴1,2,林久茂1,2,林　薇1,2,陈旭征1,2,宋　军33,陈可冀4(11福建中医学院,福建福州350109;21福建中西医结合研究院,福建福州350109;31中国中医科学院医学实验中心,北京100091;41中国中医科学院西苑医院,北京100091) 摘要　目的:观察六味地黄丸对老年小鼠骨髓造血干细胞的数量、表型、细胞周期和集落形成能力的影响。

方法:老年昆明种小鼠随机分为生理盐水对照组及六味地黄丸高、中、低剂量组,灌胃给药7d 后,分离骨髓造血干细胞,进行细胞计数;流式细胞仪检测细胞表型和细胞周期;并采用甲基半固体培养基检测集落的形成。

结果:各组小鼠骨髓单核细胞和悬浮细胞数量以及集落产率无显著差异,但低、中剂量组Sca 21和C D34的表达提高,说明较低剂量的药物能提高骨髓中造血干细胞的数量,而且药物还具有提高细胞增殖能力的作用。

结论:六味地黄丸激活造血干细胞,通过升高骨髓中造血干细胞的数量和增殖能力提高造血机能,以达到提高免疫功能的作用。

关键词　六味地黄丸;造血干细胞;骨髓中图分类号:R28515 文献标识码:A 文章编号:100124454(2008)022*******Exper i m en t a l Study on Effect of L i uwe iD i huang P ill on HSC fro m M ouse M arrowG AO Dong 1,2,ZHE NG L iang 2pu1,2,L IN J iu 2mao1,2,L IN W ei 1,2,CHE N Xu 2zheng 1,2,S ONG Jun 3,CHE N Ke 2ji4(11Fujian College of T C M ,Fuzhou 350109,China;21Fujian Acade my of I ntergrative M edicine,Fuzhou 350109,China;31Medi 2cal Research Center,China Acade my of TC M ,Beijing 100091,China;41Xiyuan Hos p ital,China Acade my of T C M ,Beijing 100091,China )Abstract Objective:T o investigate the effect of L iu wei D ihuang Pill on the nu mber,the surface marker,cell cycle and col ony for mati on of HS C fr om mouse marr ow 1M ethods:O ld Kun m ing m ice were random ly divided int o 4gr oup s:the contr ol gr oup,l ow,m id 2dle and high dose of L iu weiD ihuang Pill gr oup 1Then we separated the HSC fr om marr ow after 7days fed with saline or L iu weiD ihuang Pill res pectively,nu merated monocyte,detected the surface marker and cell cycle of the HSC by F ACS and tested the col ony f or m ing by se m is olid media culture 1Results:Among the f our gr oup s,there was no obvi ous difference in the nu mber of MNC,sus pended cell and col ony 1The exp ressi on of Sca 21and C D34increased in the l ow and m iddle dosage gr oup,itmeant that the nu mber of HS C elevated by l ow and m iddle dosage medicine 1The ability of cell p r oliferati on was als o higher in the three dosage gr oup s 1Conclusi on:L iu wei D i 2huang Pill activates HSC by increasing the nu mber,p r oliferati on and functi on of more p ri m itive HS C 1Key words L iu wei D ihuang Pill;He mat opoietic stem cell (HSC );Marr ow 六味地黄丸是中药滋补肾阴的经典代表名方,临床疗效确切,组方严谨合理。

近年来,有关六味地黄丸的药效学研究主要集中在增强免疫功能、抗衰老、抗肿瘤及抗化疗药物毒副作用、降血糖、调节血脂、降血压等方面,而其对造血功能的影响尚未见报道。

为了探讨六味地黄丸在动员和激活小鼠骨髓造血干细胞方面的作用,我们开展了相关研究,并得到一些初步的结果,现报告如下。

1　材料与方法111　动物及分组　昆明种小鼠,20月龄,体重50～60g,雌雄不限,由福建中医学院实验动物中心提供。

随机分成生理盐水对照组(以下简称对照组)和六味地黄丸高、中、低剂量组,每组5只。

112　药物　六味地黄丸由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产,将其制备成012g/m l 的水溶液,4℃保存备用。

113　仪器及试剂11311　仪器:倒置式系统显微镜I X70(OLY MP US 公司,配备同公司的数码摄像装置),流式细胞仪F ACS Calibur (BD 公司),溶红细胞处理仪(BD 公司),CO 2培养箱(Heraus ),超净工作台(苏州净化设备公司)。

11312　试剂:I M DM 培养基(均购自Hycl one 公司),优质胎牛血清(B I O CHROM AG 公司),F I T C 标记的大鼠抗小鼠CD34、阴性对照大鼠I gG2a 2PE 和I gG2a 2F I T C (Ser otec 公司),PE 标记的大鼠抗小鼠Sca 21(B i olegend 公司)和小鼠早期造血细胞甲基半固体长期培养基MethoCultT M GF M3434(含重组小鼠白细胞介素310μg/L、重组鼠干细胞集落刺激因子50μg/L、重组白细胞介素610μg/L、重组人促红细胞生成素3K U/L、重组人胰岛素10mg/L) (Ste m Cell Tech公司);小鼠淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物医学工程研究所);Cycle TESTT M p lus DNA REAGENT KI T(BD公司)。

114　实验方法11411　给药方法:小鼠按体重灌胃给药,六味地黄丸高、中、低剂量组分别给予药物13、615、3125g/kg (相当于成人临床日用量的20、10、5倍),对照组用等量的生理盐水,每天1次。

第8d在给药后2h 内,处死小鼠进行骨髓造血干细胞的分离提取。

11412　小鼠骨髓造血干细胞的分离培养:参照Pereira〔1〕方法,将小鼠脱臼处死后置于75%酒精浸泡约5m in,无菌条件下分离出小鼠的股骨。

尽量去除骨表面附着的组织,吸取10m l I M DM培养液,用针头在股骨干骺端钻孔,从股骨一端冲洗骨髓腔,将骨髓细胞吹到培养皿内,用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液,150目铜网过滤,收集过滤的细胞悬液,用11090g/m l的淋巴细胞分离液分离单个核细胞,以1000r/m in离心5m in形成细胞沉淀,去上清液后重新制备细胞悬液,以1×106个/m l接种于含10%胎牛血清和10%马血清的I M DM培养基(含青霉素、链霉素各100U/m l)中,置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养,48h后收集非贴壁的悬浮细胞进行实验。

11413　细胞计数:用吸管反复轻柔吹打制成单细胞悬液,采用细胞计数板常规计数。

11414　细胞分裂周期的检测:吸取100μl细胞悬液(细胞浓度≥1×106个/m l),加入250μl A液,混匀后室温静置10m in,加入200μl B液,轻轻混匀,再次室温静置10m in,加入200μl C液混匀,低温(2～6℃)避光10m in后,上机待检。

利用Cell Quest软件获取数据,ModiFit分析。

11415　造血干细胞表型Sca21和CD34的检测:分别吸取100μl细胞悬液(细胞浓度≥1×106个/ m l),各加入10μl大鼠抗小鼠Sca21或CD34抗体,同时做阴性对照,室温避光孵育20m in,溶红细胞处理仪机洗后,重新悬浮,上机待检。

11416　集落形成的检测:将造血干细胞悬液以1×104个/m l接种于甲基半固体培养基中,5%CO2、37℃饱和湿度下培养7d,任选6个视野计数爆式红系集落形成单位(BF U2E),培养15d任选6个视野计数粒2巨噬细胞混合集落形成单位(CF U2M ix)。

CF U2M ix以40个以上细胞组成的细胞团为一个集落, BF U2E以50个以上细胞组成的细胞团为一个集落。

115　统计学处理　计量资料以 x±s表示,采用SPSS1010统计软件包进行组间t检验。

2　结果211　各组小鼠骨髓单核细胞总量和悬浮细胞数量比较　见表1。

各组间小鼠骨髓单核细胞总量以及非贴壁细胞数量没有显著差异,但低、中剂量给药组单核细胞总量和三个剂量悬浮细胞的数量有上升的趋势。

212　各组小鼠造血干细胞表型Sca21、CD34及数量比较　见表2及图1。

流式细胞仪检测结果表明,与对照组相比,低、中剂量药物能明显提高非贴壁细胞中Sca21+、CD34+细胞的百分率,说明这两个剂量的药物使得造血干细胞的数量升高,而高剂量药物抑制Sca21和CD34的表达,降低造血干细胞的数量。